乳酸菌的分离、纯化与鉴定
第一部分：乳酸菌的分离、纯化
一、实验器材:
1.实验药品新鲜乳酸饮料（市售）、脱脂奶粉、蔗糖、1.6%溴甲酚绿乙醇溶液(溴甲酚绿、无水乙醇)、酵母膏、琼脂、革兰氏染液（结晶紫染液、卢戈氏碘液、95%乙醇、沙黄）、75%乙醇、香柏油、1mol/L NaOH、1mol/L HCl、碳酸钙；
0.4gNaOH固体、4.2ml浓HCL(分析纯) 、20gCaCO3固体、酵母膏20g 、琼脂30g
香柏油、脱脂奶粉100g 、蔗糖10g；
2.仪器与设备高压蒸汽灭菌锅、光学显微镜、培养箱、pH试纸、酸乳瓶、培养皿（φ9或φ12）、试管、300ml三角瓶（带玻珠）、移液管、天平、500ml 锥形瓶、250ml锥形瓶、250ml烧杯。
二、实验步骤：
1.培养基配制（BCG牛乳培养基）：
（A）溶液：取脱脂乳粉100g，水500ml，加入1.6%溴甲酚氯乙醇溶液1ml，混合均匀后分装入三角瓶于高压蒸汽灭菌锅80℃灭菌20 min；（1.6%溴甲苯酚绿（BCG）乙醇溶液用1.6g溴甲酚绿加入20ml无水乙醇中，再加水至100ml制成）
（B）溶液：酵母膏10g，水500ml，CaCO3 10g，琼脂20g，加热溶解，用精密pH试纸调节pH到6.8，分装入三角瓶后在103kPa 121℃高压蒸汽灭菌
20Min。
以无菌操作趁热将(A)(B)溶液均匀混合。
2.药品配制
2.1 结晶紫：结晶紫乙醇饱和液（结晶紫2g溶于20ml 95%乙醇中）20ml，1%草酸氨水溶液80ml。将两液混匀，放置24小时后过滤即可。
2.2 卢哥氏碘液：碘1g，碘化钾2g，蒸馏水300ml。先将碘化钾溶于少量蒸馏水中，然后加入碘使之完全溶解，再加入蒸馏水300ml即成。
2.3 蕃红溶液：番红2.5g，95%乙醇100ml，溶解后存于密闭的棕色瓶中。用时取20ml与80ml蒸馏水混匀即可。
2.4 0.1%的吕氏美蓝染液：A液：美蓝0.3g，95%乙醇300ml；B液：0.01% KOH 100ml。混合A和B液即成，按1：100稀释即可。
2.4 生理盐水：称取9g氯化钠，溶解在少量蒸馏水中，稀释到1000毫升。
3.菌悬液的配制
取1洁净三角瓶，盛以225ml生理盐水；7只洁净试管，各盛9ml的生理盐水；加塞包扎于在103kPa 121℃高压蒸汽灭菌20Min，得到无菌生理盐水。
将酸奶样品搅拌均匀，用无菌移液管吸取样品25ml加入盛有225ml无菌生理盐水的三角瓶中，在旋涡均匀器上充分振摇，使样品均匀分散，即为10-1的样品稀释液；
将7只装9ml生理盐水的无菌试管，依次标记 10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7，再用无菌移液管吸10-1的菌悬液1ml放入依次装有9ml无菌水的试管中，稀释混匀便得到10-2稀释液，如此重复依次制得10-3～10-7的稀释液。
4.倒平板
取无菌平板12个，编号标明10-1、10-5、10-6、10-7各三套；将经高温消毒的培养基冷却到50℃左右，按无菌操作法倒12只平板，每皿约15ml；平置使培养基均匀分布在皿底，待凝固。
5.分离方法
A．平板划线
接种环挑取10-1菌液，按无菌操作对标有”10-1”的3个平板进行划操作；划线完毕后，盖上皿盖，倒置放在40℃恒温培养箱中培养48小时。
B．平板涂布
用三支1ml无菌移液管分别吸取10-5、10-6和10-7的稀释菌悬液各1ml，对号接种于与之对应的3个无菌平板中，每个平皿放0.1ml；尽快用无菌玻璃涂棒将菌液在平板上涂布均匀，平放于试验台上20 Min；然后倒置于40℃恒温箱中培养48小时。
6.脱脂乳试管的配制与灭菌
直接选用脱脂乳液或按脱脂奶粉10克与蔗糖5克，水95克（蔗糖与水的比例在1：10的围）的比例配制，装量以试管的1/3为宜，115℃灭菌15min。
7.菌落观察
恒温培养48小时过后，取出培养平板；选择菌落分布较好的平板，先对其
菌落形态进行观察，初步找出乳酸菌菌落。乳酸菌的菌落很小，大约1~3 mm，
园形隆起，表面光滑或稍粗糙，呈乳白色、灰白色或暗黄色；在产酸菌落周围还能产生CaCO3的溶解圈。40℃培养48h，如出现圆形稍扁平的黄色菌落及其周围培养基变为黄色者初步定为乳酸菌。
8.乳酸菌的分离纯化
选取乳酸菌典型菌落转致脱脂乳试管中，40℃培养8~24h若牛乳出现凝固，无气泡，显酸性，涂片镜检细胞杆状或链球状，革兰氏染色显阳性，则可将其连续传代3次，最终选择出在3~6h能凝固的牛乳管，作菌种待用。
9.乳酸发酵及检查
发酵：观察BCG培养基中乳酸菌菌落特征，选取长势比较好的菌落无菌操作下将乳酸菌接种于装有脱脂乳的试管中，40～42℃静止培养。
取干净载玻片一块，在载玻片中央加一滴生理盐水，无菌操作法取少量菌体涂片；结晶紫初染→碘液媒染→乙醇脱色→番红复染，干燥后用油镜观察，菌体被染成蓝紫色的是乳酸菌；其中保加利亚乳杆菌呈杆状，成单杆、双杆或长丝状；嗜热链球菌，呈球状，成对或短链或长链状。革兰氏阳性，无芽胞的球菌或杆菌可定为乳酸菌，记录测定结果。
第二部分：乳酸菌鉴定
一、实验器材
1.蛋白胨水培养基：蛋白胨 10 g , 氯化钠 5 g , 水 1000 ml , PH : 7.2 ~ 7.4 121 摄氏度湿热灭菌 20 min
2.糖发酵培养基：蛋白胨水培养基 1000 ml , 1.6%溴甲酚紫乙醇溶液 1~2 ml ,PH : 7.6 , 另配 20%糖溶液（葡萄糖，蔗糖）各 10 ml.
3.有关试剂
1.6 % 溴甲酚紫乙醇溶液：溴甲酚紫 1.6 g 溶于100 ml 乙醇中，贮存于棕色瓶中保存备用。
