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流式细胞仪上机操作培训手册一、样本处理以PBMC表面抗原的流式检测步骤为例1)取样。
取新鲜提取或冻存后复苏的PBMC；2)编号。
根据实验设计，标记好流式管，如每份PBMC设两管：a)1号管：相应同型对照；b)2号管：CD3,CD4,CD8,CD56四标管；3)加样。
用移液器取100ul细胞/管（约1×106个细胞/管），分别加到已经标记好的流式管底部；4)洗涤。
加入1ml PBS/管，涡旋1600rpm/min，离心6min；5)染色。
弃上清，加入100 μl PBS/管涡旋混匀细胞，并根据实验设计，向各流式管中加入相应的荧光素标记抗体，混匀，室温避光孵育30min（操作尽量保持在避光条件下进行。
）6)洗涤。
加入1ml PBS/管，涡旋1600rpm/min，离心6min；7)重悬。
弃上清，加入0.5ml PBS/管，混匀，上机检测(可选择BD FACSCantoII或BD Accuri C6)。
（注：若不能及时上机，应加入4%多聚甲醛固定，并于4℃避光保存。
）8）试验结果分析。
（注：实验过程中如果进行多色标记，需要调节荧光补偿）。
参考值：二、上机检测BD FACSCanto II简要操作流程启动流式细胞仪1 打开流式细胞仪电源2 启动计算机，打开软件登录3 确保软件连接到流式细胞仪必要时，点击Cytometer > connect检查液体水平1 启动流式细胞仪后，检查液体水平低液面水平或者废液桶满都用红色指示。
2 如果液流车未自动开启，选择Cytometer > Fluidics Startup。
3 当液流启动完成后，点击OK关闭对话框。
检查气泡1 在检查完液体水平后，开启流动室门，检查流动室中是否有气泡。
2 如果没有看到气泡，进行第5步。
如果看到气泡，点击Cytometer > CleaningModes >De-gas Flow Cell.3 当完成信息出现后，点击OK。
流式细胞仪培训手册序论学习仪器的最好方法是操作仪器,然而在理解原理的基础上进行仪器操作无疑会起到事半功倍的作用。
本书介绍了流式细胞仪的基本知识,并从不同角度详尽阐述了各种台式机(FACScanTM , FACSortTM , FACSCaliburTM ,和 BD LSR与大型机(FACS VantageTM, FACSVantageTM SE, 和 FACStarPLUSTM 之间的不同。
阅读本书有助于增强读者操作仪器的动手能力和经验。
目录第 1章综述…………………………………………………………………… 4 第 2章液流系统………………………………………………………………第 3章散射光信号及荧光信号………………………………………………3.1 散射光信号………………………………………………………3.2 荧光信号…………………………………………………………3.3 荧光补偿第 4章光电系统………………………………………………………………4.1 光平台……………………………………………………………4.2 光学滤片………………………………………………………4.3 信号探测器……………………………………………………4.4 阈值………………………………………………………………第 5章数据分析………………………………………………………………5.1 数据采集及显示…………………………………………………5.2 设门………………………………………………………………5.3 细胞亚群的数据分析…………………………………………5.4 流式细胞仪其它应用的数据分析………………………………5.5 CellQuest软件使用……………………………………………5.6 MutiSet 软件使用………………………………………………5.7 Simultest 软件使用……………………………………………5.8 B27软件使用…………………………………………………5.9 WinMDI软件使用…………………………………………5.10 FACSPress软件使用…………………………………………5.11 System II软件使用…………………………………………5.12 MultiCycle软件使用…………………………………………5.13 Modfit使件使用……………………………………………第 6章流式基本检测项目6.1淋巴细胞亚群检测 (双色、三色、四色,三种软件分析6.2 B27的检测………………………………………………………6.3 血小板抗体检测………………………………………………6.4 网织血小板及红细胞分析……………………………………6.5 干细胞检测……………………………………………………6.6 DNA倍体分析……………………………………………………6.7 凋亡检测…………………………………………………………第 7章分选6.1 分选………………………………………………………………第 8章激光器及光路校正……………………………………………………7.1 激光器的工作原理………………………………………………7.2 光路校正…………………………………………………………第 9章答案………………………………………………………………第一章综述流式细胞术是一项快速检测分析单个粒子多物理特性的高技术,通常指细胞通过激光束时在液流中的特性,即粒子的大小,密度或是内部结构,以及相对的荧光强度。
Invitrogen Attune NxT流式细胞仪应用手册成就稀有细胞超灵敏高通量分析梦想实现全血样本无需裂解无需洗涤夙愿21人全血样本免洗免裂解白细胞分析(三种方法)...............................................................................................2人全血6色T 细胞无需补偿且免洗免裂解检测................................................................................................6人全血10色免疫表型分析.....................................................................................................................10人全血13色免疫表型分析.....................................................................................................................13人全血吞噬细胞检测...........................................................................................................................17小鼠脾细胞10色免疫表型分析...............................................................................................................22小鼠调节性T 细胞检测........................................................................................................................25藻类存活率分析...........................................................................................................................28使用Attune NxT 流式细胞仪进行荧光蛋白检测...........................................................................................30hPSC 来源的心肌细胞分化过程中转录因子表达的流式细胞分析......................................................................37利用Attune NxT 流式细胞仪检测全血中的血小板............................................................................................42利用Attune NxT 流式细胞仪设计T 细胞基础配色方案......................................................................51利用Attune NxT 流式细胞仪快速准确地进行植物细胞核DNA 含量分析................................................................59使用 ModFit LT 软件分析 Attune NxT FCS 数据文件的操作指南 . (66)利用Invitrogen Attune NxT 流式细胞仪对单细胞生物中的中性脂进行检测 (74)利用Attune NxT 流式细胞仪进行精确浓度测定的推荐方法 (78)Attune NxT 自动进样器实现流式高通量自动化检测：在所有板孔和微孔板之间保持结果的一致性 (80)使用FlowJo 软件分析Invitrogen Attune NxT FCS 数据文件的操作指南 (88)使用FCS Express 6软件分析Attune NxT FCS 数据文件 (96)目录2人全血免洗免裂解白细胞分析(三种方法)无需洗涤/裂解检测人全血中的白细胞简介从人的全血中分离并检测白细胞的传统方法十分耗时，且通常需要大量处理和富集方可进行分析。
FACSAri aⅡ流式细胞仪一、开机准备（一）准备液路1.将流式细胞仪的上盖打开；2.开启计算机，等待所有程序载入。
3.开主机电源Mainpower（右图），从电脑桌面上双击打开FACSDiva软件，输入密码BDIS。
打开激光开关laser power（根据实验需要进行选择）；开启实验所需激光器电源。
4.确认液流车中各种液体的液面水平（鞘液、废液、去离子水、漂白剂、乙醇），倒空废液或加满其他液体（下图）。
5.从软件的Cytometer菜单上选择Fluidic Startup(射流启动)，点击OK确认。
将出现如下窗口：6．将液路和气路管道从酒精桶断开，连接到鞘液桶；完成后点Done；7．将Closed-loop 喷嘴（闭环喷嘴）插入流动室；完成后点Done；会出现右侧窗口，提示液流开启进行中；8．达到100%，移去Closed-loop喷嘴，完成后点Done；9．按照实验要求，插入直径合适的喷嘴（喷嘴直径应该是分选颗粒直径的3-6倍）；10．然后点OK，完成整个过程；11．从菜单上选择Sort(分类)sort setup,确认setup模式与喷嘴大小匹配。
（二）开液流1．打开液流窗口的液流；♦点击软件界面上（如下图）的按钮打开分选液流窗口（如下图）♦点击分选液流窗口的按钮(stream 的前面按钮)，开启液流2．打开分选仓前的门，检查液流。
液流应为一条细线落入废液槽正中(可通过调整红色标志的键)；（如果液流不稳，检查流动室中是否有气泡，将液流关闭，10秒钟后再开，排除气泡。
）3．关上分选仓前的门。
（三）设定液流断点1.调整液流震幅（Ampl），使断滴位于窗口上方1/3处。
（Ampl不要超过70，如果超过，检查流动室是否有气泡；确认鞘液压力和震动频率是否合适）；2.确认卫星液滴与大液滴融合，应该在断滴的6滴之内融合（红色箭头数起，左图的左侧合格，右侧不合格），如果没有融合，重新安装喷嘴。
二、建立实验模板1.在软件界面左侧Browser面板下，依次点击New Folder、Experiment、Specimen （均可重命名），单击Specimen左侧“+”符号，显示下方的Tube，点击左侧灰色指示箭头，使之变成绿色（当前指示）。
仪器操作手册本手册根据标准配置的CyFlow® Space编写而成，具体内容根据实际配置可能有所偏差，手册内容应以实际配置为准。
CyFlow Space 仪器操作手册内容CyFlow Space介绍 (4)典型分析步骤 (5)基本操作 (6)启动CyFlow Space (6)多激光测量 (7)开始检测 (8)关闭CyFlow (9)液量绝对计数（定量）----概述 (10)如何执行液量绝对计数 (12)光路几何示意图 (13)光路图标准设置----参数 (14)仪器设置 (15)参数设置对话框：脉冲信号高度、面积和宽度 (16)触发 (17)光电倍增管（PMT）电压，增益和对数放大 (18)样本进样速度 (19)阈值：L-L（低值）和U-L（高值） (20)附录 (21)安装要求 (21)仪器安装--概要 (22)仪器安装--顺序 (23)流动室精细校准 (24)流动室 (25)维护和服务 (26)运输和储存 (26)污染物处理 (26)安全使用激光器的说明 (27)CyFlow Space技术规格表 (28)Partec推荐使用体外诊断试剂IVDPartec CyFlow Space型流式细胞仪符合欧洲98/97/EC标准，已经取得欧洲CE认证。
○C2007 Partec GmbHOtto-Hahn-Str.32D-48161GermanyCyFlow® Space介绍Partec CyFlow® Space是什么？CyFlow®Space有哪些用途？本手册涉及内容？其他要用到的说明书？操作CyFlow®Space前应该具备哪些知识？Partec CyFlow®Space是一台配臵全面的桌面式/便携式流式细胞仪（FCM）。
它的特色即设计理念是可以配备3个激光光源，和1至9个光学通道（参数），通过简单地更换光学滤片或镜片可以满足任何实验的需求。
BeamCyte 流式细胞仪快速操作指南流程开机首先打开电脑，电脑正常开机后打开仪器后面板电源键启动仪器，在配套电脑上打开Cytosys 软件，待仪器初始化完成，软件状态栏将显示“就绪”，即可进行下一步操作。
QC 测试1 制备BeamCyte QC微球悬液。
2 点击主菜单“系统维护”→“QC测试”，根据软件提示完成QC测试。
3 QC测试所有项目结果均为 Pass 时，可进行下一步操作。
新建实验1 点击主菜单“文件”→“新建”→“新建实验”，建立新的实验文件。
2 用以下多种方式新建实验样本或标本：在“实验管理”面板，右键点击“实验文件名”，在本实验文件下新建标本。
右键点击“标本”，在选中的标本下新建样本。
如果已有模板文件，点击主菜单“文件”→“新建”→“从模板新建”，将新建有相同模板的标本或样本。
3 点击主菜单“文件”→“保存”，保存选中的实验文件或其他文件。
注：如果已导出fcs文件，文件名会变色。
荧光补偿1.自动荧光补偿准备各个荧光参数的单染样本和未染色对照样本。
点击菜单“开始”→“自动补偿”，弹出“新建自动补偿”对话框，进行自动补偿条件设置。
选择需要使用的样本，并点击“确定”。
软件将自动新建“补偿标本”。
逐管采集单染样本，软件自动计算荧光补偿。
将自动计算的荧光补偿右键导出保存。
2.手动荧光补偿两种方式手动调节荧光补偿：需要补偿的参数两两做密度图，点击快速补偿按钮，拖动快速补偿滚动条，使某一荧光单阳性细胞与阴性细胞在另一荧光通道的荧光强度相等。
逐个调节直到所有参数之间的补偿完成。
补偿前补偿后补偿调节的过程也可以通过点击菜单“开始”→“当前补偿”调出当前样本的补偿矩阵，不断调整溢出矩阵中相应单元格的补偿系数来实现。
采集样本1 在“实验管理”面板，双击试管，使之成为当前试管（蓝色箭头指示）。
2 设置采集条件：设置采集使用的“参数”，，包括选择采集通道并定义别名和电压，初次实验的电压需用调试模式调整。
BD FACSCalibur流式细胞仪一、BD FACSCalibur基本结构1.1仪器本体：1. 电源开关：在BD FACSCalibur仪器右侧下方，先启动仪器本体，再打开计算机。
2. 光学系统：BD FACSCalibur 基本配有一支波长488 nm 的氩离子雷射以BD FACSCalibur 基本型为例➢FSC Diode 只收488 nm波长散射光➢SSC PMT 只收488 nm波长散射光➢FL1 PMT 荧光光谱峰值落在绿色范围（波长515-545 nm）➢FL2 PMT 荧光光谱峰值落在橙红色范围（波长564-606 nm）➢FL3 PMT 荧光光谱峰值落在深红色范围（波长 >650 nm）3. 仪器面板：仪器前方面板的右下方有三个流速控制键、及三个功能控制键。
流速控制：LO：样品流速：12 l /minMED：样品流速：35 l /minHI: 样品流速：60 l /min功能控制：•RUN：此时上样管加压，使细胞悬液从进样针进入流动室。
（正常显示绿色；黄色时表示仪器不正常，请检查是否失压。
）•STANDBY：无样品或暖机时之正常位置，此时鞘液停止流动，雷射功率自动降低。
•PRIME：去除流动室中的气泡，流动室施以反向压力，将液流从流动室冲入样品管，持续一定时间后，以鞘液回注满流动室。
PRIME 结束，仪器恢复STANDBY状态。
4. 储液箱抽屉：在主机左下方之储液箱抽屉。
可向前拉开，内含鞘流液筒、废液筒、鞘液过滤器Sheath Filter，及空气滤网 Air filter。
请注意气路减压阀VENT TOGGLE之位置。
•鞘液筒：位于抽屉左侧，容积4升。
装八分满鞘液筒，仪器可以运行大约 3小时。
筒上装有液面感应器，鞘液用完时，仪器软件上会有显示。
鞘液筒盖上有金属环扣，保证鞘液筒密闭。
•废液筒：位于抽屉右侧，容积4升。
筒上装有液面感应器，废液盛满时，仪器软件上会有显示。
目 录第一章流式细胞仪简介 (1)1.1 流式细胞术发展史 (1)1.2 流式细胞仪构造和工作原理 (2)1.2.1 概述 (2)1.2.2 流式细胞仪构造 (2)1.3 流式细胞仪的主要技术指标 (10)第二章 FACSCalibur 的日常操作 (12)2.1 FACSCalibur系统 (12)2.2 FACSCalibur开机程序 (15)2.3 FACSCalibur关机程序 (16)2.4 FACSCalibur的维护与保养 (17)2.4.1 FACSCalibur的每月维护 (17)2.4.2 FACSCalibur的定期维护 (18)2.5 常见故障排除 (20)第三章 FACSComp软件 (22)3.1 FACSComp简介 (22)3.1.1 FACSComp运行条件 (22)3.1.2 FACSComp的文件类型 (23)3.2 FACSComp的功能 (24)3.2.1 光电倍增管（PMT）电压的调节 (24)3.2.2 荧光补偿的调节 (24)3.2.3 灵敏度的测试 (24)3.2.4 时间延迟的校准（对于双激光，配有FL4 PMT） (25)3.2.5 HLA-B27的校准 (25)3.2.6 LeucoCOUNT (25)3.2.7 优化 (25)3.3 FACSComp的运行 (25)3.3.1 CaliBRITE Beads的准备 (25)3.3.2 软件环境的设置 (26)3.3.3 Beads的检测 (26)3.3.4 Optimization (28)第四章 FACStation 数据管理系统 (30)4.1 FACStation 数据管理系统组成 (30)4.2 FACStation文件组成 (31)4.2.1 如何建立文件夹 (31)4.2.2 FACStation文件的类型 (31)4.2.3 如何管理文件 (32)4.3 实用的Macintosh OS X功能 (34)4.3.1 菜单栏 (35)4.3.2 Dock (37)4.3.3 查找窗口 (37)4.3.4 键盘快捷键 (38)4.4 如何设置模版 (39)4.5 实验练习：如何将ModFit LT的别名添加到Dock菜单下 (40)4.6 可选性存储装置 (40)4.6.1 可选性存储装置的基本工作原则 (40)4.6.2 光驱的维护 (41)4.6.3 光盘的维护 (41)第五章 CellQuest Pro软件 (42)5.1 概述 (42)5.1.1 获取(Acquisition） (42)5.1.2 分析(Analysis) (42)5.1.3 从获取到分析(Acquisition Analysis) (42)5.2 工具栏 (42)5.3 CellQuest Pro 的文件 (43)5.3.1 FCS数据文件 (43)5.3.2 实验文件 (44)5.3.3 仪器条件文件 (44)5.3.4 统计文件 (44)5.4 CellQuest Pro 的仪器控制 (44)5.4.1 探测器 (45)5.4.2 放大器 (45)5.4.3 阈值 (46)5.4.4 补偿 (46)5.6.1 质控－运行FACSComp (48)5.6.2 优化 (50)5.6.3 调出储存的由FACSComp 生成的仪器条件 (52)5.6.4 调节FSC/SSC探测器（电压）及FSC阈值 (53)5.6.5 设置淋巴细胞Region (53)5.6.6 调节FL1、FL2、FL3的探测器（电压） (53)5.6.7 调节荧光补偿 (55)5.7 实验练习：3色/4色预获取 (55)5.7.1 设置Acquisition & Storage 窗口 (56)5.7.2 设置Parameter Description (57)5.7.3 编辑Reagent Panel (58)5.8 实验练习：数据获取 (59)5.9 储存、恢复仪器设置 (60)5.9.1 储存仪器设置 (60)5.9.2 恢复仪器设置 (60)5.10 储存实验模板文件 (60)5.11 练习：数据分析 (60)5.11.1 画Region (61)5.11.2 限定象限marker (61)5.11.3 分析四色 (63)5.11.4 批分析其余数据 (63)5.11.5 分析数据 (64)5.11.6 将分析文件以模板形式保存 (64)5.11.7 创建文具簿（stationery pad） (64)5.11.8 将统计改为电子表格 (65)5.12 Regions 和Gating（画门） (65)5.12.1 设置Region (65)5.12.2 改变Region (65)5.12.3 用Region 统计来分析数据 (66)5.12.4 门 (66)5.12.5 多色门 (66)5.12.6 组合门 (67)5.12.7 在直方图上使用组合门分析 (68)收集系统6.1.2 分选模式 (70)6.2 分选窗口 (71)6.2.1 Sort Setup (71)6.2.2 Sort Counters (72)6.3 准备收集管 (72)6.4 分选 (73)6.4.1 清洗分选管线 (73)6.4.2 准备 (73)6.4.3 收集分选前数据 (74)6.4.4 分选条件设置 (74)6.4.5 分选目的细胞 (74)6.4.6 清洗分选管路 (75)6.4.7 浓缩样本 (76)6.5 检验分选纯度 (76)6.6 分选问题讨论 (77)6.7 FACSCalibur无菌分选 (79)6.8 分选细胞浓缩系统 (80)6.8.1 系统简介 (80)6.8.2 细胞培养基嵌入物和滤膜的制备 (81)6.8.3 确定气压参数 (82)6.8.4 如何用细胞浓缩系统进行分选 (82)6.8.5 分选浓缩细胞 (84)6.8.6 从分选管路中回收细胞 (84)6.8.7 回收细胞做进一步分析 (85)6.8.8 清洗分选管路 (85)6.8.9 清洗浓缩器 (85)第七章 DNA分析 (87)7.1 概述 (87)7.2 细胞周期 (87)7.3 DNA检测的常用术语 (87)7.3.1 Coefficient of Variation（CV）：变异系数 (87)7.4.1 分辨率（CV） (88)7.4.2 线性度 (88)7.4.3 碎片 (88)7.4.4 细胞双粘体 (89)7.5 DNA质量控制（DNA QC Particles） (89)7.5.1 样本制备 (89)7.5.2 上机检测 (89)7.5.3 常见错误排除 (90)7.6 用CellQuest Pro软件获取DNA 数据 (91)7.6.1 样本制备 (91)7.6.2 用CellQuest Pro软件上机获取数据 (92)7.6.3 质量控制 (95)7.7 用ModFit 软件分析DNA数据 (95)7.7.1 运用ModFit 进行自动分析 (96)7.7.2 运用ModFit 进行手动分析 (96)7.7.3 运用ModFIT进行同步化分析 (98)7.7.4 运用ModFIT 进行增殖分析 (98)第八章 HLA-B27分析 (99)8.1 检测HLA-B27的意义 (99)8.2 HLA-B27的检测方法 (99)8.2.1 传统方法 (99)8.2.2 流式细胞术 (100)8.2.3 试剂盒介绍 (100)8.2.4 实验原理 (100)8.2.5 样本的收集和准备 (101)8.2.6 流式检测 (102)8.3 质量控制 (110)附录1：组织相容性抗原和疾病的关系 (111)附录2：强直性脊柱炎——一个常见但易被忽略的疾病 (112)第九章 MultiSET软件 (113)9.1 简介 (113)软件内容9.4.1 MultiSET界面功能分区 (116)9.4.2 MultiSET命令菜单 (116)9.4.3 MultiSET实验报告 (117)9.4.4 MultiSET运行程序 (117)9.5 利用Multiset软件的Tools和Preferences (126)9.6 Control Panels (绝对计数质控) (128)9.7 MultiSET画门及Attractor方案 (128)9.8 注意事项及常见问题处理 (129)第十章练习题 (135)10.1 补偿 (135)10.2 流式简介 (135)10.3 CellQuest 获取与分析 (136)10.4 分选 (139)第一章流式细胞仪简介1.1 流式细胞术发展史纵观历史，几乎没有哪一门科学技术象流式细胞术这样凝结了众多不同学术背景、不同科研领域的科学家的心血。
