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酸奶中乳酸菌的分离与纯化一、实验目的1.掌握分离乳酸菌的基本原理和操作技术；2.学习并掌握稀释法和微生物纯培养操作。
二、实验设备及材料培养基材料：牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、番茄汁、葡萄糖、吐温、溴甲酚绿、琼脂。
实验材料：无菌水、培养皿、电热套、高压蒸汽灭菌锅、电子分析天平、涂布棒、酒精灯、无菌试管、移液枪、无菌吸管。
三、实验原理乳酸菌指发酵糖类主要产物为乳酸的一类无芽孢、革兰氏染色阳性细菌的总称。
大多数不运动，少数以周毛运动。
菌体常排列成链。
根据细胞形态分为球状或杆状，可分为两大类，即乳酸链球菌和乳酸杆菌。
在乳酸菌培养基平板上，乳酸菌菌落大约1～3mm，圆形隆起，表面光滑，呈乳白色、灰白色或暗黄色；在产酸周围还能产生CaCO3溶解圈。
乳酸菌革兰氏染色后呈蓝色，为革兰氏阳性菌。
四、实验步骤1.乳酸菌培养基的制作配方蛋白胨 2.0g酵母膏 2.0g番茄汁40g葡萄糖 2.0g吐温0.10mL碳酸钙 3.4g溴甲酚绿0.02g琼脂2～4g水200mL①称量：按照培养基配方依次称取药品放入烧杯中。
②熔化：在烧杯中加入略少于200mL水，加热至沸腾。
依次加入药品，用玻璃棒不断搅拌，待其完全溶解后，加入琼脂，搅拌至完全熔化，最后补足所损失的水分。
③分装：将配置的乳酸菌培养基装入三角瓶中。
④加棉塞、包扎⑤灭菌：将乳酸菌培养基在压力0.11MPa，温度121℃条件下灭菌20min。
⑥无菌检查2.倒平板将乳酸菌培养基熔化，待冷却至55～60℃时，倒平板，倒好后，在室温下培养2～3d，或37℃培养24h，检查无菌落及皿盖无冷凝水后再使用。
3.制备稀释液量取酸奶10mL，放入盛有90 mL无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶中，震摇约20min，使酸奶与无菌水充分混合，将酸奶分散。
用一只1 mL无菌吸管从中吸取1 mL酸奶悬浊液注入盛有9 mL无菌水的试管中，吹吸三次，使充分混匀。
然后再用一支1 mL无菌吸管从此试管中吸取1 mL注入另一盛有9 mL无菌水的试管中，以此类推，制成10−3、10−4、10−5各种稀释度的酸奶稀释液。
1、分离培养基采用MRS培养基, 分离培养基中添加溴甲酚紫作为指示剂;采用稀释平板涂布法进行平板涂布分离, 挑取直径在115mm以下能使培养基中溴甲酚紫变红或变黄的单菌落, 菌落表面光滑的菌株，采用划线法进行分离纯化，获得纯种。
2、MRS 固体培养基：蛋白胨10g，肉膏10g，酵母提取物5g，柠檬酸二铵2g，乙酸钠5g，K2HPO4 2g，MnSO4·4H2O 0.25g，MgSO4·7H2O 0.58g，葡萄糖20g，吐温80 1mL，琼脂25g，水1000mL。
调pH6.2～6.4，1% CaCO3，121℃灭菌15min。
改良MRS培养基：向MRS培养基中加入1% CaCO3。
10 倍比稀释至10-10，分别吸取稀释液各0.2mL，涂布于含钙MRS 培养基平板上，37℃静置培养48h。
挑取含钙培养基上具有明显钙溶圈的菌落，划线分离纯化2~3 次，最后选择单菌落，经镜检确认为纯种3、MRS 固体培养基: 蛋白胨10g, 牛肉膏10g, 酵母提取物5g, K2HPO4 2g, 柠檬酸二铵2g, 乙酸钠5g, 葡萄糖20 g, 吐温-801mL, MgSO4 #7H2O 0.5g, MnSO4 0.25g, 琼脂25g，蒸馏水1000mL, pH6.2~ 6.4, 3%的CaCO3, 121℃灭菌20min。
稀释倾倒平板法分别接种于MRS固体培养基上，30 ℃培养24h30℃培养24h, 在MRS+3%CaCO3 固体培养基上形成明显的透明圈, 表面光滑湿润。
45、培养基MRS液体培养基(pH5. 0) , 富集培养用; 改良MRS固体培养基(pH6.8) : 在培养基成分中,加入2%的CaCO3菌种分离方法先在MRS( pH5. 0) 液体培养基中进行富集培养, 18～24h后采用改良的MRS固体培养基进行稀释平板法分离,挑取生长在平板中下层且具溶钙圈的乳白色菌落,按常规方法进行纯化,获得纯菌。
一、实验目的1、学习掌握食品中乳酸杆菌的常规分离方法并作初步的鉴别。
2、学会十倍系列稀释和倒平板的方法。
二、实验原理乳酸杆菌为厌氧和微好氧菌，革兰氏染色阳性，可以发酵葡萄糖或乳糖产生乳酸，并将培养基中的碳酸钙溶解。
有些菌如保加利亚乳杆菌在15℃时不生长，在45℃甚至50℃时生长，最适生长温度为40—43℃；而有些菌如植物乳杆菌在15℃生长，45℃时一般不生长，最适生长温度为30℃左右。
通常我们利用这些特点可作初步的鉴别。
二、实验原理三、实验材料和仪器1、酸牛奶1瓶，泡菜汁1管，9ml生理盐水5管，MRS培养基100ml，灭菌CaCO3 3克（用纸包）。
2、40℃和30℃恒温箱，振荡器，超净工作台，1ml 无菌吸管5支，培养皿6套，革兰氏染色液1套。
四、实验方法与步骤1. 将酸奶和泡菜汁分别制成10倍系列稀释液。
2. 取适当稀释度之稀释液0．5或1ml于培养皿中。
3. 以无菌操作把无菌CaCO3 加入融化了的MRS培养基中，于自来水中迅速冷却培养基至45℃左右。
轻摇使CaCO3混均，但不得产生气泡。
立即倒入培养皿中，摇匀。
4. 待培养基凝固后，倒置放于40℃和30℃恒温箱中培养（酸牛乳样品在40℃下培养；酸泡菜汁样品在30℃下培养）五、实验结果观察24或48小时后取出检查。
（1）泡菜汁样品中，菌落周围产生CaCO3圈，菌落直径为1～3mm，乳白色偶有浓色或暗黄色。
用接种环挑少许涂片。
革兰氏染色镜检为G+，菌体大小约0.9～1.2×3～8μm，单生，成对或短链。
五、实验结果观察24或48小时后取出检查。
（2）酸牛奶样品中菌落直径1～3mm，无色素，呈白色至淡灰色。
通常菌落表面粗糙，革兰氏染色镜检为G+，细胞宽2μm，细胞较长有时呈线形，幼龄培养物中单生或成对。
五、实验结果观察六、思考题1、融化后的培养基为什么要迅速冷却到50℃左右倒平板？2、培养基中加入CaCO3的目的是什么？谢谢。
蜜蜂蜜囊中乳酸菌资源的分离鉴定1. 引言蜂蜜是一种由蜜蜂从花中采集的花蜜经过加工而成的天然食品。
而在蜂巢中，蜂蛹孵化时会产生乳酸菌。
乳酸菌是一类对人体有益的微生物，具有调节肠道菌群、促进消化吸收等功能。
因此，研究蜂巢中乳酸菌资源对于开发新型功能性食品具有重要意义。
本文旨在通过分离和鉴定蜂巢中的乳酸菌资源，为进一步研究其应用提供基础数据。
2. 方法2.1 样品采集和处理从不同地区的养殖场采集新鲜的蜂巢样品，并将其放入无菌容器中。
将样品运回实验室后，在无菌条件下进行处理。
2.2 分离乳酸菌取适量的样品，在无菌条件下将其制成10倍稀释液，并进行连续稀释。
然后取适量稀释液接种于MRS琼脂培养基中，利用平板法进行分离。
2.3 纯化乳酸菌从培养基上挑选出单个菌落，通过多次传代，获得纯种乳酸菌。
将其接种于MRS液体培养基中，并在37°C恒温摇床上静置培养。
2.4 鉴定乳酸菌2.4.1 形态学特征观察取适量的培养液制成涂片，并在显微镜下观察乳酸菌的形态特征，包括细胞形状、大小和排列方式等。
2.4.2 生理生化特性检测利用常规生理生化方法对纯化的乳酸菌进行检测。
包括对气体生成、嗜热性、嗜酸性、产气和产色素等方面进行观察。
2.4.3 生物学试验采用API 50 CHL系统对乳酸菌进行生物学试验。
根据系统提供的方法和试剂，进行碳水化合物发酵、氧需求量、抗生素敏感性等方面的检测。
3. 结果与讨论3.1 分离乳酸菌经过连续稀释和平板分离，从蜂巢样品中成功分离出多个乳酸菌菌落。
3.2 鉴定乳酸菌3.2.1 形态学特征观察观察发现，乳酸菌呈短杆状或球状，大小约为0.5-2微米。
排列方式不规则。
3.2.2 生理生化特性检测乳酸菌在培养基中产生大量气泡，并且对高温和低pH值具有较好的适应能力。
在培养基上没有观察到产色素的现象。
3.2.3 生物学试验通过API 50 CHL系统检测，发现蜂巢中的乳酸菌能够利用多种碳水化合物进行发酵，并且对氧需求量较低。
发酵食品中乳酸菌的分离与鉴定乳酸菌是一类重要的微生物，在食品发酵过程中扮演着不可替代的角色。
乳酸菌不仅能够提高食品的营养价值，还具有促进肠道健康、增强免疫力等益生作用。
因此，分离和鉴定发酵食品中的乳酸菌是食品科学领域中的一项重要研究内容。
要进行乳酸菌的分离与鉴定，首先需要从发酵食品样品中分离乳酸菌。
一般而言，我们可以选择将样品通过稀释后接种于选择性培养基上，以便只有乳酸菌能够生长。
接种后，将培养基放置于适宜的温度下，培养一段时间。
乳酸菌具有较强的酸性产生能力，因此在培养过程中会形成明显的酸性环境。
可通过测量培养基的pH值来初步判断是否有乳酸菌生长。
在分离乳酸菌的培养基上，我们可能会观察到许多不同形态的菌落。
这些菌落在形状、颜色、质地等方面可能存在差异。
我们可以选择几个具有代表性的菌落进行后续的鉴定。
对于乳酸菌的鉴定，有许多方法可供选择。
一种常用的鉴定方法是形态学观察。
乳酸菌具有一些特征性的形态特征，如菌落的形状、边缘的特点、质地的柔软程度等。
此外，乳酸菌的细胞形态也具有一定的特征，如形状、大小、胞内结构等。
通过在显微镜下观察乳酸菌的形态特征，可以初步判断其种属。
除了形态学观察外，乳酸菌的生理生化特性也是鉴定的重要依据。
例如，乳酸菌通常能够在不产生气体的条件下发酵葡萄糖。
此外，乳酸菌对于一些特定的碳源、氮源等具有较强的利用能力。
通过对乳酸菌进行代谢特性的测试，可以进一步确认其种属。
分子生物学方法也为乳酸菌的鉴定提供了新的手段。
通过对乳酸菌的DNA进行提取和PCR扩增，可以得到乳酸菌的16S rRNA序列。
将这些序列与已知种属的乳酸菌进行比对，可以准确鉴定乳酸菌的种属。
在发酵食品中，常常存在多种乳酸菌同时存在的情况。
因此，对于从发酵食品中分离到的乳酸菌，进行种属鉴定是至关重要的。
只有确定了乳酸菌的种属，才能更好地利用其在食品工业中的潜力。
发酵食品中乳酸菌的分离与鉴定是一项科学而有趣的工作。
通过对乳酸菌的研究，我们可以更好地了解乳酸菌在食品发酵过程中的功能和作用，为食品工业的发展提供更多的可能性。
乳酸细菌分类鉴定及实验方法乳酸细菌是一类可以发酵果糖或蔗糖产生乳酸的革兰氏阳性细菌。
它们广泛存在于自然界中的土壤、水体、动物肠道、植物表面等环境中，并且在食品加工、乳制品、膳食补充剂等领域具有重要的应用价值。
分类鉴定乳酸细菌的方法主要包括传统分离鉴定和分子生物学方法，而实验方法主要包括培养、生理生化鉴定和分子鉴定等。
1.传统分离鉴定传统分离鉴定是通过培养、生理生化特性的观察和细菌形态学特征的分析来进行分类鉴定的方法。
一般的步骤包括：1.2分离：采用适当的培养基，如MRS培养基等，在适当条件下进行分离培养。
可以采用不同的稀释度和培养温度来增加分离率和适应性。
1.3纯化：从培养出的菌落中选择纯净的菌落进行纯化。
1.4形态学观察：观察细菌的形态学特征，如菌落形态、细胞形态、孢子形态等。
1.5生理生化特性鉴定：通过生理生化实验，如氧需氧性、产气、产酸、碱性产蛋白酶等特性的鉴定来进一步确定细菌的分类。
1.6比较分析：将鉴定结果与已知的乳酸菌进行比较分析，以确定菌株的分类。
2.分子生物学方法分子生物学方法是一种快速、准确的分类鉴定方法，可以通过检测细菌的DNA序列来进行鉴定。
常用的分子生物学方法包括PCR、16SrRNA测序和随机扩增多态性DNA(RAPD)等。
2.1PCR：PCR是通过扩增细菌DNA的特定区域来进行鉴定的方法。
首先，从培养的细菌中提取DNA。
然后，使用特定引物扩增目标区域的DNA，并通过凝胶电泳分析PCR产物的大小。
比较PCR产物的片段大小和带型模式，可以确定乳酸菌的分类。
2.216SrRNA测序：细菌的16SrRNA序列是一个高度保守的基因序列，可以用来进行细菌分类鉴定。
通过提取DNA，扩增16SrRNA基因片段，并进行测序，然后将测序结果与已知的乳酸菌序列比对，可以确定细菌的分类。
2.3RAPD：RAPD是一种无须事先了解目标序列的技术，它利用随机引物扩增细菌DNA的多态位点，通过凝胶电泳分析不同样品间的DNA带型模式，来进行菌株分类。
乳酸细菌分离鉴定实验方法1. 引言乳酸细菌是一类广泛存在于自然界中的细菌，具有产酸、发酵等特性。
它们在食品行业、农业、医药等领域起着重要作用。
乳酸细菌的分离和鉴定是开展与其相关研究的前提，本文将介绍乳酸细菌分离鉴定的实验方法。
2. 实验材料•乳酸发酵样本（如发酵米饭、酸奶等）•培养基（如MRS培养基）•罗丹明B染色液•麦芽糊精琼脂培养基3. 实验步骤3.1 分离乳酸细菌1.将乳酸发酵样本取1 mL加入10 mL生理盐水中，并进行搅拌均匀。
2.连续稀释梯度：取1 mL悬浮液加入9 mL生理盐水中，得到10-1的稀释液。
重复以上步骤，分别得到10-2、10-3、10-4的稀释液。
3.取少量10^-3的稀释液在无菌工作台上平均涂布于MRS培养基上。
4.使用无菌的三角铁将MRS培养基表面的细菌均匀划开，使得每个细菌分离单元上只有一种细菌。
5.将培养皿倒置放入恒温培养箱中，在37摄氏度下静置24至48小时。
3.2 鉴定乳酸细菌1.观察培养基上的菌落情况，通过形态特征初步判断乳酸细菌。
2.选择培养良好的单独菌落，采用罗丹明B染色法进行初步鉴定。
–取适量的培养菌落，加入1滴罗丹明B染色液，静置5分钟。
–在显微镜下观察染色后的细菌形态，乳酸细菌通常为革兰氏阳性菌（呈现红色染色）。
3.选择阳性菌落上悬浮液进行传代培养。
–取适量的菌落悬浮液，加入新的MRS培养基中，静置24至48小时。
4.进行进一步的鉴定。
–利用麦芽糊精琼脂培养基，通过观察菌落特征鉴定乳酸细菌的种类。
4. 结果分析与讨论通过上述方法，我们可以成功地分离和鉴定乳酸细菌。
乳酸细菌的分离是通过连续稀释梯度和培养基平板法实现的。
鉴定乳酸细菌主要基于其形态特征和罗丹明B染色结果。
进一步通过传代培养和麦芽糊精琼脂培养基来鉴定乳酸细菌的种类。
然而，需要注意的是，乳酸细菌有多个物种，每个物种的生理特性可能有所不同。
因此，在进行鉴定时应结合其他实验方法，如生理生化测试、基因测序等，以进一步明确鉴定结果。
实验十一酸奶中乳酸菌的分离纯化一、实验目的学习从新鲜酸乳中进行乳酸菌的分离纯化的方法，并进一步了解乳酸菌的生长特性。
二、实验材料和用具嗜热乳酸链球菌（Streptococcus thermophilus）、保加利亚乳酸杆菌（Lactobacillus casei），乳酸菌种也可以从市场销售的各种新鲜酸乳或酸乳饮料中分离。
BCG牛乳培养基、乳酸菌培养基（CMRS）、脱脂乳粉、高压蒸汽灭菌锅、超净工作台、培养箱、酸乳瓶（200 - 280mL）、培养皿、试管、300mL三角瓶。
三、操作步骤1.分离：取市售新鲜酸乳液稀释至10-5，取其中的10-4 10-5 2个稀释度的稀释液各0.1-0. 2mL，分别接入BCG牛乳培养基琼脂平板上，用无菌涂布器依次涂布；或者直接灌注法分离，置40℃培养48h，如出现圆形稍扁平的黄色菌落及其周围培养基变为黄色者初步定为乳酸菌。
2.鉴别选取乳酸菌典型菌落转至脱脂乳试管中，40℃培养8-24h，若牛乳出现凝固，无气泡，呈酸性，涂片镜检细胞杆状或链球状（两种形状的菌种均分别选入），革兰氏染色呈阳性，则可将其连续传代4-6次，最终选择出在3-6h能凝固的牛乳管，作菌种待用。
四、注意事项采用BCG牛乳培养基琼脂平板筛选乳酸菌时，注意挑取典型特征的黄色菌落，结合镜检观察，有利高效分离筛选乳酸菌。
BCG牛乳培养基（A）溶液：脱脂乳粉100g，水500Ml，加入1.6%溴甲酚绿（B. C. G）乙醇溶液1mL，80℃灭菌20min。
（B）溶液：酵母膏10g，水500mL，琼脂20g，pH 6.8，121℃湿热灭菌20min。
以无菌操作趁热将（A)、（B）溶液混合均匀后倒平板。
乳酸菌培养基（CMRS）蛋白胨5g；牛肉膏 5 g ；酵母浸膏 2.5 g ；乳糖7.5 g；土温80 0.5ml；磷酸氢二钾1g ；乙酸钠 2.5g ；柠檬酸二铵1g ；七水硫酸镁0.1g ；四水硫酸锰0.1g ；番茄汁50ml；琼脂条9g；加入500ml蒸馏水中加热溶解，调pH值为6.8，115℃，灭菌15分钟。
. . . . .... . 乳酸菌的分离、纯化与鉴定
第一部分：乳酸菌的分离、纯化 一、实验器材: 1.实验药品 新鲜乳酸饮料（市售）、脱脂奶粉、蔗糖、1.6%溴甲酚绿乙醇溶液
(溴甲酚绿、无水乙醇)、酵母膏、琼脂、革兰氏染液（结晶紫染液、卢戈氏碘液、95%乙醇、沙黄）、75%乙醇、香柏油、1mol/L NaOH、1mol/L HCl、碳酸钙； 0.4gNaOH固体、4.2ml浓HCL(分析纯) 、20gCaCO3固体、酵母膏20g 、琼脂30g 香柏油、脱脂奶粉100g 、蔗糖10g； 2.仪器与设备 高压蒸汽灭菌锅、光学显微镜、培养箱、pH试纸、酸乳瓶、培
养皿（φ9或φ12）、试管、300ml三角瓶（带玻珠）、移液管、天平、500ml锥形瓶、250ml锥形瓶、250ml烧杯。
二、实验步骤： 1.培养基配制（BCG牛乳培养基）：
（A）溶液：取脱脂乳粉100g，水500ml，加入1.6%溴甲酚氯乙醇溶液1ml，混合均匀后分装入三角瓶于高压蒸汽灭菌锅80℃灭菌20 min；（1.6%溴甲苯酚绿（BCG）乙醇溶液用1.6g溴甲酚绿加入20ml无水乙醇中，再加水至100ml制成） （B）溶液：酵母膏10g，水500ml，CaCO3 10g，琼脂20g，加热溶解，用精密pH试纸调节pH到6.8，分装入三角瓶后在103kPa 121℃高压蒸汽灭菌20Min。 以无菌操作趁热将(A)(B)溶液均匀混合。 2.药品配制 2.1 结晶紫：结晶紫乙醇饱和液（结晶紫2g溶于20ml 95%乙醇中）20ml，1%草酸氨水溶液80ml。将两液混匀，放置24小时后过滤即可。 2.2 卢哥氏碘液：碘1g，碘化钾2g，蒸馏水300ml。先将碘化钾溶于少量蒸馏水中，然后加入碘使之完全溶解，再加入蒸馏水300ml即成。 2.3 蕃红溶液：番红2.5g，95%乙醇100ml，溶解后存于密闭的棕色瓶中。用时取20ml与80ml蒸馏水混匀即可。 . . . . .... . 2.4 0.1%的吕氏美蓝染液：A液：美蓝0.3g，95%乙醇300ml；B液：0.01% KOH 100ml。混合A和B液即成，按1：100稀释即可。 2.4 生理盐水：称取9g氯化钠，溶解在少量蒸馏水中，稀释到1000毫升。 3.菌悬液的配制 取1洁净三角瓶，盛以225ml生理盐水；7只洁净试管，各盛9ml的生理盐水；加塞包扎于在103kPa 121℃高压蒸汽灭菌20Min，得到无菌生理盐水。 将酸奶样品搅拌均匀，用无菌移液管吸取样品25ml加入盛有225ml无菌生理盐水的三角瓶中，在旋涡均匀器上充分振摇，使样品均匀分散，即为10-1的样品稀释液； 将7只装9ml生理盐水的无菌试管，依次标记 10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7，再用无菌移液管吸10-1的菌悬液1ml放入依次装有9ml无菌水的试管中，稀释混匀便得到10-2稀释液，如此重复依次制得10-3～10-7的稀释液。 4.倒平板 取无菌平板12个，编号标明10-1、10-5、10-6、10-7各三套；将经高温消毒的培养基冷却到50℃左右，按无菌操作法倒12只平板，每皿约15ml；平置使培养基均匀分布在皿底，待凝固。 5.分离方法 A．平板划线 接种环挑取10-1菌液，按无菌操作对标有”10-1”的3个平板进行划操作；划线完毕后，盖上皿盖，倒置放在40℃恒温培养箱中培养48小时。 B．平板涂布 用三支1ml无菌移液管分别吸取10-5、10-6和10-7的稀释菌悬液各1ml，对号接种于与之对应的3个无菌平板中，每个平皿放0.1ml；尽快用无菌玻璃涂棒将菌液在平板上涂布均匀，平放于试验台上20 Min；然后倒置于40℃恒温箱中培养48小时。 6.脱脂乳试管的配制与灭菌 直接选用脱脂乳液或按脱脂奶粉10克与蔗糖5克，水95克（蔗糖与水的比例在1：10的围）的比例配制，装量以试管的1/3为宜，115℃灭菌15min。 7.菌落观察 . . . . .... . 恒温培养48小时过后，取出培养平板；选择菌落分布较好的平板，先对其菌落形态进行观察，初步找出乳酸菌菌落。乳酸菌的菌落很小，大约1~3 mm，园形隆起，表面光滑或稍粗糙，呈乳白色、灰白色或暗黄色；在产酸菌落周围还能产生CaCO3的溶解圈。40℃培养48h，如出现圆形稍扁平的黄色菌落及其周围培养基变为黄色者初步定为乳酸菌。 8.乳酸菌的分离纯化 选取乳酸菌典型菌落转致脱脂乳试管中，40℃培养8~24h若牛乳出现凝固，无气泡，显酸性，涂片镜检细胞杆状或链球状，革兰氏染色显阳性，则可将其连续传代3次，最终选择出在3~6h能凝固的牛乳管，作菌种待用。 9.乳酸发酵及检查 发酵：观察BCG培养基中乳酸菌菌落特征，选取长势比较好的菌落无菌操作下将乳酸菌接种于装有脱脂乳的试管中，40～42℃静止培养。 取干净载玻片一块，在载玻片中央加一滴生理盐水，无菌操作法取少量菌体涂片；结晶紫初染→碘液媒染→乙醇脱色→番红复染，干燥后用油镜观察，菌体被染成蓝紫色的是乳酸菌；其中保加利亚乳杆菌呈杆状，成单杆、双杆或长丝状；嗜热链球菌，呈球状，成对或短链或长链状。 革兰氏阳性，无芽胞的球菌或杆菌可定为乳酸菌，记录测定结果。
第二部分：乳酸菌鉴定 一、实验器材 1.蛋白胨水培养基：蛋白胨 10 g , 氯化钠 5 g , 水 1000 ml , PH : 7.2 ~ 7.4
121 摄氏度湿热灭菌 20 min 2.糖发酵培养基：蛋白胨水培养基 1000 ml , 1.6%溴甲酚紫乙醇溶液 1~2 ml ,PH : 7.6 , 另配 20%糖溶液（葡萄糖，蔗糖）各 10 ml.
3.有关试剂 1.6 % 溴甲酚紫乙醇溶液 ：溴甲酚紫 1.6 g 溶于100 ml 乙醇中，贮存于棕色瓶中保存备用。 . . . . .... . 吲哚试剂：对二甲基氨基苯甲醛 8 g , 95 % 乙醇 760 ml , 浓盐酸 160 ml. 10 % 硫酸，2 % 高锰酸钾 含氨的硝酸盐溶液 ： 称取硝酸银 2 g , 蒸馏水 100 ml ,待硝酸银溶解后，取出10 ml 备用，向其余的90 ml 硝酸银中滴加氨水，即可形成很厚的沉淀，继续滴加氨水至沉淀刚刚溶解成为澄清溶液为止，再将备用的硝酸银慢慢滴入，则溶液出现薄雾，但轻轻摇动后，薄雾状的沉淀又消失，继续滴入硝酸银，直到摇动后仍呈现轻微而稳定的薄雾状沉淀为止。
二、鉴定试验 1.形态和培养特征观察
采用牛肉膏蛋白胨培养基,将已纯化后的甘油菌种活化后于37℃下培养20～24h ,并进行革兰氏染色及菌体形态和菌落特征的观察。 染色方法：涂片固定；草酸铵结晶紫染1分钟；自来水冲洗；加碘液覆盖涂面染约1分钟；水洗，用吸水纸吸去水分；加95%酒精数滴，并轻轻摇动进行脱色，20秒后水洗，吸去水分；蕃红染色液（稀）染2分钟后，自来水冲洗。干燥，镜检。 2.生长条件试验 (1)耐盐性试验(NaCl 浓度:0. 85 、1. 20 和1. 71) (mol/ L) ; (2)耐酸碱试验(p H :4. 3 、5. 7 、6. 8 、8. 4 、8. 6 和8. 7) ; (3)温度梯度试验(温度: 10℃、30℃、40℃、50℃、55℃、60℃和65℃) 。 分别将参试菌接种于以上处理的液体培养基中培养48 h ,记录生长状况。 3.厌氧生长测定 将菌种接入营养肉汤平板后,用密封带包好放入CO2培养箱37℃培养2天后,观察生长情况,生长则为阳性。 含硝酸钾的营养肉汤 加入2g硝酸钾入营养肉汤 4.生理生化试验
⑴过氧化氢酶测定 . . . .
.... . 将实验菌接种于PGY培养基斜面上,37℃培养20h—24h,取一环接种的培养物,涂于干净的载玻片上,然后在其上滴加3%－—15%的过氧化氢,有气泡则为阳性反应,无气泡为阴性反应。 蛋白胨、酵母膏、葡萄糖（PGY）培养基：蛋白胨10g，酵母膏5g ，葡萄糖1g，蒸馏水1L 。 (2)甲基红（M.R）试验 接种实验细菌于PYG培养基，于37℃培养2天后，于培养物中加入几滴甲基红酒精溶液，如呈红色，表示阳性。 (3)吲哚试验 1）.试管标记：取装有蛋白胨水培养基的试管2支，分别标记乳酸菌和空白对照。 2）.接种培养：以无菌操作分别接种少量菌苔到标记乳酸菌的试管中，标记有空白对照的不接种，置37摄氏度恒温箱中培养24~48小时。 3）.观察记录：在培养基中加入乙醚1~2 ml ,经充分振荡，使吲哚萃取至乙醚中，静置片刻后乙醚层浮于培养液的上面，此时沿管壁缓慢加入5~10滴吲哚试剂，如有吲哚存在，乙醚层呈玫瑰色，此为吲哚试验阳性反应，否则为阴性反应。 (4).糖发酵试验 1）.试管标记：取分别装有葡萄糖，蔗糖发酵培养液试管各2支，每种糖发酵试管中分别标记乳酸菌和空白对照。 2）.接种培养：以无菌操作分别接种少量菌苔至以上各相应试管中，每种糖发酵培养液的空白对照均不接菌。将装有培养液的杜氏小管倒置试管中，置37摄氏度恒温培养箱中培养24小时，观察结果。 3）.观察记录：与对照管比较，若接种培养液保持原由颜色，其反映结果为阴性；如果培养液呈黄色，反映结果为阳性。培养液中的杜氏小管有气泡为阳性反应，杜氏小管没有气泡为阴性反应。 (5).乳酸的检测 选用已经分离的菌种做小型发酵实验，取发酵液的上清液约10 ml于试管中，加入10%硫酸1 ml ,再加2%高锰酸钾 1 ml ,此时乳酸转化为乙醛，把事先在含
