第九章基因功能研究常用方法

研究基因功能的方法
基因功能的研究思路主要包括:
1.基因的亚细胞定位和时空(发育期或梯度药物处理浓度,不同组织/器官)表达谱;
2.基因在转录水平的调控(可以通过genomewalkingPCR或通过已有的资源库寻找该基因的启动子等转录调控区域,通过单杂交或ChIP等技术,寻找该基因的转录调控蛋白)
3.细胞生化水平的功能研究(也就是蛋白蛋白作用复合体的寻找验证,具体方法有酵母双杂交,GSTpulldown,co-IP,BRET,FRET,BiFc等等,对该基因的表达产物做一个细胞信号转导通路的定位)
4.gain-of-function&loss-of-function:也就是分别在细胞和个体水平,做该基因的超表达和knockdown(或knockout),从表型分析该基因的功能.
功能研究应从完整的分子-细胞-个体三个层次研究,综合分析.
关于基因的表达和定位，可以这样去做：
1.mRNA水平检测基因表达：选择表达目的基因的组织/细胞（发育不同时期、机体不同部位、加处理因素...），提取RNA，反转录，做RT-PCR或realtimeRT-PCR，检测基因的表达情况/变化。

（或者以northernblot、Rnaseprotectionassay方法，检测基因的mRNA 表达情况/变化。

）
2.蛋白质水平检测基因表达：选择相应的组织/细胞，以Westernblot、免疫组化（OR免疫荧光)检测目的蛋白的表达。

3.检测目的蛋白的细胞定位：将目的基因克隆至带荧光标签（如GFP）的表达载体，在适合的模式细胞中表达，在活细胞中观察蛋白的细胞定位。

第九章-真核⽣物基因的表达及其调控第九章真核⽣物基因的表达及其调控教学要点：名词：持家基因和奢侈基因静⽌⼦顺式作⽤元件反式作⽤因⼦双内含⼦ UA序列理解真核基因表达调控的复杂性掌握真核基因在染⾊体⽔平上的活化调节学习增强⼦在结构和功能上的特点掌握真核⽣物RNA聚合酶Ⅱ的结构特点及其相关启动⼦的各组分的功能。

掌握RNA编辑的机制授课时数：4学时真核⽣物基因表达调控：基因表达⽔平染⾊质⽔平转录⽔平（主要调控）转录后加⼯⽔平翻译⽔平翻译后⽔平第⼀节真核⽣物中基因表达⽔平的分析⼀、真核⽣物：受精卵→不同⽣物功能的分化细胞⼆、分化细胞：维持其正常结构和新陈代谢等⽣命活动；⾏使其特定的功能。

尽管各种⽣物的细胞中都有该种⽣物的⼀整套基因，然⽽不同种类的细胞中处于⼯作状态的基因种类却不尽相同。

三、cDNA-mRNA 杂交：所以某种mRNA 在群体中频率越⾼，相应的cDNA 的频率越⾼，cDNA 与过量mRNA 越容易形成杂合双链。

当少量单链DNA 与⼤量RNA 杂交时，所有能与RNA 互补的DNA 都会形成RNA-DNA 杂合分⼦。

第⼆节染⾊质⽔平上的基因活化调节⼀、染⾊质的疏松及活性染⾊质特征1.染⾊质纤维解旋—局部膨⼤—染⾊体泡2.染⾊质的模板容量——⼀定量的染⾊质所能合成的RNA的量3.常染⾊质与异染⾊质⼆、转录基因与核⼩体结构核⼩体相位：指同⼀类型的所有细胞中，组蛋⽩⼋聚体在DNA序列上的特殊定位。

改变调控元件的位置：启动⼦、增强⼦…三蛋⽩质的修饰与基因活化调节（⼀）组蛋⽩的调控1、组蛋⽩含量增加→DNA模板容量降低H2A、H2B、H3、H4：影响模板容量，阻⽌DNA链上RNA链的延长2、组蛋⽩修饰：核⼩体组蛋⽩上的某些氨基酸被共价修饰的现象●主要：⼄酰基化、甲基化、磷脂化、泛素化共性：组蛋⽩正电荷减少、碱性降低、松弛与DNA的结合、活化染⾊质、便于转录、调控（⼆）⾮组蛋⽩在基因表达中的作⽤—调节基因表达细胞分化：特异DNA序列上组蛋⽩与⾮组蛋⽩相互作⽤形成不同抑制区的结果。

可编辑修改精选全文完整版•第九章分子生物学研究方法1．课程教学内容(1)核酸技术1—基本操作(2)核酸技术2—克隆技术(3)核酸技术3—测序(4)基因表达和表达分析基因定点诱变(5)蛋白质与核酸的相互作用(6)其他（热点）技术2．课程重点、难点基因克隆技术、杂交技术、测序技术、蛋白质与核酸的相互作用检测技术3．课程教学要求掌握基因克隆技术、杂交技术、测序技术、蛋白质与核酸的相互作用检测等各种技术的原理。

本章内容•核酸的凝胶电泳•DNA分子的酶切割•核酸的分子杂交•基因扩增•基因的克隆和表达•细菌的转化•DNA核苷酸序列分析•蛋白质的分离与纯化•研究DNA与蛋白质相互作用的方法一、核酸的凝胶电泳基本原理：当一种分子被放置在电场当中时，它们会以一定的速度移向适当的电极。

电泳的迁移率：电泳分子在电场作用下的迁移速度，它同电场的强度和电泳分子本身所携带的净电荷成正比。

由于在电泳中使用了一种无反应活性的稳定的支持介质，如琼脂糖和丙烯酰胺，从而降低了对流运动，故电泳的迁移率又同分子的摩擦系数成反比。

在生理条件下，核酸分子的糖-磷酸骨架中的磷酸基团，是呈离子化状态的。

从这个意义上讲，DNA和RNA的多核苷酸链可叫做多聚阴离子，因此，当核酸分子放置在电场中时，它就会向正极移动。

在一定的电场强度下，DNA分子的这种迁移率，取决于核酸分子本身大小和构型。

分子量较小的DNA 分子，比分子量较大的分子，具有较紧密的构型，所以其电泳迁移率也就比同等分子量的松散型的开环DNA分子或线性DNA分子要快些。

Gel matrix (胶支持物) is an inserted, jello-like porous material that supports and allows macromolecules to move through.Agarose (琼脂糖):(1) a much less resolving power than polyacrylamide,(2)but can separate DNA molecules of up to tens of kbDNA can be visualized by staining the gel with fluorescent dyes, such as ethidium bromide (EB 溴化乙锭)Polyacrylamide (聚丙稀酰胺):(1)has high resolving capability, and can resolve DNA that differfrom each other as little as a single base pair/nucleotide.(2)but can only separate DNA over a narrow size range (1 to a fewhundred bp).Pulsed-field gel electrophoresis (脉冲电泳)(1)The electric field is applied in pulses that are orientedorthogonally (直角地) to each other.(2)Separate DNA molecules according to their molecule weight, as wellas to their shape and topological properties.(3)Can effectively separate DNA molecules over 30-50 kb and up toseveral Mb in length.二、DNA分子的酶切割Restriction endonucleases (限制性内切酶) cleave DNA molecules at particular sitesRestriction endonucleases (RE) are the nucleases that cleave DNA at particular sites by the recognition of specific sequences.RE used in molecular biology typically recognize (识别) short (4-8bp) target sequences that are usually palindromic (回文结构), and cut (切割) at a defined sequence within those sequences. e.g. EcoRIThe random occurrence of the hexameric (六核苷酸的) sequence: 1/4096 (4-6=1/46)(1) Restriction enzymes differ in the recognition specificity: target sites are different.(2) Restriction enzymes differ in the length they recognized, and thus the frequencies differ.(3) Restriction enzymes differ in the nature of the DNA ends they generate: blunt/flush ends (平末端), sticky/staggered ends (粘性末端).(4) Restriction enzymes differ in the cleavage activity.三、核酸的分子杂交原理：带有互补的特定核苷酸序列的单链DNA或RNA，当它们混合在一起时，其相应的同源区段将会退火形成双链的结构。

·综述·基因功能研究的方法李新枝,蔡佩玲,牟林春(成都医学院基础医学院人体解剖学与组织胚胎学教研室,四川成都　610083)【中图分类号】　Q78 【文献标识码】　A 1985年在加利福尼亚大学Santa Cruz分校举行的一次会议上,有人第一次提出了共同努力测出人类基因组序列的可能性,虽然这个主意引起了许多人的兴趣,但几乎没有强的支持者[1]。

1986年,诺贝尔奖获得者Renato Dulbecco于《Science》上率先提出人类基因组计划(human geno me project,H GP),旨在阐明人类基因组的3×109个碱基对的序列,发现人类所有基因并阐明其在染色体上的位置,破译人类的全部遗传信息,使人类第一次在分子水平上全面认识自我[2]。

自1990年正式启动以来,随着人类基因组计划和其它模式生物基因组研究的顺利进行,生命科学研究已进入后基因组时代。

基因组学的研究也从结构基因组学转向功能基因组学的研究。

基因组序列测定的完成仅仅是基因组计划的第一步,更大的挑战在于如何确定基因的功能和弄清全部的遗传信息。

因而基因功能研究已成为生命科学领域中的重大课题,它将是21世纪生命科学研究的重要领域。

经典的扣除杂交(subtractive hybridization)、差示筛选(diferential screening)、cDNA替代差异分析(repre-sentative dife rential analy sis,RDA)以及m RNA差异显示(diferential display)等技术已广泛应用于差异表达基因的鉴定和克隆,但这些技术和策略对于从基因组测序所获得的大量未知基因的功能研究来说是远远不够的[3]。

于是,随着后基因组时代的到来,一些能够对大量基因进行全面、系统分析的新技术应运而生。

本文主要介绍近年来用于基因功能研究的较新方法。

1　微阵列分析[1]微阵列(micro array)是近年来发展起来的可用于大规模快速检测基因差异表达、基因组表达谱、DNA序列多态性、致病基因或疾病相关基因的一项研究基因功能的新技术。

植物基因功能研究的主要方法随着植物基因组计划的实施和完成，大量的基因组数据库和EST数据库得以建立和完成，因此产生的问题是成千上万新基因的功能有待分子生物学家鉴定。

研究植物基因功能主要有两种策略：正向遗传学和反向遗传学策略。

正向遗传学是传统的方法，策略是通过筛选天然或人工产生的突变体进而克隆相关目标基因，即从功能（表型）－突变体－基因，最后得到具有相关功能（如对干旱敏感或耐旱）的基因，常用手段是图位克隆并结合一些基因差异表达筛选技术（如差减杂交、差异显示PCR、差异显示分析等）。

反向遗传学的策略是从已知的基因序列入手鉴定其功能，研究手段包括基因的互补实验、超表达、反义抑制、基因敲除、基因激活等。

采用反向遗传学鉴定基因功能是基因组计划由结构基因组学过渡到功能基因组学的必然要求。

目前，植物抗逆性功能基因的研究策略主要集中在利用差减杂交、差异显示PCR、差异显示分析、cDNA微阵列（或基因芯片）等技术筛选与逆境胁迫相关的表达序列标签（EST）或转录因子，然后利用反向遗传学等技术对转录因子的功能进行研究。

正向遗传学手段主要集中在抗逆性状的遗传分析和QTL定位方面，然而目前尚无抗逆性状QTL基因克隆的报道；通过突变体抗逆筛选的途径主要是在模式植物拟南芥中，特别是克隆了一大批与ABA合成或ABA 敏感性有关的基因，例如ABA不敏感的abi8突变体(Brocard-Gifford et al., 2004)。

近年来许多国家（特别是我国）的水稻突变体数量剧增，为通过抗逆筛选克隆基因奠定了基础。

综合利用这些研究手段可以全面地了解植物对胁迫响应的复杂机制和相互作用以及相应的信号传导途径，从而为更加高效地利用基因工程技术来提高植物的抗逆性奠定基础。

下面就几种常见的研究抗逆基因功能的策略作简要介绍。

1. 超量表达（Over-expression）超量表达是指将目的基因全长序列与高活性的组成型或组织特异型启动子融合，通过转化获得该基因产物大量积累的植株，从而扩大该基因在生理生化过程中的效应，这部分扩大的效应带来的与正常植株在各种表型上的差异有助于帮助理解基因功能。

第九章基因功能研究常用方法基因功能研究是生物学研究中的重要部分，通过研究基因的功能和表达方式，可以揭示基因在生物体发育、生长和疾病发生等方面的关键作用。

为了实现对基因功能的深入了解，科学家们发展了各种基因功能研究的方法。

以下将介绍一些常用的基因功能研究方法。

1. 基因敲除（Knockout）：这是一种研究基因功能的重要方法。

通过CRISPR/Cas9等技术将目标基因的部分或全部序列剔除，使其无法表达，观察敲除后的生物体表现出的表型变化。

这种方法可用于验证基因的功能，发现其在生物体中的作用。

2. 基因突变（Mutation）：通过诱发基因突变或筛选已有基因突变体，研究基因的功能和表达方式。

其中，随机突变（例如化学物质诱变）和目标突变方法（例如诱导突变）是常用的策略。

研究基因突变体可以揭示基因对于生物体正常发育和功能的影响。

3. 基因过表达（Gene Overexpression）：通过将目标基因插入表达载体并导入生物体，使基因在生物体中过度表达。

观察过度表达基因后生物体的表型变化，可以了解基因过度表达对生物体的影响。

此外，过度表达基因还可用于验证一些基因在特定条件下的功能和路径。

4. 基因沉默（Gene Silencing）：通过RNA干扰（RNAi）或转座子的反义RNA，使目标基因的转录或翻译过程受到阻碍。

基因沉默可用来研究基因造成的表型变化以及调控基因的功能。

5. 基因共表达（Gene Co-expression）：通过分析大规模基因表达数据，探索基因间的共表达关系。

通过比较共表达基因的功能和通路，可以发现基因的相互关联及其在生物体中的功能。

6. 基因互作（Gene Interaction）：通过分析基因间的物理相互作用和遗传相互作用关系，了解基因在调控和相互影响方面的作用。

这种方法对于揭示基因网络调控和疾病发生机制很有帮助。

7. 基因转移（Gene Transfer）：将外源基因导入目标细胞或生物体，以研究基因功能和转录调控。

研究植物基因功能的策略和方法研究植物基因功能主要有两种策略：正向遗传学（forward genetics）和反向遗传学（reverse genetics）策略。

正向遗传学即通过生物个体或细胞基因组的自发突变或人工诱变，寻找相关表型或性状改变，然后通过图位克隆并结合一些基因差异表达筛选技术（如差减杂交、差异显示PCR、差异显示分析等）从这些特定性状变化的个体或细胞中找到对应的突变基因，并揭示其功能，例如遗传病基因的克隆。

反向遗传学的原理正好相反，人们首先是改变某个特定的基因或蛋白质，然后再去寻找与之有关的表型变化，例如基因剔除技术或转基因研究。

简单地说，正向遗传学是从表型变化研究基因变化，而反向遗传学则是从基因变化研究表型变化。

研究植物体内基因功能的方法主要有以下几种：（1）基因功能丧失或减少，即筛选目的基因功能部分丧失或全部丧失的突变体，比较其与野生型的表型差异来确定该基因功能；（2）基因功能增加或获得，即筛选目的基因高水平表达的植株，比较其与相应对照植株（野生型植株，功能丧失突变体或模式植物植株）差异，观察其表型性状变化来鉴定基因功能；（3）基因异位表达（Ectopic expression），通过定向调控靶基因的时空表达模式来研究基因功能；（4）微阵列（Microarray）是一种在全基因组水平对基因表达进行高通量检测的技术；（5）酵母双杂交技术（Yeast two-hybrid system）用于分析基因产物即蛋白质之间的互作。

1 基因功能丧失或减少以前，通常通过筛选自然突变体来获得基因功能部分或全部丧失的突变体，但概率较低；现在一般通过各种人工方法来获得合适突变体。

人工产生基因功能丧失的方法有插入突变、反义抑制（antisense suppression）、共抑制（cosuppression）、双链RNA干扰（double-stranded RNA interference, dsRNAi）。

几种常用的基因功能分析方法和工具（转自新浪博客）一、GO分类法最先出现的芯片数据基因功能分析法是GO分类法。

Gene Ontology（GO，即基因本体论）数据库是一个较大的公开的生物分类学网络资源的一部分，它包含38675 个Entrez Gene 注释基因中的17348个，并把它们的功能分为三类：分子功能，生物学过程和细胞组分。

在每一个分类中，都提供一个描述功能信息的分级结构。

这样，GO中每一个分类术语都以一种被称为定向非循环图表（DAGs）的结构组织起来。

研究者可以通过GO分类号和各种GO 数据库相关分析工具将分类与具体基因联系起来，从而对这个基因的功能进行描述。

在芯片的数据分析中，研究者可以找出哪些变化基因属于一个共同的GO功能分支，并用统计学方法检定结果是否具有统计学意义，从而得出变化基因主要参与了哪些生物功能。

EASE（Expressing Analysis Systematic Explorer）是比较早的用于芯片功能分析的网络平台。

由美国国立卫生研究院（NIH）的研究人员开发。

研究者可以用多种不同的格式将芯片中得到的基因导入EASE 进行分析，EASE会找出这一系列的基因都存在于哪些GO分类中。

其最主要特点是提供了一些统计学选项以判断得到的GO分类是否符合统计学标准。

EASE能进行的统计学检验主要包括Fisher 精确概率检验，或是对Fisher精确概率检验进行了修饰的EASE 得分（EASE score）。

由于进行统计学检验的GO分类的数量很多，所以EASE采取了一系列方法对“多重检验”的结果进行校正。

这些方法包括弗朗尼校正法（Bonferroni），本杰明假阳性率法（Benjamini falsediscovery rate）和靴带法（bootstraping）。

同年出现的基于GO分类的芯片基因功能分析平台还有底特律韦恩大学开发的Onto-Express。

2002年，挪威大学和乌普萨拉大学联合推出的Rosetta 系统将GO分类与基因表达数据相联系，引入了“最小决定法则”（minimal decision rules）的概念。