多杀性巴氏杆菌的分离和PCR鉴定

２０２３年第１１期（总第４１４期）畜禽业试验研究猪源多杀性巴氏杆菌分离鉴定及药敏试验其美拉姆１，胡洹圆２，曾南方３，陈弟诗４通信作者，李　晏３，颜其贵２１．西藏自治区林芝市察隅县上察隅镇农牧综合服务中心，西藏察隅８６０６１４２．四川农业大学动物医学院，四川成都６１１１３０３．巨星农牧有限公司，四川乐山６１４８９９４．四川省动物疫病预防控制中心，四川成都６１００４１摘　要　试验从四川地区某猪场病死猪肺脏组织中分离细菌，并对其进行形态学观察、１６ＳｒＲＮＡ序列比对、菌种特异性与荚膜血清型鉴定、毒力基因检测、药敏试验以及动物回归试验。

结果显示：在病猪肺脏组织中分离得到的细菌菌落形态呈现表面光滑、细小透明的露滴状菌落；革兰染色镜检显示为革兰阴性短杆菌；１６ＳｒＲＮＡ测序结果显示，该分离菌与多杀性巴氏杆菌同源性大于９９．６％；细菌种特异性ＫＭＴ１基因和荚膜血清型分型鉴定，表示该分离菌为多杀性巴氏杆菌且与荚膜血清Ａ型相符；毒力基因检测显示该分离菌携带了６种主要毒力基因（ｐｔｆＡ、ｐｆｈＡ、ｓｏｄＡ、ｐｌｐＢ、ｔｏｎＢ、ｎａｎＨ）；药敏试验结果显示，该分离菌对２２种试验药物中的１０种抗菌药物敏感，对７种抗菌药物耐药；动物回归试验显示该菌株能导致试验猪肺脏出血、气管有血性泡沫；且发现肝组织中存在两端钝圆小杆菌，表明该株分离菌具有较强的致病性。

试验从四川地区成功分离得到１株猪源荚膜血清为Ａ型的多杀性巴氏杆菌，对其进行了细菌生物学特性研究，同时复制了多杀性巴氏杆菌的发病模型，为防治该病提供依据。

关键词　多杀性巴氏杆菌；分离鉴定；毒力基因；药敏试验；动物回归Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ，ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄｄｒｕｇｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙａｎａｌｙｓｉｓｏｆｐｏｒｃｉｎｅＰａｓｔｅｕｒｅｌｌａｍｕｌｔｏｃｉｄａＱｉｍｅｉＬａｍｕ１，ＨＵＨｕａｎｙｕａｎ２，ＺＥＮＧＮａｎｆａｎｇ３，ＣＨＥＮＤｉｓｈｉ４ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇａｕｔｈｏｒ，ＬＩＹａｎ３，ＹＡＮＱｉｇｕｉ２１．ＳｈａｎｇｃｈａｙｕＴｏｗｎＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅａｎｄＡｎｉｍａｌＨｕｓｂａｎｄｒｙＣｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅＳｅｒｖｉｃｅＣｅｎｔｅｒ，Ｃｈａｙｕ８６０６１４，Ｃｈｉｎａ２．ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＭｅｄｉｃｉｎｅ，ＳｉｃｈｕａｎＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈｅｎｇｄｕ６１１１３０，Ｃｈｉｎａ３．ＧｉａｎｔｓｔａｒＦａｒｍｉｎｇ＆ＨｕｓｂａｎｄｒｙＣｏｍｐａｎｙＬｉｍｉｔｅｄ，Ｌｅｓｈａｎ６１４８９９，Ｃｈｉｎａ４．ＣｅｎｔｅｒｆｏｒＡｎｉｍａｌＤｉｓｅａｓｅＣｏｎｔｒｏｌａｎｄＰｒｅｖｅｎｔｉｏｎｏｆＳｉｃｈｕａｎＰｒｏｖｉｎｃｅ，Ｃｈｅｎｇｄｕ６１００４１，ＣｈｉｎａＡｂｓｔｒａｃｔ　ＴｈｉｓｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｗａｓｔｏＩｓｏｌａｔｅｂａｃｔｅｒｉａｆｒｏｍｔｈｅｌｕｎｇｏｒｇａｎｓｏｆｄｉｓｅａｓｅｄａｎｄｄｅａｄｐｉｇｓｉｎａｐｉｇｆａｒｍｉｎＳｉｃｈｕａｎ，ｗｈｉｃｈｗｅｒｅｓｕｂｊｅｃｔｅｄｔｏｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎ，１６ＳｒＲＮＡｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｂａｃｔｅｒｉａｌｓｐｅｃｉｅｓｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙａｎｄｃａｐｓｕｌｅｓｅｒｏｔｙｐｅｓ，ｖｉｒｕｌｅｎｃｅｇｅｎｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎ，ｄｒｕｇｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙｔｅｓｔ，ａｎｄｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎｔｅｓｔｉｎｇｏｎａｎｉｍａｌｓ．Ｔｈｅｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙｏｆｔｈｅｂａｃｔｅｒｉａｌｃｏｌｏｎｉｅｓｉｓｏｌａｔｅｄｆｒｏｍｔｈｅｌｕｎｇｔｉｓｓｕｅｓｏｆｔｈｅｄｉｓｅａｓｅｄｐｉｇｓｐｒｅｓｅｎｔｅｄｓｍｏｏｔｈｓｕｒｆａｃｅｓａｎｄｓｍａｌｌｔｒａｎｓｐａｒｅｎｔｄｅｗｄｒｏｐ－ｓｈａｐｅｄｃｏｌｏｎｉｅｓ；ＧｒａｍｓｔａｉｎｉｎｇｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｙｗｅｒｅｓｍａｌｌＧｒａｍ ｎｅｇａｔｉｖｅｒｏｄ ｓｈａｐｅｄｂａｃｔｅｒｉａ；１６ＳｒＲＮＡｓｅ ｑｕｅｎｃｉｎｇｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｉｓｏｌａｔｅｗａｓ９９．６％ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓｔｏＰａｓｔｅｕｒｅｌｌａｍｕｌｔｏｃｉｄａ；ｔｈｅｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｂａｃｔｅｒｉａｌｓｐｅ ｃｉｅｓ ｓｐｅｃｉｆｉｃＫＭＴ１ｇｅｎｅａｎｄｃａｐｓｕｌｅｓｅｒｏｔｙｐｉｎｇｉｎｄｉｃａｔｅｄｔｈａｔｔｈｅｉｓｏｌａｔｅｗａｓＰａｓｔｅｕｒｅｌｌａｍｕｌｔｏｃｉｄａａｎｄｗａｓｃｏｍｐａｔｉｂｌｅｗｉｔｈｃａｐｓｕｌｅｓｅｒｏｔｙｐｅＡ．Ｖｉｒｕｌｅｎｃｅｇｅｎｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｂａｃｔｅｒｉａｃａｒｒｉｅｓｓｉｘｍａｊｏｒｖｉｒｕｌｅｎｃｅｇｅｎｅｓ（ｐｔｆＡ，ｐｆｈＡ，ｓｏｄＡ，ｐｌｐＢ，ｔｏｎＢ，ｎａｎＨ）；ｄｒｕｇｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙｔｅｓｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｂａｃｔｅｒｉａｗａｓｓｅｎｓｉｔｉｖｅｔｏ１０ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌｄｒｕｇｓａｎｄｒｅｓｉｓｔａｎｔｔｏ７ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌｄｒｕｇｓｏｕｔｏｆ２２ｔｅｓｔｄｒｕｇｓ．Ｔｈｅａｎｉｍａｌｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎｔｅｓｔｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｂａｃｔｅｒｉａｃｏｕｌｄｌｅａｄｔｏｈｅｍｏｒｒｈａｇｅｉｎｔｈｅｌｕｎｇｓｏｆｔｈｅｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｐｉｇｓａｎｄｂｌｏｏｄｙｆｏａｍｉｎｔｈｅｔｒａｃｈｅａ；ａｎｄｔｈｅｒｅｗｅｒｅｂｌｕｎｔｌｙｒｏｕｎｄｅｄｂａｃｉｌｌｉａｔｂｏｔｈｅｎｄｓｉｎｔｈｅｌｉｖ ｅｒｔｉｓｓｕｅｓ，ｗｈｉｃｈｓｕｇｇｅｓｔｓｔｈａｔｔｈｅｉｓｏｌａｔｅｈａｓａｓｔｒｏｎｇｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ．Ｉｎｔｈｉｓｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ，ａｐｏｒｃｉｎｅｃａｐｓｕｌｅｓｅｒｏｔｙｐｅＡＰａｓｔｅｕ ｒｅｌｌａｍｕｌｔｏｃｉｄａｆｒｏｍＳｉｃｈｕａｎｗａｓｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙｉｓｏｌａｔｅｄａｎｄｉｔｓｂａｃｔｅｒｉａｌｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓｗｅｒｅｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ，ｗｈｉｌｅｔｈｅｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｍｏｄｅｌｏｆＰａｓｔｅｕｒｅｌｌａｍｕｌｔｏｃｉｄａｗａｓｒｅｐｌｉｃａｔｅｄｔｏｃｏｎｔｒｏｌｔｈｅｄｉｓｅａｓｅｉｎｔｈｅｆｕｔｕｒｅ．基金项目：四川省科技计划项目（重点研发项目）（２０２２ＹＦＮ０００７）１试验研究ＬＩＶＥＳＴＯＣＫＡＮＤＰＯＵＬＴＲＹＩＮＤＵＳＴＲＹＮｏ．１１，２０２３Ｋｅｙｗｏｒｄｓ　Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａｍｕｌｔｏｃｉｄａ；ｉｓｏｌａｔｉｏｎａｎｄｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ；ｖｉｒｕｌｅｎｃｅｇｅｎｅ；ｄｒｕｇｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙｔｅｓｔ；ａｎｉｍａｌｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎｄｏｉ：１０．１９５６７／ｊ．ｃｎｋｉ．１００８ ０４１４．２０２３．１１．００１　引言多杀性巴氏杆菌（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａｍｕｌｔｏｃｉｄａ，Ｐｍ）是两端钝圆的革兰阴性小杆菌或小球菌，为条件致病菌常存在于动物和人的呼吸道中，当宿主抵抗力下降时或受到其他影响便会引发感染，感染的宿主有广泛性，包括牲畜、家禽和野生动物等。

猪多杀性巴氏杆菌的分离鉴定及药敏试验林跃华【摘要】从福建省某猪场发生以呼吸道病为主要特征的病死猪脏器中分离到1株可疑菌，通过细菌分离和纯培养、涂片镜检、生化试验、小鼠致死性试验、药敏试验，并设计1对检测猪多杀性巴氏杆菌的引物，对可疑菌做PCR检测。

结果表明，可疑菌对小鼠有致死毒力；PCR检测结果与生化鉴定结果符合，可疑菌为猪多杀性巴氏杆菌；药敏试验检测结果显示，该菌对先锋霉素Ⅴ、阿米卡星、氟哌酸、氯霉素和庆大霉素高度敏感。

【期刊名称】《养猪》【年(卷),期】2016(000)002【总页数】3页(P94-96)【关键词】多杀性巴氏杆菌;分离鉴定;PCR;药敏试验【作者】林跃华【作者单位】福建省漳州市农业局漳州市动物疫病预防控制中心，福建漳州363000【正文语种】中文【中图分类】S858.28多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida,Pm）对多种动物均有致病性，属于巴氏杆菌科，主要使动物发生传染性肺炎或出血性败血症，感染猪后引起猪肺疫和猪传染性萎缩性鼻炎，是诱发猪呼吸道病综合征的重要致病因子之一，猪传染性萎缩性鼻炎主要是由产毒素多杀性巴氏杆菌或支气管败血波氏杆菌（主要是D型）引起的，而猪肺疫一般是由非产毒素多杀性巴氏杆菌引起的。

该菌正常存在于多种动物的口腔和咽部黏膜，当动物处于应激状态和机体抵抗力下降时细菌大量繁殖并致病，发生内源性感染[1]，可与猪伪狂犬病、猪传染性胸膜肺炎、猪链球菌病、猪喘气病等发生混合感染或继发感染[2]。

近年来，福建地区部分规模养殖场受多杀性巴氏杆菌与其他病毒和细菌混合感染和继发感染的侵害呈逐年上升趋势，为此，本次对福建地区的多杀性巴氏杆菌进行了分离鉴定、PCR检测及药物敏感性等试验，为该区域的猪群体感染多杀性巴氏杆菌病的治疗和预防提供参考。

1.1 病料来源及试验时间、地点2015年10月份，福建省某猪场的临床患病小猪，以10%甘油生理盐水浸润棉签采集鼻腔深部的分泌物，解剖病危小猪，采集肺脏、气管和淋巴结做病原诊断。

一株牛源A型多杀性巴氏杆菌的分离与鉴定作者：唐光凤来源：《畜牧兽医科学》 2019年第3期唐光凤（重庆市大足区龙水镇畜牧兽医站，重庆 402360）摘要：对重庆市某牛场运输后的牛的鼻拭子进行病原分离，对其进行培养形态及染色、动物致病性情况观察及16SrRNA序列分析，初步鉴定为牛多杀性巴氏杆菌（PM）。

利用PM种特异性引物及荚膜血清特异性引物进行PCR扩增，均得到目的基因条带。

由此确定分离菌株为牛荚膜A型巴氏杆菌。

关键词：牛A型巴氏杆菌；分离鉴定；LD50；耐药性中图分类号：S852.61文献标识码：Bdoi：10.3969/j.issn.2096-3637.2019.03.0070 引言多杀性巴氏杆菌是引起多种动物巴氏杆菌病（又称出血性败血症）的病原菌，属于革兰氏阴性菌。

根据其荚膜抗原不同分为A、B、D、E、F 5种血清型，A型主要引起牛呼吸道系统疾病，导致牛肺炎，也有称船运热或运输热等，给养殖业带来了严重的经济损失。

从重庆某牛场运输回来的健康牛，由于高温、暴雨的不断交替，一头牛表现出体温升高，呼吸困难，少食，胸部叩诊呈浊音，有疼感，肺部听诊有支气管呼吸音及水泡性杂音。

采集该牛的鼻拭子，采用常规多杀性巴氏杆菌分离鉴定方法，并结合16SrRNA及种特异性基因Kmt1扩增分析，确定分离菌，进一步采用荚膜血清型特异性基因扩增分析，确认分离菌血清，从一头健康牛的鼻拭子分离得到A型多杀性巴氏杆菌。

1 材料1.1 病料采集无菌采集重庆市某牛场运输后的鼻拭子。

1.2 试验动物体重18～22 g昆明鼠购自重庆中药研究所。

1.3 试剂与材料医用无菌棉签购自重庆市宏冠医疗设备有限公司，马丁氏肉汤购自青岛高科技工业园海博生物技术有限公司，琼脂粉购自成都市科龙化工试剂厂，药敏片购自杭州微生物试剂有限公司，Proteinase K、细菌基因组DNA快速提取试剂盒，购自天根生物科技有限公司；L2000DNA Marker购自宝生（大连）工程有限公司，16SrRNA购自上海生工生物技术有限公司。

禽多杀性巴氏杆菌病病原的分离鉴定和药敏试验1 巴氏杆菌属概述巴氏杆菌［1］属(Pasteurella )分类地位未定的1属，为无芽孢，不运动，兼性厌氧，菌体两端常染色浓重的革兰氏染色阴性小杆菌［2］，因1880 年巴斯德氏首先自病鸡分离到本属中的多杀巴氏杆菌而得名。

［3］该属已确定的种有多杀巴氏杆菌、嗜肺巴氏杆菌、溶血巴氏杆菌、尿巴氏杆菌和鸭疫巴氏杆菌等。

属中的多杀巴氏杆菌危害畜、禽最严重，主要引起动物发生出血性败血症。

从发病动物体液或组织中培养分离到的菌落基本有两型：一为在过45°折光，低倍显微镜下，呈现鲜明的蓝绿色而带金光，边缘有狭窄的红黄色带的Fg 菌落型，相当于血清型乙型；另一为在45°折光下，低倍显微镜下，菌落呈现橘红色、边缘稍带狭窄的黄绿光的F0菌落型，相当于血清型甲型［4］。

在中国，牛、猪、驴和马的多杀巴氏杆菌病绝大多数为Fg型菌所致，家禽流行性巴氏杆菌病都是F0型菌所致［5］。

多杀巴氏杆菌菌体抗原有12个型，荚膜抗原有5 个型，前者以阿拉伯数字表示，后者以英文大写字母表示，如1：A，2; A，1：B等，已知组成的菌型有16个。

本菌血清型与宿主的分布有一定关系，其细胞壁含有明显的内毒素活性，但未发现外毒素。

本菌可引起家禽霍乱的暴发性流行，牛的出血性败血病、原发性或继发性肺炎等，国外免疫用的菌苗以加不同佐剂的灭活菌为主，也使用禽霍乱弱毒活菌，中国已于1959年使用弱毒活苗[6] 。

2 多杀性巴氏杆菌及其危害多杀性巴氏杆菌( Pasteurella multocida ，Pro )是一种重要的病原菌，对多种动物和人均有致病性，可以导致猪肺疫、禽霍乱、牛羊兔出血性败血症等危害严重的畜禽传染病。

多杀性巴氏杆菌正常存在于多种健康动物的肺和咽喉部黏膜，当动物处于应激状态、机体抵抗力低下时，细菌侵入体内，大量繁殖并致病，发生内源性传染。

此菌类在同种或不同种动物间可相互传染，蝉和蚤被认为是自体传播的媒介昆虫[7] 。

我国部分地区禽多杀性巴氏杆菌的分离鉴定及耐药情况分析作者：严专强麦凯杰罗翠芬周祺杨德鸿申翰钦周庆丰来源：《家禽科学》2021年第11期摘要：为调查禽多杀性巴氏杆菌的流行情况，本研究从我国华东、华南和西南等区域8个省市家禽养殖场疑似禽霍乱发病群中分离出17株多杀性巴氏杆菌。

血清型鉴定发现所有分离株均为荚膜A型。

药敏结果显示分离株对阿莫西林、氨苄西林、头孢曲松、头孢吡肟和复方新诺明等药物敏感，对卡那霉素、四环素、庆大霉素和链霉素等药物耐药。

关键词：多杀性巴氏杆菌;分离鉴定;血清型;耐药性中图分类号：S858.31 文献标识码：B 文章编号：1673-1085（2021）11-0045-06多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida， PM）是引起禽类禽霍乱、猪萎缩性鼻炎、牛羊出血性败血症等疾病的重要致病菌，家禽急性感染通常可见肺部出血，肝脏、脾脏有大量白色坏死点，死亡率较高[1]。

多杀性巴氏杆菌的血清型根据荚膜抗原可分为A、B、D、E和F五个型，禽霍乱常由A和F型多杀性巴氏杆菌引起[2]。

根据血清型制备灭活疫苗进行免疫是一种有效的预防措施，由于疫苗对异源血清型菌株的保护有限，因此监测流行菌株的血清型非常有必要。

临床生产中多用抗生素进行治疗，随着菌株对常用药物敏感性的降低，药物治疗越来越困难。

本研究通过调查不同地区禽多杀性巴氏杆菌的流行血清型和耐药情况，旨在为临床禽霍乱疾病的防治提供参考。

1 材料和方法1.1 主要试剂TSA（Tryptic Soy Agar）和TSB（Tryptic Soy Broth）培养基，购自美国BD公司;胎牛血清，购自内蒙古金源康生物工程有限公司;2 × PCR mix，购自南京诺唯赞生物科技有限公司;药敏片，购自杭州滨和微生物试剂有限公司。

1.2 样本采集与细菌分离2018～2021年从浙江、福建、广东、江苏、四川、重庆、湖南和贵州8个省市的规模化养殖场采集疑似禽霍乱发病禽群肝脏或头部样品共17份，并将采集的样品于2～8 ℃条件下当天带回实验室进行瑞氏染色镜检和细菌分离。

一例禽多杀性巴氏杆菌的分离与鉴定作者：党媛来源：《现代畜牧科技》2019年第10期摘要：禽多杀性巴氏杆菌是引起各种禽类巴氏杆菌病的病原菌。

禽巴氏杆菌病（即禽霍乱、禽出血性败血症）是一种急性、败血性、接触性传染病，该病的流行具有发病快、病程短、发病率和死亡率高等特点。

禽多杀性巴氏杆菌为条件性致病菌，当饲养管理突变、气候突变、长途运输等外界诱因出现时容易暴发，当前禽巴氏杆菌病常呈地方流行或散发流行，尤以成年鸡最为常见。

笔者对采集的一例疑似禽巴氏杆菌病的病料，通过病原菌分离培养、实验室鉴定及药敏试验等研究，对疫情的诊治提供了科学的依据，并针对当前多杀性巴氏杆菌临床上的药物滥用、耐药性严重等问题进行简要分析，旨在为各养殖单位健康发展提供参考。

关键词：禽;多杀性巴氏杆菌病;分离;鉴定中图分类号：S831文献标识码：B文章编号：2095-9737（2019）10-0030-021;样品来源与试剂病料采自青海省西宁市某规模化养鸡场疑似禽多杀性巴氏杆菌感染的病死鸡肝脏组织。

培养基及试剂主要有胰蛋白大豆琼脂培养基（TSA）、胰蛋白大豆肉汤培养基（TSB）培养基、新生牛血清、2×Taq PCR Master Mix、DNA Marker、革兰氏染色液、细菌药敏纸片等。

2;实验室检测2.1;细菌分离培养将采集的肝脏组织划线接种于含2%新生牛血清的TSA平板、麦康凯平板上，37℃培养18 h后，观察菌落形态，在TSA平板上出现淡灰白色、圆形、表面光滑、边缘整齐、湿润、半透明菌落，麦康凯平板上无菌落。

挑取TSA平板上可疑单菌落传代培养，并对典型的疑似菌落进行革兰氏染色，油镜下观察细菌染色特点及形态，镜下可见两端钝圆、两极浓染、革兰阴性小杆菌。

2.2;生化试验根据说明书，取分离菌株纯培养物分别接种葡萄糖、麦芽糖、果糖、乳糖、蔗糖、甘露醇、山梨醇、肌醇、VP、硫化氢、赖氨酸和鸟氨酸、尿素酶等生化管。

生化试验结果显示该分离株可发酵葡萄糖、果糖、蔗糖、山梨醇，不发酵麦芽糖、乳糖、甘露醇、肌醇，VP、硫化氢、赖氨酸和鸟氨酸反应均为阴性，这与多杀性巴氏杆菌生化特征相符。

现代农业科技2023年第6期动物科学牛多杀性巴氏杆菌未知型的分离鉴定及防治汪阳1马艳荣2仲荣3金映红4李威2薛晶4汪萍4陈古丽4颜成旭2马丽梅2夏俊4*（1新疆农业大学，新疆乌鲁木齐830000；2新疆维吾尔自治区动物卫生监督所，新疆乌鲁木齐830000；3阿勒泰地区畜牧工作站，新疆阿勒泰836500；4新疆畜牧科学院兽医研究所（新疆畜牧科学院动物临床医学研究中心），新疆乌鲁木齐830000）摘要以病死牛病变肺脏组织为研究对象，通过革兰氏染色和PCR鉴定确定多杀性巴氏杆菌分离株的血清型，进行分离菌株的小鼠致病性试验和药敏试验。

结果表明：该分离菌株为未知型多杀性巴氏杆菌，对硫酸阿米卡星、左氧氟沙星、硫酸庆大霉素、乳酸环丙沙星高度敏感；小鼠多杀性巴氏杆菌最小致死量为1.2×108CFU/mL。

关键词牛；多杀性巴氏杆菌；分离鉴定；防治中图分类号S858.23文献标识码A文章编号1007-5739（2023）06-0176-03DOI：10.3969/j.issn.1007-5739.2023.06.045开放科学（资源服务）标识码（OSID）：Isolation,Identification and Control of Unknown Type of Pasteurella multocida in Cattle WANG Yang1MA Yanrong2ZHONG Rong3JIN Yinghong4LI Wei2XUE Jing4WANG Ping4CHEN Guli4YAN Chengxu2MA Limei2XIA Jun4*(1Xinjiang Agricultural University,Urumqi Xinjiang830000;2Xinjiang Uygur Autonomous Region Animal Health Supervision Institute,Urumqi Xinjiang830000;3Altay Prefecture Animal Husbandry Workstation,Altay Xinjiang836500;4Institute of Veterinary Medicine,Xinjiang Academy of Animal Science(Animal Clinical Medical Research Center,Xinjiang Academy of Animal Science),Urumqi Xinjiang830000)Abstract In this paper,diseased lung tissue of dead cattle was taken as the research object.The serotype of Pas-teurella multocida isolated strain was determined by Gram′s stain and PCR identification,and then pathogenicity test and drug sensitivity test of the isolated strain were carried out in mice.The results showed that the isolated strain was Pasteurella multocida of unknown type,which was highly sensitive to amikacin sulfate,levofloxacin,gentamycin sulfate and ciprofloxacin lactate.The minimum lethal dose of Pasteurella multocida in mice was1.2×108CFU/mL.Keywords cattle;Pasteurella multocida;isolation and identification;control基金项目新疆维吾尔自治区区域协同创新专项（科技援疆计划）（2021E02032）；2022年新疆维吾尔自治区中央引导地方项目（ZYYD2022B16）；新疆维吾尔自治区重大科技专项“新疆畜禽疫病防控体系质量提升工程”（2022273334）；新疆维吾尔自治区天山英才青年科技拔尖人才项目（青年科技创新人才培养）“牛羊幼畜群发病防控关键技术研究”（2022196128）。

安徽科技学院学报,2020,34(6):6-11JournalofAnhuiScienceandTechnologyUniversity猪源多杀性巴氏杆菌的分离及毒力基因检测郭伟娜，胡明静，赵霞，路振香，顾有方（安徽科技学院动物科学学院，安徽凤阳233100）摘要：目的：从安徽凤阳猪场采集鼻拭子样品进行多杀性巴氏杆菌（Pm）分离鉴定和毒力基因检测，为了解猪场Pm的存在情况及其致病性奠定基础。

方法：无菌采集猪的鼻拭子样品30份，用血琼脂培养基进行分离培养及纯化;提取分离菌的核酸作为模板，进行16S rRNA的PCR扩增及测序分析；然后用PCR 方法检测Pm菌株的23个毒力基因，最后进行小鼠致病性试验。

结果：用血琼脂培养基分离及16S rRNA 的PCR鉴定方法分离到1株Pm菌株有425bp的目的条带，其测序结果与Pm菌株VP161的同源性为99.52%；毒力基因的PCR检测结果表明，除to:A、hgbB、nanB、hsf1等5个基因未被检出外，其余18个毒力基因均被检测出目的条带，其测序结果与Pm相应毒力基因的同源性位于9&82%〜100%之间；小鼠致病性试验表明，实验组小鼠在18h内均发生死亡，其心脏、肝脏和肺脏均有出血，而对照组小鼠正常，从病死小鼠肝脏组织中分离出与原分离菌株一致的Pm菌株。

结论:本研究从猪鼻拭子样品中分离鉴定出1株Pm菌株，并检测出18个毒力基因，小鼠致病性试验表明该分离株有一定的致病性。

关键词：多杀性巴氏杆菌；分离；鉴定;毒力基因；PCR检测中图分类号：S855.1文献标志码:A文章编号：1673-8772(2020)06-0006-06DOI：10.19608/ki.16738772.2017.0860 Isolation and Virulence Gene Detection of Pasteurella Multocida from Pig GUO Weina,HU Mingjing,ZHAO Xia,LU Zhenxiang,GU Youfang (College of Animal Science,Anhui Science and Technology University,Fengyang233100,China)Abstract:Objective:Nasal swab samples were collected from a pig farm in Fengyang County of Anhui Province for isolation and identification of Pasteurella multocida(Pm)and PCR detection of virulence genes,inordertolaythefoundationforunderstandingthePmexistencesituationanditspathogenicity in pig farm.Methods:30nasal swabs of pigs were collected aseptically and isolated,cultured and purified wthbloodagarmed1um.DNAofthe1solatedbacter1awasextractedastemplateforPCRamplfcaton andsequenc1nganalys1sof16SrRNA.Then23v1rulencegenesofPm1solatonweredetectedbyPCR, andthepathogen1ctyofPm1solaton wastested1n m1ceatlast.Results:The Pm stra1n was1solated from nasal swabs by blood agar medium and identified by PCR with16S rRNA.PCR amplification of收稿日期:2020-07-13基金项目：安徽省教育厅自然科学研究重点项目(KJ2020A0087)；安徽科技学院稳定人才项目(DKWD201801)*安徽省省级大学生创新课题项目(S202010879124)+作者简介:郭伟娜(1982—),女，博士，副教授，主要从事动物病原微生物的分离鉴定及致病性研究+第34卷第6期郭伟娜，等:猪源多杀性巴氏杆菌的分离及毒力基因检测716S rRNA showed a target band of425bp,and the identity of sequence results with Pm strain VP161 was99.52%.The PCR detection results of virulence genes showed that except to:A,hgbB,nanb, hsf1,tbpA genes were not detected?the other18virulence genes were all detected?and the identity of virulence genes with Pm strains ranged from98.82%to100%.The pathogenicity test showed that the miceintheexperimentalgroupdiedwithin18hours,andtheirhearts,liversandlungswerebleeding, whilethecontrolgroup mice were normal.The Pm strain wasisolatedfromthelivertissuesofdead mice?which was consistent with the original isolation.Conclusion:One strain of Pm was isolated from nasalswabsoBpigs,18virulencegenesweredetectedbyPCR,andthepathogenicitytestinmiceshowed thattheisolationhadcertainpathogenicity.Key words：Pasteurella multocida*Isolation；Identification；Virulence genes；PCR detection多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida?Pm）是健康动物上呼吸道的一种正常寄生性细菌⑴，但也是许多动物的潜在病原体,与多种动物的呼吸道综合征有关+当动物机体受到多种应激因素作用时,或者机体的免疫功能低下，主要引起猪萎缩性鼻炎、猪肺疫、禽霍乱和牛出血性败血症等多种病症23+多杀性巴氏杆菌血清型较多，根据荚膜抗原的不同,可分为A、B、D、E和F共5个血清型，根据脂多糖结构不同可分为16个血清型4+不同荚膜血清型的Pm可感染猪、禽、牛等多种动物，其中血清型A、B、D均可诱发猪的疾病，其中A和D血清型主要引起猪肺炎，而B血清型引起猪出血性败血症5；与禽类相关的主要是A血清型?而感染牛的主要是A和D血清型+多杀性巴氏杆菌的致病性与多种毒力因子有关，主要包括皮肤坏死毒素、黏附素、铁摄取蛋白、外膜蛋白、唾液酸酶等其中皮肤坏死毒素是由o：A基因编码，与黏附素相关的编码基因包括pfA、fmA、fp1、fp2、hf1和hf2等，与铁摄取蛋白有关的编码基因有tonB、e/B、e/D、/pA、hgbA、hgbB、Fur等，与外膜蛋白有关的编码基因有ompA、ompH、oma87、plpB等,编码唾液酸酶的基因主要为nanB和nanH o多杀性巴氏杆菌的致病性与病原菌的毒力、数量、侵入途径以及机体的免疫力和环境因素等有关，而含有毒力因子不同对其致病性有重要作用+目前,我国的猪病发生多表现为混合感染，及时检出隐性带菌的动物，对猪场疾病的防控有重要意义+因此，本研究主要是采集安徽凤阳地区某猪场的鼻拭子进行Pm的分离，用PCR方法检测分离菌株的23个毒力基因，从而为研究多杀性巴氏杆菌的致病性提供一定参考+1 材料与方法1.1材料荚膜血清A型猪源Pm（CVCC401，中国兽药监察所）;实验用清洁级昆明小鼠及垫料（合肥博源动物实验有限公司）；血琼脂培养基（常德比克曼生物科技有限公司）；PCR MasterMix,5X TAE缓冲液, DL-2000DNA Marker等（南京迈克沃德生物科技有限公司）。