外源基因的原核表达系统
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外源基因原核系统克隆表达的基本流程
外源基因原核系统克隆表达的基本流程如下:
1. 设计引物:根据外源基因的序列,设计引物,其中至少包括一个启动子和一个终止子。
2. 基因克隆:使用PCR或其他克隆技术,将外源基因与载体DNA连接起来,形成重组质粒。
3. 转化:将重组质粒转化到适当的宿主细胞中,如大肠杆菌。
4. 筛选:通过选择性培养基或其他筛选方法,筛选出带有重组质粒的转化菌落。
5. 培养:将筛选出的转化菌落进行扩增培养,在适当的培养条件下培养细菌。
6. 表达:在培养过程中,外源基因会被宿主细胞转录和翻译,产生目标蛋白质。
7. 提取:收集细菌培养物,利用细胞破裂或其他细胞提取方法,提取目标蛋白质。
8. 纯化:通过各种纯化技术,如柱层析、电泳等,纯化目标蛋白质。
9. 鉴定:利用各种方法,如SDS-PAGE、Western blot等,对
目标蛋白质进行鉴定和定量分析。
10. 应用:利用纯化的目标蛋白质进行后续的研究或应用,如
功能鉴定、结构分析、抗原制备等。
这是一个基本的流程,根据不同的实验目的和具体情况,可能还会涉及到一些其他的步骤和操作。
原核表达实验报告-回复实验目的:本实验旨在探究原核表达的过程和原理,分析原核表达实验的步骤和相关技术应用。
引言:原核表达是生物学领域中常用的实验技术之一,它可以通过转录和翻译过程将外源基因导入到原核细胞中并使其表达出目标蛋白质。
原核表达在基因工程、药物研发、蛋白质生产等方面起着重要作用。
了解原核表达的过程和原理,掌握其实验步骤和技术应用,对于学习和应用相关领域的研究都具有重要意义。
实验步骤:1. 选择合适的原核表达系统:原核表达系统主要包括细菌和酵母两种。
在选择表达系统时,需要考虑目标蛋白质的生理特性和产量需求等因素。
细菌表达系统常用的有大肠杆菌(E. coli) 和拟杆菌(Bacillus subtilis),而酵母表达系统则常用酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。
2. 构建表达载体:构建表达载体是原核表达实验的关键一步。
通常采用的是重组DNA技术,将目标基因插入载体中。
载体中包含启动子、选择标记物和阻遏子等元件,以控制和增强目标基因的表达。
3. 转化表达细胞:将构建好的表达载体导入到表达细胞中。
常用的转化方法有化学法、电转化法和热冲击法等。
通过转化,表达载体成功导入到细胞内。
4. 选择和培养表达阳性克隆:转化后的细菌需要进行筛选,得到表达阳性克隆。
通常通过选择标记物(如抗生素)对未转化细胞进行抑制,从而判断转化是否成功。
表达阳性克隆可通过液体培养或固体培养等方式进行扩增。
5. 蛋白质表达和纯化:经过培养扩增的表达阳性克隆可进行蛋白质表达和纯化。
比较常用的方法有亲和层析、离心扩增和玻璃珠破碎等。
实验技术应用:1. 蛋白质生产:原核表达广泛应用于大规模蛋白质生产。
通过原核表达系统,可以高效地表达大量目标蛋白质,满足科研和工业生产的需求。
2. 蛋白质互作研究:原核表达技术可用于研究蛋白质的互作关系。
通过表达不同蛋白质,进行蛋白质相互作用的分析,有助于揭示蛋白质功能和信号转导网络等。
大肠杆菌表达系统总结随着分子生物学和蛋白组学的迅猛发展,外源基因表达的遗传操作技术日趋成熟。
表达系统是外源基因表达的核心,常用表达系统一般为模式生物,包括真核表达系统和原核表达系统,其中真核系统包括了哺乳动物细胞表达系统、植物体表达系统、昆虫杆状病毒表达载体系统以及酵母表达系统,原核表达系统则主要为大肠杆菌表达系统。
大肠杆菌是目前应用最广泛的原核表达系统,也是最早进行研究的外源基因表达系统,其遗传学背景清晰、生长快、较易实现高密度培养、成本低、产量高,相较于其它表达系统具有难以比拟的优越性,是商业生产中应用最广泛的表达系统,取得了巨大的科研价值和经济效益。
大肠杆菌表达系统目前广泛应用于表达生产多种蛋白质/多肽类药物和生物化学产品,包括:重组人胰岛素、a2b型干扰素、兰尼单抗、紫色杆菌素和牡丹皮葡萄糖苷等。
据统计,1986-2018年由美国FDA和欧洲EMA批准上市的重组蛋白类药物中有26%来自于大肠杆菌。
与此同时,目前通过大肠杆菌表达的基因工程疫苗也进入市场或处于临床实验阶段,如戊型肝炎疫苗、人乳头瘤病毒疫苗、流感A型疫苗等。
常见的大肠杆菌表达系统有BL21系列、JM109系列、 W3110系列和K802系列等,其中大肠杆菌 BL21( DE3)菌株是目前应用于重组蛋白表达研究最广泛的菌株之一,BL21(DE3)是由大肠杆菌B系列与K-12系列的衍生菌株通过 P1 转导等遗传突变获得的。
该类菌株通常为宿主蛋白酶缺失型,以保证外源蛋白在表达过程中不被降解,维持表达的稳定性。
大肠杆菌表达系统在商业生产中具有巨大的优越性和价值,但建立高效匹配的表达系统是实现商业价值的关键,包括宿主菌、外源基因、载体的选择与匹配。
宿主菌的选择是第一步,对表达活性和表达量影响很大,理想的宿主菌株是蛋白酶缺陷型,避免蛋白酶过多引起的产物不稳定,常见的蛋白酶缺陷型菌株为BL21系列菌株。
其次是外源基因,外源基因决定了是否可获得目的产物,原核基因可在大肠杆菌中直接表达,而真核基因不能再大肠杆菌中直接表达。
sdd-age原核表达蛋白
原核表达蛋白是指在原核生物(如细菌)中表达的蛋白质。
sdd-age是一种原核表达系统,它是一种基因工程技术,用于在细
菌中大量表达外源蛋白。
sdd-age系统通常包括一个质粒载体,该
载体含有编码目标蛋白的基因序列,以及一些调控元件,如启动子
和终止子,用于控制基因的转录和翻译。
在sdd-age系统中,质粒
被转化到细菌中,然后细菌被培养在含有适当抗生素的培养基中,
以促使质粒在细菌内大量复制。
同时,通过适当的诱导剂(如IPTG)的添加,可以启动目标基因的表达,从而使细菌产生大量目标蛋白。
原核表达系统的优点之一是高效性,sdd-age系统特别适合大
规模生产蛋白质。
此外,由于细菌的生长周期短,这意味着蛋白质
的生产周期也相对较短。
然而,原核表达系统也存在一些局限性,
例如蛋白质可能无法正确折叠或进行后翻译修饰,这可能会影响蛋
白质的功能性。
因此,在选择原核表达系统时,需要考虑目标蛋白
的特性以及后续的应用需求。
总的来说,sdd-age原核表达系统是一种常用的工具,用于在
细菌中高效表达外源蛋白,具有高效、快速和相对低成本等优点,
适用于科研和工业生产中。
原核表达系统的工作原理原核表达系统是指利用原核生物(如大肠杆菌等)来表达外源蛋白质的工具,在生物技术和基因工程领域应用十分广泛。
原核表达系统通过重组DNA技术将目标基因插入原核细胞的表达载体中,并利用细胞自身的代谢机制,将目标蛋白质大量表达出来。
本文将详细介绍原核表达系统的工作原理。
1. 原核表达系统的基本构成原核表达系统的基本构成包括表达载体和宿主细胞两部分。
表达载体是一种重组DNA分子,通常包括以下基本组成成分:(1)起始位点(起始密码子):在大肠杆菌中通常为AUG。
(2)表达基因:包括编码目标蛋白质的DNA序列和转录启动子、转录终止子等序列。
(3)选择标记:旨在筛选出带有目标基因的细胞,并提高表达效率。
常用的选择标记有抗生素抵抗基因和荧光标记基因等。
(4)复制起点:能够使表达载体在宿主细胞内进行自我复制,提高表达效率。
宿主细胞则是一种能够实现表达载体遗传信号转录、翻译和合成目标蛋白质的生命体。
2. 原核表达系统的工作流程原核表达系统通过以下几个步骤来实现目标蛋白质的表达:(1)制备表达载体将目标基因插入表达载体中,构建成重组DNA分子。
(2)转化宿主细胞将制备好的表达载体转化(transform)到宿主细胞内。
转化过程中,表达载体通过电击、热激或溶菌酶处理等方法,被宿主细胞吞噬并与其细胞质融合。
(3)表达基因转录和翻译转录因子识别插入表达载体的启动子序列,调节基因在宿主细胞内能够合成被表达的mRNA。
转录后的mRNA与核糖体结合,开始翻译,合成蛋白质。
(4)目标蛋白质的后处理和纯化将宿主细胞内表达的蛋白质从培养基或细胞酶中提取出来。
通常采用离心、过滤或柱层析等方法,对蛋白质进行分离和纯化。
3. 原核表达系统的优缺点原核表达系统在生物技术和基因工程领域应用广泛,主要因为其有以下的优缺点。
(1)优点①高效:能够表达大量的目标蛋白质,通常能够达到10%以上的蛋白质总产量。
②简便:操作简便,不需要昂贵的设备,很容易进行规模化操作。
蛋白体外表达与纯化随着后基因组时代的到来,蛋白质组成为科学研究的热点。
蛋白质作为生命机体的主要活动的承担者,其体外表达与纯化在研究相应基因的功能上有重要意义。
蛋白体外表达系统按其表达宿主可分为原核表达系统,真核表达系统和哺乳动物细胞表达系统。
一:原核表达系统原核表达系统的宿主菌主要以大肠杆菌为代表,大肠杆菌表达体系是目前应用最广泛的外源基因表达体系,这也是外源基因表达的首选体系。
该表达体系的优点:遗传学和生理学背景清楚;容易培养;外源基因经常可以高效表达及操作简单、周期短、成本低等。
其不足之处是不能进行典型真核细胞所具有的复杂的翻译后修饰;广泛的二硫键的形成及外源蛋白组装成蛋白复合体的能力也受到限制;另外外源基因产物在大肠杆菌中易形成不溶的包涵体;有时由于真核mRNA的结构特性及密码子使用频率与大肠杆菌的差异,而的不到足够的产物。
二:真核表达系统真核表达系统的宿主菌主要以酵母表达系统为代表,酵母基因表达系统的载体通常既能在酵母中进行复制也能在大肠杆菌中进行复制,形成所谓酵母菌――大肠杆菌穿梭载体。
因以大肠制备质粒DNA较方便,通常利用大肠杆菌系统构建酵母载体以简化手续,缩短时间。
作为基因表达系统的宿主应该具备以下条件:安全无毒,不致病;遗传背景较清楚,容易进行遗传操作;容易进行载体DNA的导入;培养条件简单;有良好的蛋白分泌能力;有类似高等真核生物的蛋白翻译后修饰功能。
三:哺乳动物细胞表达系统由于本专业不涉及哺乳动物细胞表达系统的应用,故此不赘述。
表达载体的种类及相应的分离纯化方法作为表达载体必须具备以下特征:稳定的遗传复制、传代能力,无选择压力下能存在于宿主细胞内;具有显性的筛选标记;启动子的转录是可调控的;启动子的转录的mRNA能够在适当的位置终止;具有外源基因插入的多克隆位点。
在原核表达系统中常用的表达载体有:PET-载体系列,用这类载体表达出的外源蛋白在N端或C端或两端均具有his tag。
实验九外源基因在大肠杆菌中的诱导表达和降解物阻遏作用【实验目的】1.了解外源基因在原核细胞中表达的基础理论。
2.掌握乳糖操纵子的调节机制和操作方法。
【实验原理】1.外源基因在原核细胞中的表达蛋白质通常是研究的最终目标,因此蛋白质的表达在基因工程中占有非常重要的地位。
常用的表达系统有原核细胞和真核细胞。
原核细胞表达系统主要使用大肠杆菌,真核细胞表达系统主要有酵母细胞、哺乳动物细胞和昆虫细胞。
这些表达系统各有优缺点,应根据实验目的和实验室条件加以选择。
本实验主要介绍以大肠杆菌为代表的原核细胞表达系统。
(1)大肠杆菌表达系统的特点:生物学特性和遗传背景清楚,易于操作;已开发较多的克隆载体可供选择;容易获得大量的外源蛋白(外源蛋白可占细菌总蛋白50%左右)。
(2)蛋白质在原核细胞中的表达特点:原核细胞有其固有的RNA聚合酶,识别原核基因的启动子。
因此,在用原核细胞表达目的基因(无论是真核基因还是原核基因)时,一般应使用原核启动子。
原核基因的mRNA含有SD序列,启动蛋白质的合成。
而在真核基因上则缺乏该序列。
因此,一些商品化原核表达载体上设计有SD序列,以方便真核基因的表达。
原核细胞没有mRNA转录后加工的能力。
因此,在原核细胞中表达真核基因时,应使用cDNA 为目的基因。
原核细胞缺乏真核细胞对蛋白质进行翻译后加工的能力。
如表达产物的功能和蛋白质的糖基化、高级结构的正确折叠有关,必须慎重使用原核表达系统。
外源基因在大肠杆菌中高效表达时,表达产物往往在胞浆聚集,形成均一密度的包涵体。
包涵体的形成有利于保护表达产物不被胞内的蛋白酶降解,而且可以通过包涵体和胞内其他蛋白质密度不同来纯化包涵体蛋白。
但包涵体蛋白不具有该蛋白的所有生物学活性,往往需要通过变性复性的方法恢复活性,有时只能回复部分活性。
(3)蛋白质在原核细胞表达的调控启动子是转录水平调控的主要因素。
根据启动子起始mRNA合成效率的不同,可分为强、弱启动子,但是启动子的强弱是相对于不同基因而言的。
简述外源基因原核系统克隆表达的基本流程外源基因在原核系统中的克隆表达是通过一系列步骤来实现的。
以下是基本的流程:1. 选择质粒载体(Plasmid Vector):-选择一个合适的质粒,通常是圆形DNA 分子,具有自主复制的能力。
质粒通常包含选择标记(例如抗生素抗性基因)和表达调控元件(例如启动子、终止子等)。
2. 准备目标基因:-获取外源基因,这可以是从其他生物中克隆得到的DNA 片段。
这个基因应该编码所需的蛋白质或RNA。
3. 限制性内切酶切割:-使用限制性内切酶切割质粒载体和目标基因。
选择适当的酶,以确保两者切口相互兼容。
4. 连接(Ligation):-将切割后的质粒和目标基因连接在一起,形成重组质粒。
这一步通常涉及DNA 连接酶。
5. 转化(Transformation):-将重组质粒导入宿主细菌中。
这可以通过热激冲击、电穿孔或其他方法实现。
质粒包含抗生素抗性基因,使得只有带有重组质粒的细菌能够在含有抗生素的培养基中生长。
6. 筛选(Screening):-鉴定带有正确重组质粒的细菌。
这可以通过PCR、酶切鉴定等技术来进行。
7. 培养:-将筛选出的正常克隆株培养起来,以增大其数量。
8. 表达:-利用宿主细菌的生物机制,使得外源基因在细菌中表达。
这通常涉及到适当的启动子和终止子,以及其他调控元件。
9. 纯化:-如有必要,对表达的蛋白质进行纯化。
这可以通过各种方法,如层析、电泳等来实现。
整个流程的成功依赖于实验室技术的熟练操作和对基因工程原理的深刻理解。
这些步骤的每一步都需要谨慎操作,以确保最终得到具有期望表达产物的克隆。
原核表达技术原核表达技术是一种用于原核生物体中表达外源基因的技术。
通过将外源基因导入原核生物体中,并使其在细胞内得到表达,可以实现对目标基因的研究和利用。
原核表达技术在生物科学研究、生物工程、医学等领域具有广泛的应用前景。
原核表达技术的基本原理是将外源基因导入原核生物体中,并将其与宿主细胞的基因表达系统连接起来。
这样,外源基因就可以在宿主细胞内得到转录和翻译,从而表达出编码的蛋白质。
为了实现这一目标,研究人员通常需要构建一个包含外源基因的表达载体,并将其导入到宿主细胞中。
在构建表达载体时,研究人员通常会选择合适的启动子、转录终止子和调节元件等,以确保外源基因在宿主细胞中得到高效的转录和翻译。
此外,还可以通过引入信号肽序列等方式,使得目标蛋白质能够在宿主细胞中得到正确的翻译和定位。
在导入表达载体到宿主细胞中时,常用的方法有化学法转化、电转化和质粒共转化等。
其中,化学法转化是最常用的方法之一。
通过将表达载体和宿主细胞一起处理化学试剂,使得宿主细胞的细胞壁发生变化,从而导致表达载体进入细胞内。
电转化则是利用电场脉冲的作用,使得表达载体能够穿过宿主细胞的细胞膜进入细胞内。
质粒共转化是将表达载体与另一个能够进行共转化的质粒一起导入宿主细胞中,以提高转化效率。
一旦表达载体成功导入宿主细胞,外源基因就可以开始在细胞内得到表达。
为了检测外源基因的表达情况,研究人员通常会选择合适的检测方法,如聚合酶链反应(PCR)、蛋白质印迹、酶活性分析等。
通过这些方法,可以确定外源基因是否得到了正确的转录和翻译,并且能够得到目标蛋白质的定量和活性信息。
原核表达技术在生物科学研究中有着广泛的应用。
例如,通过原核表达技术可以实现对目标基因的功能研究。
研究人员可以通过构建不同的表达载体,将目标基因在宿主细胞中进行过量表达或靶向抑制,进而研究其在细胞生理过程中的作用机制。
另外,原核表达技术还可以用于生物工程领域。
研究人员可以利用原核表达技术生产大量的重组蛋白质,以满足药物研发和工业生产的需求。
原核表达系统是目前使用最广泛、最完善的重组蛋白表达系统,具有遗传背景清晰、表达周期快、表达量高、成本低等优势,缺点是无法进行蛋白的翻译后修饰,得到具有生物活性蛋白的几率较小。
原核表达系统适用于表达原核来源的蛋白或不需要翻译后修饰的真核来源蛋白。
在原核蛋白表达过程中,需要综合考虑表达菌株、质粒载体、表达条件三大因素,以获得最满意的表达效果。
下面为大家一一介绍这三大因素的选择和优化。
1. 表达菌株菌株的选择往往是大家最容易忽视的,大多数人会选择使用自己实验室有的或用过的表达菌株。
当蛋白表达效果不佳时,大多会在质粒载体或表达条件上找原因,而不会考虑菌株的选择是否合适。
但作为表达宿主,菌株一定会对外源基因表达蛋白产生影响。
图1 大肠杆菌原核表达系统常用的菌株包括大肠杆菌、芽孢杆菌和链霉菌。
其中运用最为广泛的就是大肠杆菌表达系统。
以下为大家列出了一些常用的大肠杆菌表达菌株,可根据不同的需求进行选择。
2. 质粒载体质粒表达载体上的重要元件包括启动子,多克隆位点,终止子,复制子,信号肽,融合标签,筛选标记等。
根据载体上这些元件的特性,有多种质粒可供选择。
图2 大肠杆菌表达质粒pET-22b(+)图谱启动子:根据启动子的强弱考虑,强启动子可以提高蛋白表达量;弱启动子可以降低本底表达、增加可溶表达、表达小量伴侣蛋白等。
根据启动子的作用方式考虑,组成型启动子使宿主不停的表达重组蛋白;诱导型启动子使宿主在特定诱导条件下表达重组蛋白。
终止子:终止子的作用在于保护mRNA在核外不被降解,延长mRNA的寿命,以提高重组蛋白表达量。
对于T7系统来说,由于T7 RNA聚合酶效率非常高,保证一直有充足的mRNA 提供翻译,所以终止子对其影响不大,只有一些自身带有起始密码子的外源基因需要终止子。
~复制子:复制子决定质粒载体拷贝数,拷贝数越高,重组蛋白表达量就越高。
表达载体通常会选用高拷贝的复制子,但过高的拷贝数会影响质粒稳定性和宿主生长。