流式细胞仪临床应用手册

流式细胞术及其临床应用ABSTRACTKey words: Flowcytometry; Immunophenotyping; Leukemia; Activated platelets; Tumor; Apoptosis.流式细胞术(flowcytometry FCM)是对单个细胞或其他生物微粒进行快速定量分析和分选的一门技术。

在分析或分选过程中，包绕在流动液体中处理过的单个细胞或微粒通过聚焦的光源，产生电信号，这些信号代表光散射、荧光等参数，以此测定出细胞或微粒的物理和化学性质，并可根据这些性质分选出高纯度的细胞亚群，以对其进一步的培养或分析。

包绕细胞的液流称为鞘液。

所用仪器称为流式细胞仪（flowcytometer FCM）。

流式细胞术综合了光学、电子学、流体力学、细胞化学、免疫学、激光技术和计算机科学等多门学科和技术，具有检测速度快、精确、测量指标多、采集数据量大、分析全面、方法灵活等特点。

一、流式细胞仪(flowcytometer FCM)1．流式细胞仪的基本结构流式细胞仪的结构一般可分四部分，见图1。

（1）流动系统流动系统是流式细胞仪的心脏，因为细胞悬液在被检测之前必须首先形成一个很细的稳流，细胞在其内部排成单列通过测量区。

细胞悬液和鞘液分别（是分别还是同时）进入流动室，鞘液的作用是使样品悬液中的粒子组成单一纵列方式通过测量区，保证每个细胞通过激光照射区的时间相等，从而得到准确的细胞荧光信息。

（2）激光系统多采用氩离子激光器。

使发射光在可见光谱范围内488nm激发。

目前市场上大多数荧光色素适用于此波长。

激光的单色性好，功率高，稳定。

（3）光学和电子系统激光束射至经流体力学聚焦的个别细胞和粒子后，光散射在各个方向(360?)发射。

有两个光散射参数需收集，前向角散射(FSC)主要用于检测细胞体积的大小。

另一为侧向散射(SSC)用于检测细胞膜，胞质，核膜等细胞内部结构及胞质内颗粒。

荧光信号是由对细胞进行染色的特异性荧光染料受到激光激发后发射的。

流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）检测血小板功能及其临床应用血小板功能的检测包括测定血小板粘附、聚集和活化的能力。

然而，在血小板相关疾病的诊断中，检测血小板功能的方法常常是有争议的。

这通常是由于方法本身的原因造成的［1］，譬如，静脉阻滞、抗凝剂选择、离心，甚至标本处理不当等因素，都可导致医源性血小板激活，影响临床诊断的价值。

这就要求建立一种灵敏、精确、快速、简便，最好可用于临床常规检测血小板功能测定方法。

关键词：血小板临床应用流式细胞术血小板功能的检测包括测定血小板粘附、聚集和活化的能力。

然而，在血小板相关疾病的诊断中，检测血小板功能的方法常常是有争议的。

这通常是由于方法本身的原因造成的［1］，譬如，静脉阻滞、抗凝剂选择、离心，甚至标本处理不当等因素，都可导致医源性血小板激活，影响临床诊断的价值。

这就要求建立一种灵敏、精确、快速、简便，最好可用于临床常规检测血小板功能测定方法。

由于血小板的活化程度可由血小板膜糖蛋白表达水平的高低来判断，近年来，文献报道利用流式细胞术，特别是全血法流式细胞术，检测血小板膜糖蛋白的表达［2］。

该技术能灵敏、特异地检测血液中活化血小板，并评价其功能。

现就全血法流式细胞术检测血小板功能的方法及临床应用现状和潜力进行综述。

一、全血法流式细胞术1.方法学：流式细胞仪能快速测定大量个体细胞的特性。

样品中欲分析的细胞预先进行荧光标记，然后由压缩氮经硅管送达标本室，再以5 000～10 000个细胞/秒的速率逐个射入光敏感区。

在适当波长的激发光作用下，被特殊染色的细胞发射出一定量的荧光脉冲讯号。

探测器收集每个细胞的荧光讯号和光散射，然后传入计算机进行分析。

传统的流式细胞术检测血小板膜糖蛋白的表达，常用的样本是经洗涤的血小板或富含血小板的血浆。

由于血小板极易活化激惹，样本经离心、洗涤等步骤，容易人为地导致体外血小板激活，影响临床诊断价值。

为此，Shatti等［2］引入了全血法流式细胞术。

流式细胞术的临床应用闫　虹(天津市人民医院检验学部,天津300121) 流式细胞术(flow cytometry,FC M)是20世纪70年代发展起来的对单细胞定量分析的一种新技术。

它借鉴了荧光标记技术、激光技术、单抗技术和计算机技术,具有极高的检测速度与统计精确性,而且从单一细胞可以测得多个参数,为生物医学与临床检验提供了全新视角和强有力手段。

目前,随着单克隆抗体技术的发展,流式细胞仪检测技术已经广泛使用在基础研究和临床实践的各个方面,在肿瘤学、血液学,免疫学、微生物学、细胞生物学-遗传学及临床检验学等诸多领域内发挥着重要作用[1]。

本文就其在临床上的应用综述如下。

1　流式细胞仪的工作原理 流式细胞仪主要由细胞流动室、激光聚焦区、检测系统、数据处理系统等4部分组成,其工作原理是将待测标本制成单细胞悬液,经染色后进入流动室,流动室充满流动的鞘液,鞘液压力与样品压力是不同的,当两者的压力差异达到一定程度时,鞘液裹挟着的样品流中细胞排成单列逐个经过激光聚焦区。

若将细胞中感兴趣的部分特异性地标上荧光染料,那么这些染料将在细胞通过激光检测区时受激光产生特定波长的荧光,通过一系列信号转换、放大、数字化处理,就可以在计算机上直观地统计染上各种荧光染料的细胞各自的百分率。

选择不同的单克隆抗体及荧光染料,可以利用流式细胞仪同时测定一个细胞上的多个不同的特征,如果对具有某种特征的细胞有兴趣,还可以利用流式的分选功能将其分选出来,以便进一步培养、研究。

2　流式细胞术在临床上的应用2.1　流式细胞术在免疫学中的应用　FC M与单克隆抗体结合,对细胞表面和细跑内抗原、癌基因蛋白及膜内受体的定量检测取得很大进展,并广泛应用于临床医学,克服了普通免疫学方法难以准确定量的不足。

在临床医学研究中,应用最为广泛的是流式细胞免疫表型分析,F M可以进行淋巴细胞亚群分析,可同时检测出一种或几种淋巴细胞表面亚群分析,将不同的淋巴细胞亚群区分开来,并计算出它们相互间的比例。

流式细胞仪在临床检验中的应用流式细胞仪是一种先进的生物医学仪器，能够对细胞进行高速、高分辨率的检测和分析。

它可以用于各种临床检验，有助于提高疾病的诊断和治疗的准确性和效果。

本文将探讨流式细胞仪在临床检验中的应用。

首先，流式细胞仪可以用于白血细胞计数和分类。

传统的白细胞计数方法需要进行显微镜检查，耗时且不准确。

而流式细胞仪通过分析细胞的体积和形状特征，可以快速、准确地计算出不同类型的白血细胞数量，并能够进一步对白细胞进行分类，如淋巴细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞等。

这些信息对于炎症、感染和肿瘤等疾病的诊断和治疗非常重要。

其次，流式细胞仪还可以用于免疫细胞表型分析。

免疫细胞表型分析是研究细胞表面分子的一种方法，可以确定细胞的类型和功能。

流式细胞仪通过与特定的抗体结合，可以测量不同细胞表面的抗原表达水平，从而确定细胞的免疫表型。

这对于免疫系统相关疾病的诊断和治疗具有重要意义，如白血病、自身免疫疾病等。

此外，流式细胞仪还可以用于检测细胞内的信号分子和功能，可以评估细胞的活力和功能状态。

流式细胞仪在肿瘤学研究中也有广泛的应用。

它可以检测和分离肿瘤细胞，通过测量肿瘤细胞的大小、形状和表面标记物的表达水平，可以评估肿瘤的类型、分级和预后。

此外，流式细胞仪还可以用于检测循环肿瘤细胞（CTC）和肿瘤间质细胞（TIC），这些细胞在肿瘤的转移和预后中起到重要的作用。

除了疾病诊断和治疗外，流式细胞仪还可以应用于药物研发和治疗监测。

通过对细胞的特征和功能进行分析，可以评估药物对细胞的影响和效果，从而指导药物的选择和使用。

此外，流式细胞仪还可以通过检测细胞的凋亡、增殖和细胞周期等指标，评估治疗的疗效和耐药性。

在临床检验中，流式细胞仪的应用广泛且日益重要。

它具有高通量、高分辨率和多参数分析的优势，可以提供丰富的静态和动态细胞信息，有助于提高疾病的早期诊断和治疗效果评估的准确性和效率。

随着流式细胞仪技术的不断发展和优化，相信它将在临床检验中发挥越来越大的作用，为人类健康事业作出更大的贡献。

一、诊断性指标如图1所示，图（左）白血病细胞成为一个单一的群体，很难区分原始或病态的白血病细胞和成熟的细胞。

但是通过CD45和（SSC）设门法之后（图右），看到图（左）无法区分细胞被分成了五群。

在这五群中，成熟细胞CD45表达的荧光比较强。

A门里是淋巴细胞，B门里是单核细胞，C门里就是粒细胞群，D门里是原始细胞，一般CD45表达较弱。

一些细胞碎片、红细胞和转移来的瘤细胞，由于不表达CD45，可能位于D门、D门偏下或者E门的位置。

CD45结合侧向散射光之后能把白血病细胞找出来，减少了其它细胞的干扰。

对D门里的白血病细胞做进一步的分型，就能准确看到白血病细胞群免疫分型的表达情况。

图13.白血病的特异性标志免疫表型分析主要是根据细胞的特异表面标志，把白细胞分成T细胞、B细胞和原始细胞。

T淋巴细胞白血病一般表达的分化抗原有胞浆内的cCD3、抗TCRαβ、抗TCRγδ、CD2、CD5、CD8、CD10和CD7；B淋巴细胞白血病一般表达的分化抗原有胞浆内的cCD79a、CD22、CD19 、CD10和CD20；髓系白血病一般表达的分化抗原有胞浆内的cMPO、CD117、CD13、CD33、CD14、CD15和CD64；NK淋巴细胞白血病一般表达的分化抗原有CD16、CD56和CD57；红白血病一般表达的分化抗原有GlyA和CD36；巨核细胞白血病一般表达的分化抗原有CD41、CD42和CD61；一系列非特异标志在不同的白血病中可能都有表达，尤其是表达在早期的造血干组细胞上，一般表达的分化抗原有CD34和HLA-DR。

其中，对T淋巴细胞白血病来讲比较特异的是胞浆内的CD3，当胞浆内CD3出现阳性的时候，高度怀疑是T淋巴细胞白血病。

对于B淋巴细胞白血病来讲，胞浆内的CD79a和CD19是比较特异的，cCD79a最具特异性。

cCD3和cCD79a分别表达于早期T细胞和B细胞。

cMPO是髓系特异标志。

如图2所示为B-ALL的表达图。

仪器操作手册本手册根据标准配置的CyFlow® Space编写而成，具体内容根据实际配置可能有所偏差，手册内容应以实际配置为准。

CyFlow Space 仪器操作手册内容CyFlow Space介绍 (4)典型分析步骤 (5)基本操作 (6)启动CyFlow Space (6)多激光测量 (7)开始检测 (8)关闭CyFlow (9)液量绝对计数（定量）----概述 (10)如何执行液量绝对计数 (12)光路几何示意图 (13)光路图标准设置----参数 (14)仪器设置 (15)参数设置对话框：脉冲信号高度、面积和宽度 (16)触发 (17)光电倍增管（PMT）电压，增益和对数放大 (18)样本进样速度 (19)阈值：L-L（低值）和U-L（高值） (20)附录 (21)安装要求 (21)仪器安装--概要 (22)仪器安装--顺序 (23)流动室精细校准 (24)流动室 (25)维护和服务 (26)运输和储存 (26)污染物处理 (26)安全使用激光器的说明 (27)CyFlow Space技术规格表 (28)Partec推荐使用体外诊断试剂IVDPartec CyFlow Space型流式细胞仪符合欧洲98/97/EC标准，已经取得欧洲CE认证。

○C2007 Partec GmbHOtto-Hahn-Str.32D-48161GermanyCyFlow® Space介绍Partec CyFlow® Space是什么？CyFlow®Space有哪些用途？本手册涉及内容？其他要用到的说明书？操作CyFlow®Space前应该具备哪些知识？Partec CyFlow®Space是一台配臵全面的桌面式/便携式流式细胞仪（FCM）。

它的特色即设计理念是可以配备3个激光光源，和1至9个光学通道（参数），通过简单地更换光学滤片或镜片可以满足任何实验的需求。

流式细胞仪使用方法说明书1. 概述流式细胞仪是一种用于细胞分析和排序的先进仪器。

本方法说明书旨在向用户介绍如何正确操作流式细胞仪以及最佳的使用方法。

请用户在使用前仔细阅读本说明书并遵循相关的安全操作规程。

2. 仪器组成流式细胞仪主要由以下几个组成部分构成：- 流体传送系统：用于将样本引入仪器并排除废弃物。

- 激光系统：产生激光束以激发样本中的荧光染料。

- 光学系统：收集样本产生的荧光信号并进行检测。

- 数据分析系统：用于解析和分析收集到的数据。

3. 使用准备在进行流式细胞仪实验之前，请确保以下几个步骤已经完成：- 仪器校准：根据仪器的使用手册进行仪器校准，确保仪器工作在最佳状态。

- 样本准备：按照实验需求，对待测样本进行合适的处理，例如细胞培养、染色等。

- 试剂准备：准备好所需的荧光染料、缓冲液等试剂。

4. 仪器操作以下是流式细胞仪的一般操作步骤：- 打开仪器电源，并等待仪器启动完成。

- 将样本装入合适的样本管，并在样本管中加入适量的荧光染料或其他试剂。

- 将样本管放入仪器中的样本槽，并调整流速和其他参数。

- 启动激光系统，并调整激光强度和波长以适应实验需求。

- 开始数据采集，根据仪器界面指示收集所需数据。

- 数据分析：根据实验需要，使用相应的数据分析软件对采集到的数据进行解析和处理。

5. 安全注意事项在使用流式细胞仪时，务必注意以下安全事项：- 佩戴个人防护装备，包括实验手套和护目镜。

- 遵循实验室的生物安全规程，确保样本处理符合相关的安全要求。

- 避免直接暴露于激光束下，以免损伤眼睛和皮肤。

- 在清洁仪器时使用合适的溶剂，并按照仪器清洁的标准程序进行操作。

6. 故障排除在实际操作中，有时可能会遇到仪器故障或其他问题。

以下是一些常见问题及其排除方法：- 仪器无法启动: 检查电源连接是否正常，重启仪器。

- 数据质量差: 检查样本制备和染色的质量，调整参数和仪器校准。

- 清洗困难: 检查是否有阻塞，按照清洁程序进行清洗。

流式细胞术的工作原理及其临床应用一、本文概述流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）是一种在液流中快速检测和分析单个细胞的技术，广泛应用于生物学、医学和生物技术等众多领域。

本文将对流式细胞术的工作原理进行详细介绍，并探讨其在临床诊断和治疗中的广泛应用。

我们将概述流式细胞术的基本原理和技术特点，包括细胞染色、荧光信号检测和数据分析等方面。

然后，我们将深入探讨流式细胞术在免疫学、血液学、肿瘤学等领域中的临床应用，以及其在疾病诊断、预后评估、疗效监测等方面的重要作用。

我们将对流式细胞术的未来发展趋势进行展望，以期为读者提供全面而深入的了解。

二、流式细胞术的工作原理流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）是一种在液流中快速定量分析和分选细胞的技术。

其工作原理主要基于流式细胞仪的精确设计和操作。

待检测的细胞经过预处理，如荧光标记、固定和破膜等，使其带有可检测的荧光染料或抗体。

这些细胞随后被导入到流式细胞仪中，通过喷嘴形成单细胞悬液，并以一定的流速通过检测区域。

在检测区域，细胞经过激光束的照射，激发出荧光信号。

这些信号被光电倍增管等光电转换器接收，并转化为电信号。

电信号经过放大、数字化处理后，由计算机系统进行记录和分析。

流式细胞仪可以同时检测多个参数，如细胞大小、内部结构、DNA 含量、蛋白质表达等。

这些参数的分析主要基于荧光信号的强度和波长，以及细胞的电学特性，如电阻抗。

流式细胞术还可以结合分选技术，将特定类型的细胞从混合细胞群体中分离出来。

这主要通过在流式细胞仪的出口处设置电磁场或静电场，对带有特定荧光信号的细胞进行偏转，从而实现细胞的分选。

流式细胞术的工作原理是将单个细胞在液流中快速通过激光束，通过检测和分析荧光信号，实现细胞的定量和定性分析，以及细胞的分选。

这种技术具有高灵敏度、高分辨率和高通量的特点，广泛应用于生物医学研究的各个领域。

三、流式细胞术的临床应用流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）作为一种高度灵敏且多功能的细胞分析技术，在临床医学领域的应用日益广泛。

现代医学仪器与应用2008年第20卷第1期M o dei ca l Eq ui pm ent a nd A pp l i ca t i on F e b．2008．V ol20．N o．1流式细胞仪的原理和临床应用沈二霞流式细胞术(f l ow cyt om e t r y，FC M)是利用流式细胞仪对细胞等生物粒子的理、化及生物特性进行分析的方法。

它是上个世纪70年代初发展起来的一项高新技术。

80年代初研制出了性能稳定良好的流式细胞仪，并开始被应用到临床医学研究及疾病的诊断和监测。

流式细胞仪具有检测速度快、测量指标多、采集数据量大、分析全面、方法灵活等特点。

近年来，随着流式细胞仪性能的不断改进和测定方法与技术的快速发展，流式细胞术成为常规实验诊断的重要手段，一些检验项目已成为临床疾病诊断、治疗方案选择、预后判断等不可或缺的内容…。

1流式细胞仪的构成及工作原理流式细胞仪主要由液流系统、光学系统、电子系统、分析系统和细胞分选系统五个部分组成。

将待测细胞制成单细胞悬液。

经荧光染料染色后加入样品管，在一定气体压力下待测样品被压人流动室。

待测细胞在鞘液的包裹下单行排列，依次通过检测区，被荧光染料染色的细胞受到强烈的激光照射后，产生散射光和荧光信号。

这两种信号同时被前向光电二极管和90o方向的光电倍增管(PM T)接收。

散射光分为前向角散射(for w ard sc at t er，FSC)和侧向角散射(si desc at t e r，SSC)。

前者主要反映被测细胞的大小，后者主要反映被测细胞的胞质、胞膜、核膜的折射等，以及细胞内颗粒的性状。

光信号通过波长选择通透性滤片后，经光电倍增管接收后转为电信号，再经数／模转换器转换为可被计算机识别的数学信号。

以一维直方图或二维点阵图及数据表或三维图形显示出来f l,21。

流式细胞仪还可以对分析中的目的细胞进行分选，它是通过分离含有单细胞的液滴而实现的。

流动室的喷嘴上安装有超高频的压电晶体。

目录第一部分流式细胞术简介 (1)第二部分流式项目检测列表 (4)第三部分流式细胞术在各类疾病中的应用 (7)第一章感染性疾病 (7)第二章肿瘤、细胞治疗应用 (9)第三章血液系统疾病 (14)第四章器官移植检测 (15)第五章风湿免疫性疾病 (16)第六章呼吸系统疾病 (18)第七章消化系统疾病 (20)第八章泌尿系统疾病 (21)第九章心脑血管疾病 (22)第十章妇产科及儿科相关疾病 (24)第十一章内分泌患者免疫功能检测 (26)第十二章皮肤科疾病 (27)第一部分流式细胞术简介1 流式细胞术定义流式细胞仪是集激光技术、电子物理技术、光电测量技术、计算机技术以及细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体的新型高科技仪器，为生物医学与临床检验学发展提供了最强有力的工具。

流式细胞分析技术(flow cytometry，FCM)又称流式细胞术，是20世纪70 年代发展起来的一种快速、准确、客观的检测技术，它能够同时检测快速直线流动状态中的单个细胞或微球的多项物理及生物学特性--在极短的时间内高速分析上万个甚至是几十万个细胞，并能同时从一个细胞中测得多个参数，对其加以定性定量分析，还可以对特定群体加以分选。

目前，流式细胞术已经广泛用于临床应用与基础研究，在免疫学、遗传学、血液学、肿瘤学、细胞生物学、细胞遗传学、生物化学等医学与生命科学所有领域内发挥着重要的作用。

2 流式细胞仪工作原理制备成单细胞悬液的标本或单个微粒在上样前进行荧光染色。

流式细胞仪检测到上样管后，产生一定的气体压力将待测样本压入流动池。

同时鞘液（不含细胞或微粒的缓冲液）在仪器产生的高压作用下从鞘液管喷出，鞘液管入口方向与样本流形成一定的角度，形成一个圆形的鞘液流，包围着细胞或微粒高速流动，使待测细胞在鞘液的包裹下单行排列，逐个地通过流式细胞仪的激光聚焦区（流动池），从而被检测到，并发出散射光及荧光等多种光学信号。

光学信号通过光电信号转换器及电子信号处理系统采集及分析后，最后以图形的形式将数据结果显示在电脑屏幕上。