基因工程中基因高效表达研究是指外源基因在某种细胞中的表达活动
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2020-2021学年高二下学期第三单元达标检测卷生 物(B )注意事项:1.答题前,先将自己的姓名、准考证号填写在试题卷和答题卡上,并将准考证号条形码粘贴在答题卡上的指定位置。
2.选择题的作答:每小题选出答案后,用2B 铅笔把答题卡上对应题目的答案标号涂黑,写在试题卷、草稿纸和答题卡上的非答题区域均无效。
3.非选择题的作答:用签字笔直接答在答题卡上对应的答题区域内。
写在试题卷、草稿纸和答题卡上的非答题区域均无效。
4.考试结束后,请将本试题卷和答题卡一并上交。
一、选择题:本题共15题,每小题2分,共30分。
在每小题给出的四个选项中,只有一项是符合题目要求的。
1.下列一般不.作为基因工程中运载体上的标记基因的是 A .抗性基因B .发光基因C .产物具有颜色反应的基因D .贮藏蛋白的基因【答案】D【解析】本题主要考查运载体的相关知识。
抗性基因可作为基因工程的标记基因,筛选重组子,A 项正确;发光基因如绿色荧光蛋白基因也可以用作基因工程的标记基因,B 项正确;产物具有颜色反应的基因可作为标记基因,根据颜色反应与否筛选重组子,C 项正确;贮藏蛋白的基因不能用于筛选重组子,不能作为标记基因,D 项错误。
2.下列有关基因工程中限制性内切酶的描述,错误..的是 A .限制性内切酶可从原核生物中获取 B .限制性内切酶的活性受温度的影响 C .限制性内切酶能特异性识别和切割RNAD .一种限制性内切酶只能识别一种特定的脱氧核苷酸序列 【答案】C【解析】本题主要考查限制性内切酶的相关知识。
限制性核酸内切酶主要是从原核生物中分离纯化出来的,A 项正确; 酶活性通常受温度和pH 值的影响,B 项正确; 限制性核酸内切酶能识别和切割DNA ,而不是RNA ,C 项错误;限制酶具有专一性,即一种限制酶只能识别特定的碱基序列和切割一定的位点,D 项正确。
3.下列关于基因工程载体的叙述中,正确的是A .构建基因文库时不需要载体B .载体都是环状DNA 分子C .有一至多个限制酶切割位点D .只来自于原核细胞【答案】C【解析】本题主要考查基因工程载体的相关知识。
质粒中提的用途质粒(plasmid)是一类存在于细菌和酵母等微生物细胞质中的环状DNA分子。
由于其具有简单的结构和易于操作的特点,质粒被广泛应用于分子生物学研究以及基因工程领域。
下面将介绍质粒在基因工程、分子克隆、基因表达等方面的主要用途。
1.基因工程研究:质粒作为外源基因的载体,用于将外源基因导入到宿主细胞中。
通过将外源D N A片段插入质粒的特定位点上,形成重组质粒。
重组质粒可被转化到目标细胞中,使外源基因在目标细胞中表达。
这种方法常用于研究外源基因的功能、调控机制以及与宿主细胞间的相互作用等。
2.分子克隆:质粒作为分子克隆中最常用的载体之一,可用于扩增和保存目标基因。
通过将目标基因插入到质粒上,并在 E.c o l i等细菌中复制扩增。
这样可以快速、高效地制备目标基因的大量拷贝,为后续的实验和应用提供足够的材料。
3.基因表达:质粒可用于外源基因的高效表达。
在质粒中加入适当的启动子和终止子等调控序列,可使质粒上的外源基因在宿主细胞中高水平地表达。
通过选择适当的质粒载体和宿主菌株,可根据需求实现不同类型的表达,如过量表达、细胞内定位或分泌表达等。
4.基因治疗与基因药物研发:质粒可用于基因治疗的研究和应用。
将治疗相关的基因插入质粒,形成治疗质粒后通过合适的途径导入患者体内,实现目标基因的表达和治疗效果。
质粒还可用于基因药物的研发,通过将激活某种基因的片段设计并构建到质粒上,用于治疗某些由基因缺陷引起的疾病。
5.转基因生物研究:质粒被广泛应用于转基因生物的构建和研究。
通过将外源基因插入质粒中,并将该质粒导入植物细胞或动物细胞中,可实现转基因生物的生成。
这种方法可用于改良农作物、研究基因功能以及生物医学研究等方面。
6.抗生素筛选:质粒通常带有抗生素抗性基因,这使得研究人员可以通过添加抗生素对转化的细胞进行筛选。
只有带有质粒的细菌能够生存并在含有抗生素的培养基上繁殖。
通过这种方法,可以筛选出含有特定质粒的转化细胞,并进一步研究质粒中的目标基因或功能。
基因工程原理题库-名称解释1.基因:DNA分子中含有特定遗传信息的一段核苷酸序列,是遗传物质的最小功能单位。
2.假基因:一种类似于基因序列,其核苷酸序列同其相应的正常功能基因基本相同、但却不能合成功能蛋白的失活基因。
3.重叠基因: 是指两个或两个以上的基因共有一段DNA序列,或是指一段DNA序列为两个或两个以上基因的组成部分。
4.结构基因:指受调控的编码特定生物合成和代谢过程中的酶/蛋白质的基因。
5.调节基因(regulator gene): 是编码合成那些参与基因表达调控的RNA和蛋白质的特异DNA序列。
6.基因家族:真核生物基因组中来源相同、结构相似、功能相关的一组基因,可能由某一共同祖先基因经重复和突变产生。
7.基因表达:是指生物基因组中结构基因所携带的遗传信息经过转录、翻译等一系列过程,合成特定的蛋白质,进而发挥其特定的生物学功能和生物学效应的全过程。
8.基因组:该指单倍体细胞中包括编码序列和非编码序列在内的全部DNA分子。
9.基因工程:是指在分子水平上,根据分子生物学和遗传学原理,在体外将一个生物体中有用的目的DNA(或基因)核酸分子插入病毒、质粒或其它载体分子,构成遗传物质的新组合,并使之掺入到原先没有这类分子的寄主细胞中内,而能持续稳定的繁殖。
使后者获得所需的新遗传性状或表达所需产物,最终实现该技术的商业价值。
10.操纵子:是原核生物中一组功能上相关,受同一调控区控制的基因组成的一个遗传单位。
11.mRNA (messenger RNA):由DNA的一条链作为模板转录而来的、携带遗传信息并指导蛋白质合成的一类单链核糖核酸。
12.启动子:在DNA 转录起始时RNA聚合酶识别并与其结合的一段DNA 片段,一般不编码蛋白,具有与RNA 聚合酶结合位点,并引导转录的起始。
13.增强子:位于真核基因中远离转录起始点,能明显增强启动子转录效率的特殊DNA序列。
它可位于被增强的转录基因的上游或下游,也可相距靶基因较远。
新教材选择性必修3晨背晚默第3章基因工程科技探索之路第47天时间:月日1.基因工程是指按照人们的愿望,通过转基因等技术,赋予生物新的遗传特性,创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。
从技术操作层面看,由于基因工程是在上进行设计和施工的,因此又叫作技术。
(P67)2.1944年,艾弗里等人通过肺炎链球菌的转化实验,不仅证明了遗传物质是DNA,还证明了。
(P68)3.1958年,梅塞尔森和斯塔尔用实验证明了DNA的复制。
随后不久,克里克提出中心法则。
(P68)4.1953年,沃森和克里克建立了DNA双螺旋结构模型并提出了遗传物质的假说。
(P68)5.1967年,科学家发现,在细菌拟核DNA之外的质粒有自我复制能力,并可以在细菌。
(P68)6.1972年,伯格首先在体外进行了DNA改造的研究,成功地构建了第一个体外。
(P69)7.1973年,科学家证明质粒可以作为基因工程的载体,构建重组DNA,导入受体细胞,使外源基因在原核细胞中成功表达,并实现的基因交流。
至此,基因工程正式问世。
(P69)8.1984年,我国科学家朱作言领导的团队培育出世界上第一条。
(P69)9.1983年,科学家采用法培育出世界上第一例转基因烟草。
此后,基因工程进入了迅速发展的阶段。
(P69)10.1985年,穆里斯等人发明,为获取目的基因提供了有效手段。
(P69)11.2013年,华人科学家张锋(1982—)及其团队首次报道利用最新的技术——CRISPR(成簇规律间隔短回文重复)技术编辑了哺乳动物基因组。
该技术可以实现对特定基因的定点插入、敲除或替换。
(P69)第1节重组DNA技术的基本工具时间:月日1.切割DNA的工具是限制性内切核酸酶,又称限制酶,这类酶主要是从中分离纯化出来的。
它们能够的某种特定核苷酸序列,并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的断开,产生两种形式的末端。
(P71)2.DNA连接酶分为两类,一类是,另一类是。
3.3 基因工程的应用(同步检测)一、单选题1.大豆为严格的自花传粉、闭花授粉植物。
我国是世界主要的大豆进口国家之一,大豆的产量低是一个重要的瓶颈。
下列说法错误的是()A.我国丰富的大豆种质资源为大豆杂交育种提供了丰富的基因库B.通过培育大豆多倍体来育种是提高其产量的最合适途径C.大豆杂交育种与基因工程育种的原理都属于基因重组D.自然界中的大豆往往都是纯种,大豆间难以自然实现杂交2.我国的科研团队首次发现了高粱细胞中A T1基因编码的A T1蛋白可以调节作物的耐碱性表型,对于提高作物在盐碱地的存活率具有重要意义。
在盐碱地种植的作物会受胁迫产生过量的有害物质H2O2.图中的PIP2s为某种水通道蛋白,其磷酸化水平影响H2O2的跨膜运输,其机理如图所示。
下列叙述错误的是()A.盐碱环境可引起大多数作物胞内液渗透压上升,吸水能力增强B.PIP2s失活的植物细胞在高渗溶液中仍可以发生质壁分离C.敲除AT1基因将导致PIP2s蛋白磷酸化被抑制,促进H2O2外排D.可以将耐碱基因的成果应用到大豆、油菜等更多的作物提高其抗逆性3.作物育种可以说是农业的“芯片工程”,下列关于育种的叙述,错误的是()A.单倍体育种和多倍体育种分别是为了获得单倍体和多倍体新物种B.用化学阻断剂阻止受精后的次级卵母细胞释放极体(n),然后培育形成的最可能是三倍体C.转基因育种和杂交育种的主要原理都是基因重组D.植物体细胞杂交和秋水仙素处理都能实现植物不育向可育的转变4.科学家将蜘蛛的蛛丝蛋白基因导入山羊体内,得到转基因山羊,使羊奶中含有一种独特的蛛丝蛋白,生产原理见下图。
下列叙述错误的是()A.图中的核供体细胞来自雌羊B.导入了蛛丝蛋白基因的核供体细胞不需要进行传代培养C.形成重组细胞时来自核供体细胞的调节蛋白全部被卵细胞质中的蛋白因子替换D.为获得更多转基因山羊,可对早期胚胎进行胚胎分割5.科学家运用基因工程技术,将人凝血因子基因导入山羊的DNA中,培育出羊乳腺生物反应器,使羊乳汁中含有人凝血因子。
基因工程中基因高效表达研究是指外源基因在某种细胞中的表达活动,即剪切下外源基因片段,拼接到另一个基因表达体系中,使其能获得原生物活性又可高产的表达产物。
外源基因表达系统由基因表达载体和相应的受体细胞两部分组成。
一.真核基因在原核细胞中表达,载体必须具备的条件:
⑴载体能够独立复制,具有复制起点。
⑵应具有灵活的克隆位点和方便的筛选标记,以利于外源基因
的克隆鉴定和筛选。
⑶应具有很强的启动子,能为大肠杆菌RNA聚合酶所识别。
⑷应具有阻遏子,使启动子受到控制,只有当诱导时才能进行
转录。
⑸应具有很强的终止子,只转录克隆的基因,所产生的mRNA
较为稳定。
⑹所产生的mRNA必须具有翻译的起始信号AUG和SD序列,
以便转录后顺利翻译。
二.影响克隆基因在大肠杆菌中的表达效率因素:
5’-UTR对克隆基因表达效率的影响
a. 启动子结构对表达效率的影响
大肠杆菌启动子的保守序-35区(5’TTGACA)和-10(5’TATAAT)区;它们之间的距离(17bp)。
b. 启动子与克隆基因的间隔距离对表达效率的影响
当mRNA分子5’-末端与SD序列之间的长度小于15bp时,转译效率下降。
2.mRNA转录本的分子特性对基因表达效率的影响
a. 转译起始序列对表达效率的影响
SD序列后面的4个碱基,T或A时转译作用较高,C或G时,
下降50%或25%;位于起始密码子AUG上游的密码三联体的
碱基,CUU或UAU时转译效率最有效,UUC、UCA或AGG
时下降20倍;
位于起始密码子AUG下游的密码子碱基组成,也影响转译
的速率。
b. mRNA的稳定性对表达效率的影响
3.遗传密码子的使用对基因表达效率的影响
a. 密码子使用的偏爱性现象的规律性
几乎在所有的简并密码子家族中,都有一个或两个是优先
使用的偏爱性密码子;
一些密码子在各种不同基因中都是最常用的(在编码脯
氨酸4种同义密码子,CCC是优先使用的)
高表达活性的基因比低表达活性的基因,呈现出较高程
度的密码子偏爱性
简并密码子的使用频率,反应它们相应的tRNA丰度。
b.密码子使用偏爱性对基因表达效率的影响
富含大肠杆菌罕用密码子的外源真核基因,很难在大肠
杆菌转化子细胞中得到有效的表达。
不同生物密码子的偏爱性,是阻碍外源基因在大肠杆菌
中高效表达的一种重要因素。
4.质粒载体的生物学特性对基因表达效率的影响
a. 质粒载体点的拷贝数对表达效率的影响
b. 质粒载体的不稳定性对表达效率的影响
5. 寄主细胞的生理状态对基因表达效率的影响
培养基营养成分的选择、细胞培养方式、培养
温度等环境因素能影响大肠杆菌生理状态。
质粒拷贝数
质粒拷贝数对细菌生长代谢的影响
目前实验室里广泛使用的表达型质粒在每个大肠杆菌细胞中可达数百甚至上千个拷贝,质粒的扩增过程通常发生在受体细胞的对数生长期内,而此时正是细菌生理代谢最旺盛的阶段。
质粒分子的过度增殖以及其后目的基因的高效表达势必会影响受体细胞的生长代谢,进而导致重组质粒的不稳定性以及目的基因宏观表达水平的下降。
三.减少形成包涵体的策略:
降低重组菌的生长温度。
添加可促进重组蛋白质可溶性表达的生长添加剂(高浓度多醇类、蔗糖)。
供给丰富的培养基,创造最佳培养基(供氧、pH等)
四.酿酒酵母表达系统
酿酒酵母的基因表达系统最为成熟,包括转录活性较高的甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因GAPDH、磷酸甘油激酶基因PKG、乙醇脱氢酶基因ADH所属的启动子,多种重组外源蛋白获得成功表达。
酿酒酵母表达系统的最大问题在于其超糖基化能力,往往使得有些重组蛋白(人血清白蛋白等)与受体细胞紧密结合,而不能大量分泌;且发酵过程中产生乙醇。
乳酸克鲁维酵母表达系统
乳酸克鲁维酵母的双链环状质粒pKD1已被广泛用作重组异源蛋白生产的高效表达稳定性载体,即便在无选择压力的条件下,也能稳定遗传40代以上。
乳酸克鲁维酵母表达分泌型和非分泌型的重组蛋白,性能均优于酿酒酵母表达系统。
1、毕赤酵母是需氧酵母菌,在有氧条件下能高密度生长,因
此有利于扩大生产获得高浓度细胞,从而进行高效表达
2、通过质粒整合到毕赤酵母基因组的外源基因结构稳定,不
易丢失;且外源基因能以高拷贝数整合到毕赤酵母基因组中,
能够筛选到高表达菌株
3、毕赤酵母甲醇氧化酶(alcohol oxidase,AOX)基因的强启动
子特别适用于外源基因的调控表达
巴斯德毕赤酵母表达系统
4、毕赤酵母自身分泌到培养基中蛋白很少,使得分泌性的外
源蛋白容易从培养基的基质中分离
5、毕赤酵母对外源蛋白产物进行N-乙酰糖基化修饰的结构为
高甘露糖型,糖链平均为8~14个甘露糖基,更接近于高等生
物,且聚糖末端不含1,3连接的甘露糖残基(有强的免疫原性)
,因而适用于临床应用
6、使用方便、简单,而且成本较低
甲醇营养型毕赤酵母优点:
(1)具有醇氧化酶AOX1基因启动子,这是目前最强,调控机理最严格的启动子之一;
(2)表达效率高,其表达的外源蛋白可占总表达蛋白的90%以上,有利于目的蛋白的分离纯化;
(3)在简单合成培养基中可实现高密度培养;
(4)表达质粒能在基因组的特定位点以单拷贝或多拷贝的形式稳定整合;
(5)由于该酵母可以以甲醇为唯一的碳源和能源,而绝大多数微生物并不能以甲醇为碳源,可以减少污染。
(1)发酵周期长
(2)甲醇易燃易爆有毒,存在一定的危险性
(3)筛选高产菌株需用的药物价格比较昂贵
(4)培养基和培养条件不成熟毕赤酵母发酵生产外源蛋白的过程一般包括3个阶段: (1)细胞增殖阶段(2)分批流加的过渡阶段(3)诱导表达阶段(甲醇)各阶段碳源都为限制性基质,其补加速率的动力学模型是高效表达的基础。
生长迅速
乙醇氧化酶基因AOX1所属强启动子
表达的可诱导性
已有百余种具有经济价值的重组蛋白在巴斯德毕赤酵母
系统中获得成功表达。
由于巴斯德毕赤酵母没有合适的自主复制型载体,所以外源基因的表达序列一般整合入受体染色体DNA上。
巴斯德毕赤酵母是一种甲基营养菌,能在低廉的甲醇培养基中生长,甲醇可高效诱导甲醇代谢途径中各酶编码基因的表达,因此生长迅速、乙醇氧化酶基因AOX1所属强启动子、表达的可诱导性是巴斯德毕赤酵母表达系统的三大优势。
甲醇酵母表达系统
⒈甲醇酵母的生物学
AOX1 and AOX2
Mut+ and Muts
⒉表达载体和受体菌
pPIC3.5K(胞内表达)
pPIC9.3K(分泌表达)
pAO815 (多拷贝表达)
载体结构上的共同点:
5’AOX1 重组位点
MCS 多克隆位点
TT 转录终止和多聚腺苷酸化序列
3’AOX1 重组位点
His4 重组位点筛选标记
Ampr 筛选标记
甲醇酵母表达系统中常用载体的基本结构
5'AOX1 启动子片段含有AOX1启动子,在甲醇的诱导下可启动外源蛋白的表达;
α-因子信号肽序列为约89个氨基酸的信号肽序列,能使外源蛋白分泌到发酵上清中,更利于外源蛋白的纯化;
多克隆位点含多个酶切位点,为外源基因插入提供位点;
TT序列提供有效的转录终止和polyA修饰信号;
HIS4为营养缺陷型筛选标志;
3' AOX1 基因片段能够与基因组AOX1基因属同源重组;
抗Amp 基因和pBR322能使空载体和构建的表达载体在E.coli中筛选和复制。
G418:是一种氨基糖苷类抗生素,Kanamycin抗性基因能对抗G418对酵母的毒性
由89个氨基酸组成的酿酒酵母的分泌信号—α交配因子(α-factor)引导序列已经成功地引导了几种外源蛋白的分泌
pPIC9载体的信号肽序列和多克隆位点
1. 载体的3' AOX1区与基因组的AOX1基因的末端发生整合重组
表达载体与甲醇酵母基因组发生重组的方式:
2. 载体的HIS4区与基因组的HIS4基因的末端发生整合重组
同源基因重组:同源染色体的非姐妹染色单体的交叉互换引起的互换重组
利用甲醇酵母表达系统进行NGAL蛋白外源表达进行验证的实验技术路线:
构建表达载体→转化至酵母菌中→筛选阳性转化单克隆→筛选高表达单克隆
甲醇酵母表达系统的优点
强启动子
可进行翻译后加工
营养要求低
可高密度发酵
表达高
表达的蛋白质可胞内也可胞外
糖基化程度低
甲醇酵母表达外源蛋白示例
影响目的基因在酵母菌中表达的因素
⑴外源基因的拷贝数
⑵外源基因的表达效率
①启动子②分泌信号的效率
③终止序列的影响
⑶外源蛋白的糖基化
⑷宿主菌株的影响
①菌体生长力强②菌体内源蛋白酶要较弱
③菌体性能稳定④分泌能力强
在酵母中高效表达的策略
选择合适的受体细胞系统
提高表达载体在细胞中的拷贝数
提高外源基因转录水平
主要基因工程表达体系比较
表达体系产物产生部位培养方式提纯产物活性潜在危性
大肠杆菌多肽蛋白质菌体内容易一般对原核好不大融合蛋白质部分高产对真核差
酵母多肽蛋白质菌体内容易菌体内真核的接近不大糖基化蛋白外分泌可高产稍复杂天然产物
哺乳动物完整外分泌较难成本高简单可达天然需注意糖基化蛋白可高产产物致癌。