基因功能研究方法
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功能基因的筛选和研究
功能基因的筛选和研究近年来，人类对基因的研究和了解有了长足的进步，尤其是对功能基因的筛选和研究。
功能基因指的是能够影响个体生命活动和生理特征的基因，可以对病理或非病理性特征进行定量或定性的评估。
这些基因不仅对个体及其后代的健康有着重要的影响，也对研究人类基因组的全貌和进化起着重要的作用。
一、功能基因的筛选方法功能基因的筛选通常分为两种方法：关联分析和功能分析。
关联分析是基于群体级别的研究，寻找群体中某个特定基因与某种特定生理表现之间的相关性。
而功能分析则更注重基因本身的功能研究，包括编码的蛋白质结构、调控机制以及影响的途径等方面的分析和研究。
这两种方法都有其独特的优势和局限，应根据研究目的和具体问题进行选择和综合运用。
关联分析是较为主流和成熟的功能基因筛选方法之一。
在关联分析中常使用的技术有GWAS（全基因组关联研究）、家系关联分析和配对病例对照研究等。
GWAS是目前关联分析最常用的技术之一，其通过遗传变异与特定表型特征之间的相关性来鉴定功能基因。
当发现某些不同个体间存在显著的遗传差异时，就可以对这些差异所在的位置进行定位和识别。
除了GWAS，家系关联分析和配对病例对照研究等方法也有其优势。
家系关联分析适用于家族性疾病的研究，可以鉴定在特定家族中发生频率较高的某些基因变异，从而确定与该疾病有关的功能基因。
而配对病例对照研究，则可以寻找复杂疾病和相关基因之间的联系。
功能分析则更注重基因本身的研究和验证。
这种方法包括分子生物学、细胞生物学、遗传学和生物信息学等方面的技术，通过对基因本身的结构、编码的蛋白质功能和调控机制等进行深入研究，来鉴定并确认与其相关的生理表现。
在最近的研究中，功能分析已经得到了广泛的应用，使得诊断和治疗技术水平得到了明显提高。
二、功能基因研究的意义功能基因筛选和研究的意义不仅在于对个体生命活动和健康的管理，也对基因组的组成和发展有着重要的影响。
在研究人类基因组的过程中，功能基因有着不可忽视的价值和作用。
研究基因功能的流程
研究基因功能的流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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研究基因功能的方法
研究基因功能的方法
基因功能的研究思路主要包括:
1.基因的亚细胞定位和时空(发育期或梯度药物处理浓度,不同组织/器官)表达谱;
2.基因在转录水平的调控(可以通过genomewalkingPCR或通过已有的资源库寻找该基因的启动子等转录调控区域,通过单杂交或ChIP等技术,寻找该基因的转录调控蛋白)
3.细胞生化水平的功能研究(也就是蛋白蛋白作用复合体的寻找验证,具体方法有酵母双杂交,GSTpulldown,co-IP,BRET,FRET,BiFc等等,对该基因的表达产物做一个细胞信号转导通路的定位)
4.gain-of-function&loss-of-function:也就是分别在细胞和个体水平,做该基因的超表达和knockdown(或knockout),从表型分析该基因的功能.
功能研究应从完整的分子-细胞-个体三个层次研究,综合分析.
关于基因的表达和定位，可以这样去做：
1.mRNA水平检测基因表达：选择表达目的基因的组织/细胞（发育不同时期、机体不同部位、加处理因素...），提取RNA，反转录，做RT-PCR或realtimeRT-PCR，检测基因的表达情况/变化。
（或者以northernblot、Rnaseprotectionassay方法，检测基因的mRNA 表达情况/变化。
）
2.蛋白质水平检测基因表达：选择相应的组织/细胞，以Westernblot、免疫组化（OR免疫荧光)检测目的蛋白的表达。
3.检测目的蛋白的细胞定位：将目的基因克隆至带荧光标签（如GFP）的表达载体，在适合的模式细胞中表达，在活细胞中观察蛋白的细胞定位。
基因功能研究的具体步骤
基因功能研究的具体步骤
嘿，朋友们！今天咱们来聊聊超级神奇的基因功能研究的那些事儿。
咱得先搞清楚要研究的是哪个基因，就像你要了解一个新朋友，得先知道他叫啥。
这一步呢，就需要从茫茫的基因海洋里把咱们的“目标基因”给揪出来。
可以通过各种高大上的技术，比如基因测序啥的。
揪出来之后，就得看看这个基因在细胞或者生物体里到底在啥地方待着。
这就好像要知道你的朋友平时喜欢在哪活动一样。
科学家们会用一些特别厉害的染色方法或者显微镜技术，把基因的位置给找出来。
然后呢，还得研究这个基因和其他基因之间的关系。
它是不是有一群好“基友”，大家一起合作完成重要的任务？还是它特立独行，自己玩自己的？这就得通过一系列复杂又有趣的实验来搞明白。
再说说基因的突变吧。
有时候基因会发生一些小变化，就像人会偶尔犯个小错误一样。
咱们得看看这些小错误会给基因的功能带来啥影响，是变得更强大了，还是直接“罢工”了？
还得把咱们研究出来的这些结果，放到实际的疾病或者生物现象中去验证。
看看这个基因是不是真的和某些病有关系，能不能成为治疗疾病的新靶点。
啊，研究基因功能就像是一场刺激的冒险，充满了惊喜和挑战。
科学家们就像超级侦探，一步步揭开基因的神秘面纱，为人类的健康和未来努力探索着！怎么样，是不是觉得超级酷？。
生物信息学中的基因组分析与功能预测方法研究
生物信息学中的基因组分析与功能预测方法研究简介：生物信息学是研究生物学数据的收集、存储、检索、分析和解释的一门学科，它结合了生物学、计算机科学和统计学的知识。
基因组分析和功能预测是生物信息学中的重要研究内容，旨在了解生物体的遗传信息和功能。
一、基因组分析方法基因组分析是对生物体中的基因组结构和组成进行研究和分析的过程。
下面介绍几种常见的基因组分析方法。
1.基因组测序：基因组测序是获取生物体基因组的完整序列信息的方法。
常见的基因组测序方法包括Sanger测序、Illumina测序和Oxford Nanopore测序等。
通过基因组测序，我们可以了解生物体基因组中的基因、非编码RNA、调控序列等信息，为功能预测提供数据基础。
2.基因组比对：基因组比对是将新测序的基因组序列与已知的参考序列进行比对，以找出两者之间的相似性和差异性。
常见的基因组比对方法包括BLAST、Bowtie、BWA等。
基因组比对可以帮助我们发现新的基因、突变、重排等结构变化。
3.基因组结构与注释：基因组结构与注释是对基因组中的基因进行识别和注释的过程。
常用的基因组结构与注释方法包括基于比对的方法、基于转录组的方法和基于比较基因组学的方法。
这些方法可以帮助我们了解基因的外显子、内含子、起始密码子、终止密码子等信息。
二、功能预测方法基因组的功能预测是根据基因组序列信息推测基因的功能和参与的生物学过程。
下面介绍几种常见的功能预测方法。
1.同源比较：同源比较是通过比对已知功能的基因组序列来推测新基因的功能。
常见的同源比较方法包括BLAST、HMMER、PHYRE等。
通过同源比较，我们可以从已知功能的基因中找到与待预测基因相似的序列，从而推测其功能。
2.基因家族预测：基因家族预测是通过分析基因组中的重复序列来推测基因的功能。
常用的基因家族预测方法包括Pfam、SUPERFAMILY等。
这些方法可以将基因分为不同的家族，并预测其功能。
3.结构与功能预测：结构与功能预测是通过预测蛋白质的二级结构、三级结构和功能来推测基因的功能。
新基因功能研究的策略和方法
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利用转基因技术，则可将外源基因引入动物体 内，建立携带而且能够遗传给子代旳转基因动物 模型，经过对转基因动物旳表型分析研究外源基 因旳功能，目前已经利用转基因技术建立了数千 种转基因动物，而且还能够经过在携带外源基因 旳载体上加上组织特异性开启子等手段，从而控 制外源基因在特定旳时间或特定旳组织器官体现。 利用转基因动物来研究基因功能旳优势在于它是 一种在活体水平上旳多维旳研究体系，能够从分 子到个体水平进行多层次、多方位旳研究。
同步，因为人类全基因组测序已经完毕，所以与其完全同源基因组DNA
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序列及其染色体定位信息，而无需进行荧光原位 杂交等基因染色体定位技术，进而还可经过分析 其内含子、外显子序列及其调整位点，推测其可 能旳基因体现调控方式。即经过此法拟定了富含 亮氨酸反复序列蛋白新基因旳基因组DNA序列及 其染色体定位。
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此类技术中最常用旳主要为反义寡核苷酸 （ASON）、核酶和RNA干扰（RNAi）技术。
然而，涉及这3种技术在内旳该类技术均具有 诱导干扰素和其他细胞因子体现等非特异性效应， 另外，它们也会因为作用与和靶分子序列相近旳分 子而产生脱靶效应，其中，ASON因使用剂量大，其 非特异性效应最大；而RNAi旳这两种副效应最小。
用expay软件分析氨基酸序列同源性
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主要是经过联网或数据库行蛋白质是基因功 能旳体现者和施行者，而蛋白质旳构造则是蛋白质 执行生物学功能旳基础，所以对新基因所编码蛋白 质旳功能域分析将对推测新基因功能提供极其有价 值旳信息。目前，已经有大量被发觉旳蕴藏于蛋白 质构造中旳与特定生物学活性有关旳所谓保守模体。
《基因功能分析》课件
通过荧光染料或探针标记的特异引 物，对特定基因进行实时荧光检测 ，实现对基因表达的定量分析。
蛋白质组学分析
利用质谱等技术对蛋白质进行鉴定 和定量分析，了解蛋白质的表达情 况和功能。
基因突变分析
Sanger测序
通过对目标基因进行双脱氧终止法测序，检测基 因突变位点和类型。
高通量测序
对全基因组或目标区域进行深度测序，发现基因 突变和结构变异。
随着基因技术的进步，相关的伦理和法规 也将不断完善，以保障技术的安全和合理 应用。
THANKS
[ 感是生物多样性的基础。不同物种或同一物种不同种群间的基因变异导致了生物多 样性的产生和发展。了解基因变异对生物多样性的影响有助于保护和利用生物资源。
CHAPTER 04
基因功能研究的应用
医学诊断与治疗
基因诊断
利用基因检测技术，对遗传性疾病进行早期诊断，有助于制定个性 化的治疗方案。
基因与药物反应个体差异
不同个体对同一种药物的反应可能存在差异，这种差异部 分由基因变异引起。了解个体基因变异情况有助于预测患 者对特定药物的反应。
基因与进化
基因变异与物种形成
基因变异是生物进化的驱动力之一。通过自然选择和遗传漂变，基因变异在种群中积累并 最终导致新物种的形成。
基因与适应性进化
生物在适应环境过程中，某些基因变异有助于提高生存和繁殖能力，从而在自然选择作用 下得到保留和传播。这些变异可以影响生物的生理机能、行为和形态等方面。
03
基因与个性化医疗
了解基因变异对疾病的影响有助于实现个性化医疗，为患者提供更精准
的诊断和治疗方案。
基因与药物反应
基因与药物代谢
药物代谢酶的基因变异可以影响药物的代谢速率和效果。 有些变异可能导致药物代谢过快或过慢，从而影响治疗效 果。
蛋白质组学分析
利用质谱等技术对蛋白质进行鉴定 和定量分析，了解蛋白质的表达情 况和功能。
基因突变分析
Sanger测序
通过对目标基因进行双脱氧终止法测序，检测基 因突变位点和类型。
高通量测序
对全基因组或目标区域进行深度测序，发现基因 突变和结构变异。
随着基因技术的进步，相关的伦理和法规 也将不断完善，以保障技术的安全和合理 应用。
THANKS
[ 感是生物多样性的基础。不同物种或同一物种不同种群间的基因变异导致了生物多 样性的产生和发展。了解基因变异对生物多样性的影响有助于保护和利用生物资源。
CHAPTER 04
基因功能研究的应用
医学诊断与治疗
基因诊断
利用基因检测技术，对遗传性疾病进行早期诊断，有助于制定个性 化的治疗方案。
基因与药物反应个体差异
不同个体对同一种药物的反应可能存在差异，这种差异部 分由基因变异引起。了解个体基因变异情况有助于预测患 者对特定药物的反应。
基因与进化
基因变异与物种形成
基因变异是生物进化的驱动力之一。通过自然选择和遗传漂变，基因变异在种群中积累并 最终导致新物种的形成。
基因与适应性进化
生物在适应环境过程中，某些基因变异有助于提高生存和繁殖能力，从而在自然选择作用 下得到保留和传播。这些变异可以影响生物的生理机能、行为和形态等方面。
03
基因与个性化医疗
了解基因变异对疾病的影响有助于实现个性化医疗，为患者提供更精准
的诊断和治疗方案。
基因与药物反应
基因与药物代谢
药物代谢酶的基因变异可以影响药物的代谢速率和效果。 有些变异可能导致药物代谢过快或过慢，从而影响治疗效 果。
植物基因功能研究的主要方法_3215
植物基因功能研究的主要方法随着植物基因组计划的实施和完成，大量的基因组数据库和EST数据库得以建立和完成，因此产生的问题是成千上万新基因的功能有待分子生物学家鉴定。
研究植物基因功能主要有两种策略：正向遗传学和反向遗传学策略。
正向遗传学是传统的方法，策略是通过筛选天然或人工产生的突变体进而克隆相关目标基因，即从功能（表型）－突变体－基因，最后得到具有相关功能（如对干旱敏感或耐旱）的基因，常用手段是图位克隆并结合一些基因差异表达筛选技术（如差减杂交、差异显示PCR、差异显示分析等）。
反向遗传学的策略是从已知的基因序列入手鉴定其功能，研究手段包括基因的互补实验、超表达、反义抑制、基因敲除、基因激活等。
采用反向遗传学鉴定基因功能是基因组计划由结构基因组学过渡到功能基因组学的必然要求。
目前，植物抗逆性功能基因的研究策略主要集中在利用差减杂交、差异显示PCR、差异显示分析、cDNA微阵列（或基因芯片）等技术筛选与逆境胁迫相关的表达序列标签（EST）或转录因子，然后利用反向遗传学等技术对转录因子的功能进行研究。
正向遗传学手段主要集中在抗逆性状的遗传分析和QTL定位方面，然而目前尚无抗逆性状QTL基因克隆的报道；通过突变体抗逆筛选的途径主要是在模式植物拟南芥中，特别是克隆了一大批与ABA合成或ABA 敏感性有关的基因，例如ABA不敏感的abi8突变体(Brocard-Gifford et al., 2004)。
近年来许多国家（特别是我国）的水稻突变体数量剧增，为通过抗逆筛选克隆基因奠定了基础。
综合利用这些研究手段可以全面地了解植物对胁迫响应的复杂机制和相互作用以及相应的信号传导途径，从而为更加高效地利用基因工程技术来提高植物的抗逆性奠定基础。
下面就几种常见的研究抗逆基因功能的策略作简要介绍。
1. 超量表达（Over-expression）超量表达是指将目的基因全长序列与高活性的组成型或组织特异型启动子融合，通过转化获得该基因产物大量积累的植株，从而扩大该基因在生理生化过程中的效应，这部分扩大的效应带来的与正常植株在各种表型上的差异有助于帮助理解基因功能。
研究植物基因功能的策略和方法_3110
研究植物基因功能的策略和方法研究植物基因功能主要有两种策略：正向遗传学（forward genetics）和反向遗传学（reverse genetics）策略。
正向遗传学即通过生物个体或细胞基因组的自发突变或人工诱变，寻找相关表型或性状改变，然后通过图位克隆并结合一些基因差异表达筛选技术（如差减杂交、差异显示PCR、差异显示分析等）从这些特定性状变化的个体或细胞中找到对应的突变基因，并揭示其功能，例如遗传病基因的克隆。
反向遗传学的原理正好相反，人们首先是改变某个特定的基因或蛋白质，然后再去寻找与之有关的表型变化，例如基因剔除技术或转基因研究。
简单地说，正向遗传学是从表型变化研究基因变化，而反向遗传学则是从基因变化研究表型变化。
研究植物体内基因功能的方法主要有以下几种：（1）基因功能丧失或减少，即筛选目的基因功能部分丧失或全部丧失的突变体，比较其与野生型的表型差异来确定该基因功能；（2）基因功能增加或获得，即筛选目的基因高水平表达的植株，比较其与相应对照植株（野生型植株，功能丧失突变体或模式植物植株）差异，观察其表型性状变化来鉴定基因功能；（3）基因异位表达（Ectopic expression），通过定向调控靶基因的时空表达模式来研究基因功能；（4）微阵列（Microarray）是一种在全基因组水平对基因表达进行高通量检测的技术；（5）酵母双杂交技术（Yeast two-hybrid system）用于分析基因产物即蛋白质之间的互作。
1 基因功能丧失或减少以前，通常通过筛选自然突变体来获得基因功能部分或全部丧失的突变体，但概率较低；现在一般通过各种人工方法来获得合适突变体。
人工产生基因功能丧失的方法有插入突变、反义抑制（antisense suppression）、共抑制（cosuppression）、双链RNA干扰（double-stranded RNA interference, dsRNAi）。
功能基因组学的研究内容与方法
］ ［ 机分析为特征
基因组学的研究从结构基因组学
法 基 本 原 理 是 从 转 录 本 特 定 位 置（靠 近 % 端） & 分离出短核苷酸序列（ ，它包含了能代 ’ (） 表该转录本的足够信息 将一个体系的所有转录本 中这一短序列分离并连接到一个克隆载体中进行测 序，便可以得到该体系所有转录本的表达情况 这 种方法在正常、癌旁、癌组织中基因的差异表达研 究方 面 有 独 到 的 优 点，有 助 于 发 现 肿 瘤 特 异 基
行，而且反过来又有助于对基因组的进一步了解 它有效地补充了差异显示、微点阵、表达序列标签 （ "）分析、直接或间接消减杂交、染色体连锁 ［ ］ 分析及核酸测序等研究基因组的方法 与蛋白质组分析相应的一个领域是癌发生学 （ ） 对一个特定细胞基因组表达的所 有蛋白质进行质量和数量分析，可确定全部蛋白质 表达谱
生物信息学在功能基因组学中的应用
生物信息学（ ）是用数理和信息 科学的观点、理论和方法去研究生命现象，组织和 分析呈指数增长的生物学数据的一门学科 研究 和蛋白质，以计算机为主要工具，发展各种 软件，对日益增长的 和蛋白质的序列和结构 进行收集、整理、储存、发布、提取、加工、分析 和发现生物信息学由数据库、计算机网络和应用 软件三大部分组成结构基因组学提供了巨大的 和蛋白质数据，功能基因组学的一个任务就 是如何充分利用数据库去研究基因功能 综上可见，虽然 最初目标的实现已指日 可待，结构基因组研究已接近尾声，但后基因组时 代的功能基因组学已经来临，其内容丰富繁杂，需 要我们不断地创造新方法、开发新技术去完成这个 跨世纪任务 参
个基因组的办法来寻找新的显性或隐性突变该方 法需要大量的小鼠杂交群体，工作量较大，但这种 全基因组扫描法是筛查整个基因组中单一突变的最 好方法，因为任何一个导致一定表型的可能突变都 可以被检测出来
基因组学的研究从结构基因组学
法 基 本 原 理 是 从 转 录 本 特 定 位 置（靠 近 % 端） & 分离出短核苷酸序列（ ，它包含了能代 ’ (） 表该转录本的足够信息 将一个体系的所有转录本 中这一短序列分离并连接到一个克隆载体中进行测 序，便可以得到该体系所有转录本的表达情况 这 种方法在正常、癌旁、癌组织中基因的差异表达研 究方 面 有 独 到 的 优 点，有 助 于 发 现 肿 瘤 特 异 基
行，而且反过来又有助于对基因组的进一步了解 它有效地补充了差异显示、微点阵、表达序列标签 （ "）分析、直接或间接消减杂交、染色体连锁 ［ ］ 分析及核酸测序等研究基因组的方法 与蛋白质组分析相应的一个领域是癌发生学 （ ） 对一个特定细胞基因组表达的所 有蛋白质进行质量和数量分析，可确定全部蛋白质 表达谱
生物信息学在功能基因组学中的应用
生物信息学（ ）是用数理和信息 科学的观点、理论和方法去研究生命现象，组织和 分析呈指数增长的生物学数据的一门学科 研究 和蛋白质，以计算机为主要工具，发展各种 软件，对日益增长的 和蛋白质的序列和结构 进行收集、整理、储存、发布、提取、加工、分析 和发现生物信息学由数据库、计算机网络和应用 软件三大部分组成结构基因组学提供了巨大的 和蛋白质数据，功能基因组学的一个任务就 是如何充分利用数据库去研究基因功能 综上可见，虽然 最初目标的实现已指日 可待，结构基因组研究已接近尾声，但后基因组时 代的功能基因组学已经来临，其内容丰富繁杂，需 要我们不断地创造新方法、开发新技术去完成这个 跨世纪任务 参
个基因组的办法来寻找新的显性或隐性突变该方 法需要大量的小鼠杂交群体，工作量较大，但这种 全基因组扫描法是筛查整个基因组中单一突变的最 好方法，因为任何一个导致一定表型的可能突变都 可以被检测出来
最新基因功能的研究方法
数据库中查找已知顺序的同源基因。根据进化的
相关性可从已知的同源基因推测新基因的功能。
根据同源性预测基因时必需注意以下几点：
1. 一般认为aa的一致性或相似性在25%以上 可视为同源基因；
2. 同源性与相似性的含义不同，如aa顺序的 80%的相似性不能称为同源性。
3. 一致性常指同一位置同一aa在整个多肽序 列中所占的比例，而相似性除一致性aa外 还包括可取代aa的成员，因此相似性aa的 比例总是高于一致性aa。
之间相互作用的影响 2.6 利用酵母双杂交建立基因组蛋白连锁图(Genome Protein
Linkage Map）
3. 开放读框顺序标签(open-reading-frame sequence
tags,OSTs）
确认DNA顺序中的基因序列后，下一个问题 就是探知其功能，这是基因组研究的一个难度 很大的领域。
1.1 基因敲除（Gene knock-out） ➢ 概念：基因敲除除可中止某一基因的
表达外，还包括引入新基因及引入定 点突变。 即可以是用突变基因或其它基因敲除 相应的正常基因，也可以用正常基因 敲除相应的突变基因。
➢ 基因敲除是80年代后半期应用DNA同源重 组原理发展起来的一门新技术。80年代初， 胚胎干细胞（ES细胞）分离和体外培养的 成功奠定了基因敲除的技术基础。
基因功能的研究方法
一、计算机预测基因功能 二、实验确认基因功能 1．基因失活是功能分析的主要手段
1.1 基因敲除（Gene knock-out）
1.2 基因敲除的技术路线 1.3 基因敲除的主要应用领域及国内外研究进展 1.4 基因失活的表型效应有时不易分辨
2．转座子突变库的构建
2.1 插入序列 2.2 实验步骤
相关性可从已知的同源基因推测新基因的功能。
根据同源性预测基因时必需注意以下几点：
1. 一般认为aa的一致性或相似性在25%以上 可视为同源基因；
2. 同源性与相似性的含义不同，如aa顺序的 80%的相似性不能称为同源性。
3. 一致性常指同一位置同一aa在整个多肽序 列中所占的比例，而相似性除一致性aa外 还包括可取代aa的成员，因此相似性aa的 比例总是高于一致性aa。
之间相互作用的影响 2.6 利用酵母双杂交建立基因组蛋白连锁图(Genome Protein
Linkage Map）
3. 开放读框顺序标签(open-reading-frame sequence
tags,OSTs）
确认DNA顺序中的基因序列后，下一个问题 就是探知其功能，这是基因组研究的一个难度 很大的领域。
1.1 基因敲除（Gene knock-out） ➢ 概念：基因敲除除可中止某一基因的
表达外，还包括引入新基因及引入定 点突变。 即可以是用突变基因或其它基因敲除 相应的正常基因，也可以用正常基因 敲除相应的突变基因。
➢ 基因敲除是80年代后半期应用DNA同源重 组原理发展起来的一门新技术。80年代初， 胚胎干细胞（ES细胞）分离和体外培养的 成功奠定了基因敲除的技术基础。
基因功能的研究方法
一、计算机预测基因功能 二、实验确认基因功能 1．基因失活是功能分析的主要手段
1.1 基因敲除（Gene knock-out）
1.2 基因敲除的技术路线 1.3 基因敲除的主要应用领域及国内外研究进展 1.4 基因失活的表型效应有时不易分辨
2．转座子突变库的构建
2.1 插入序列 2.2 实验步骤
基因功能鉴定方法
基因功能鉴定方法基因功能鉴定是生物学研究中的重要工具。
通过对基因进行功能鉴定，我们可以了解其编码蛋白质的生物学作用，探索其与疾病发生发展的关系，以及发现治疗疾病的新靶点等。
在本文中，我们将概括介绍几种常用的基因功能鉴定方法。
1. 敲除基因敲除基因是指通过基因编辑技术将目标基因从细胞或生物中彻底剔除。
目前常用的敲除方法是CRISPR/Cas9技术。
这种方法通过将一条RNA单链接在Cas9蛋白上，使它能够精准地结合到目标基因序列上，再利用Cas9酶活性的内切酶活性切割目标基因。
通过敲除基因，我们可以了解这个基因对于生物体的重要性，以及对生物学过程的影响。
在研究基因与疾病相关性方面，敲除基因可以帮助我们确定疾病相关基因，发现新型治疗的潜在靶点，还可以使细胞模型和动物模型显示疾病和疾病相关基因的发展过程。
2. 过表达基因过表达基因是指通过载体或转录本增强自然表达的基因依靠人为的方法将该基因的表达量提高。
目前，利用质粒或病毒载体来过表达基因是最常用的方法之一。
过表达基因需要具备特定的表达载体，质粒或病毒载体通常包含了基因序列和控制基因表达的转录因子等等。
使用过表达基因可以帮助我们理解这个基因的作用，以及过量表达后对生物结构和功能的影响。
3. RNAiRNA干扰（RNAi）是一种利用短小的RNA片段切断或降低目标RNA复制的方法。
RNAi技术可以将特异性siRNA 瘤切寡核苷酸至特定mRNA的靶标上并引发靶标的降解，以达到有效抑制基因表达的效果。
RNAi技术比敲除和过表达技术更快速，更普及。
RNAi 技术广泛应用于疾病研究，可以为基因治疗提供依据。
4. 蛋白质催化反应通过制备相应的结构变化、催化活性的突变蛋白，可以表征基因改变对与酶的活性和反应性质的调节关系。
基于此原理，进行蛋白质酶催化验证往往会让我们了解想要研究的那个基因的具体功能。
此方法虽然技术成本高，分析过程也比较复杂且麻烦，但针对和酶活性相关的蛋白质功能的研究非常有效。
基因功能研究方法
反义技术的两种技术路线:
将表达与体内基因或mRNA互补序列的基因转入体内， 使细胞表达与目标基因互补的mRNA失活，从而阻断目 标基因的表达；
体外合成mRNA互补的核苷酸类似物，通过静脉注射等 途径进入细胞，特异性的与目标mRNA作用。
反义寡聚核苷酸 与mRNA特异性结 合，阻断翻译过 程。
的部位，如球形或纤维状结构，他们介于二级结构和三级结构之间。
激活结构域:指转录因子中与转录起始复合体接触与互作的结构部
位。
优势：
它可应基因序列，它检测的相互作用在体 内发生，无需额外的纯化步骤。
删除、置换、修饰等手段重建DNA序列,使之成为靶载体； (2)将靶载体导入小鼠的胚胎干细胞中,使外源DNA与胚胎干
细胞基因组相应部分发生同源重组,将靶载体的DNA 序列 整合到内源基因组中；
(3)将胚胎干细胞受体细胞注入小鼠的囊胚，将这些囊胚 导入假孕母鼠子宫中，产生的雄性嵌合鼠子代与正常 的雌鼠交配即可获得生殖系统携带该基因的纯合鼠， 进而分析被剔除基因的功能。
优点： 可使导入基因的水平与内源基因相当,并且具有类似 于天然的剪接机理,适用于复杂的基因功能分析。
YAC要具备的主要功能成份
1）着丝粒：mitosis姊妹染色单体和减I同源染色体分离之必需。 2）端粒：保护染色体末端免受核酸酶的侵袭。 3）自主复制序列（ARS）元件：是染色体自主复制的复制起点。 构建YAC需要4个短序列：2个端粒，着丝粒，ARS元件
4.2 基因敲入 基因敲除技术已经成为研究基因功能的强有力手段，但对
于许多基因来说，简单的失活常导致令人费解的无改变 的表型。最常见的解释是某些其它基因取代了靶基因的 功能，但要在普通基因敲除小鼠中证明这一点十分困难。 基因敲入即通过基因打靶用一种基因替换另一种基因以 确定它们是否具有相同功能。
基因功能分析的基本策略
基因功能分析的基本策略一、利用转基因模型研究基因的功能1转基因动物：是指用人工方法将外源基因导入或整合到基因组内，并能稳定传代的一类动物。
2基本原理：将目的基因（或基因组片段）用显微注射等方法注入实验动物的受精卵或着床前的胚胎细胞中，使目的基因整合到基因组中，然后将此受精卵或着床前的胚胎细胞再植入受体动物园的输卵管（或子宫）中，使其发育成携带有外源基因的转基因动物。
导入基因的方法有显微注射法、胚胎干细胞法、逆转录病毒感染法、精子载体法。
二、利用基因敲除模型研究基因的功能1基因打靶：是指通过DNA定点同源重组，改变基因组中的某一特定基因，从而在生物活体内研究此基因的功能。
若定向敲除某个基因，称为基因敲除，若定向将一段基因序列替代另一段基因序列，称为基因敲入。
2同源重组：是指发生在同源序列间的重组，它通过链的断裂和再连接，在两个DNA分子同源序列之间进行单链或双链片段的交换。
又称基本重组。
3基因敲除：是目前在体内研究基因功能的最佳方法，是指通过DNA同源重组定向的将外源基因插入宿主细胞染色体DNA，从而使特定基因在细胞内或生物或体内失活的过程。
4基因打靶的必备条件：胚胎干细胞（ES）、打靶载体5打靶载体的筛选标志：neo（新霉素）阳性筛选标志；HSV-tk阴性筛选标志。
6基因敲除的基本程序：①打靶载体的构建②打靶载体导入ES细胞③基因敲除ES细胞注射入胚泡④胚泡植入假孕小鼠的子宫中⑤嵌合体的杂交育种7构建打靶载体的基本过程①获得目的基因的同源片段，将此DNA片段克隆到一般的质粒载体中；②从重组质粒中切除目的基因的大部分同源DNA序列，只留部分序列在线性质粒载体的两端；③将neo基因克隆到带有目的基因同源顺序的线性质粒中，使之位于残留目的基因同源顺序的中间；④在目的基因同源顺序的外侧线性化重组质粒载体，将HSV-tk基因克隆到此线性载体中。
三、通过抑制或沉默基因表达对基因的功能进行分析研究1利用反义RNA抑制基因表达水平2利用RNAi技术在细胞中沉默特定基因已研究其功能1。
几种常用的基因功能分析方法和工具
几种常用的基因功能分析方法和工具（转自新浪博客）一、GO分类法最先出现的芯片数据基因功能分析法是GO分类法。
Gene Ontology（GO，即基因本体论）数据库是一个较大的公开的生物分类学网络资源的一部分，它包含38675 个Entrez Gene 注释基因中的17348个，并把它们的功能分为三类：分子功能，生物学过程和细胞组分。
在每一个分类中，都提供一个描述功能信息的分级结构。
这样，GO中每一个分类术语都以一种被称为定向非循环图表（DAGs）的结构组织起来。
研究者可以通过GO分类号和各种GO 数据库相关分析工具将分类与具体基因联系起来，从而对这个基因的功能进行描述。
在芯片的数据分析中，研究者可以找出哪些变化基因属于一个共同的GO功能分支，并用统计学方法检定结果是否具有统计学意义，从而得出变化基因主要参与了哪些生物功能。
EASE（Expressing Analysis Systematic Explorer）是比较早的用于芯片功能分析的网络平台。
由美国国立卫生研究院（NIH）的研究人员开发。
研究者可以用多种不同的格式将芯片中得到的基因导入EASE 进行分析，EASE会找出这一系列的基因都存在于哪些GO分类中。
其最主要特点是提供了一些统计学选项以判断得到的GO分类是否符合统计学标准。
EASE能进行的统计学检验主要包括Fisher 精确概率检验，或是对Fisher精确概率检验进行了修饰的EASE 得分（EASE score）。
由于进行统计学检验的GO分类的数量很多，所以EASE采取了一系列方法对“多重检验”的结果进行校正。
这些方法包括弗朗尼校正法（Bonferroni），本杰明假阳性率法（Benjamini falsediscovery rate）和靴带法（bootstraping）。
同年出现的基于GO分类的芯片基因功能分析平台还有底特律韦恩大学开发的Onto-Express。
2002年，挪威大学和乌普萨拉大学联合推出的Rosetta 系统将GO分类与基因表达数据相联系，引入了“最小决定法则”（minimal decision rules）的概念。
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基因功能研究方法
1
随着生物学研究在分子水平上的不断深入 和推进，越来越多的新基因得以成功克隆，对 新基因功能的研究显得日益重要，这也是后基 因组时代功能基因组学的重要研究内容。
2
1. 微阵列分析
微阵列(microarray) 是近年来发展起来 的可用于大规模快速检测基因差异表达、基因 组表达谱、DNA 序列多态性、致病基因或疾病 相关基因的一项研究基因功能的新技术。它包 括cDNA微阵列(cDNA microarray)和DNA芯片。
12
化学方法 1>.脂质体载体：方法具有安全、简单、低毒、无免疫原 性等优点，适用于注射方法进行器官靶向性转移并有 一定的转移效率。是除病毒载体转移方法之外的另一 种有价值的体内基因转移方法。
13
14
15
16
2>.受体介导法：利用肝细胞上富含转移因子和糖蛋白受 体的特点，人工合成多聚阳离子氨基酸，进而连接转 移因子(或糖蛋白)和目的基因构成复合物，通过与肝 细胞表面的受体结合来实现目的基因的转移。 优点:靶向性好，但受体介导的内吞小泡会被转运到溶 酶体，易被溶酶体降解而造成目的基因表达时间短暂， 表达效率低下。利用腺病毒与内吞小泡相融合而将其 破坏释放出外源DNA，可提高转化效率。
30
(3) 将胚胎干细胞受体细胞注入小鼠的囊胚,将这些囊 胚导入假孕母鼠子宫中,产生的雄性嵌合鼠子代与正常 的雌鼠交配即可获得生殖系统携带该基因的纯合鼠,进 而分析被剔除基因的功能。
31
32
4.2 基因敲入 基因敲除技术已经成为研究基因功能的强
有力手段,但对于许多基因来说,简单的失活常导致令 人费解的无改变的表型。最常见的解释是某些其它基 因取代了靶基因的功能,但要在普通基因敲除小鼠中证 明这一点十分困难。基因敲入即通过基因打靶用一种 基因替换另一种基因以确定它们是否具有相同功能。
4
微阵列法分析过程 首先用来自不同生理状态和发育阶段的mRNA 作为 模板,以放射性同位素或荧光标记的dNTP为底物反转录 合成cDNA。再用所得cDNA与微阵列或DNA芯片进行杂交, 然后通过计算机对结果进行判读和处理,这样就可以知 道芯片中哪些基因在细胞里表达,哪些基因不表达;同 样也可以测知哪些基因的表达水平高,哪些基因的表达 水平低。
反义技术是根据碱基互补原理,利用人工或生物合 成的特异互补的DNA 或RNA 片段(或其修饰产物) 来抑 制或封闭目的基因的表达。包括反义寡核苷酸技术(An tisense oligonuclerotides , ASON)、反义RNA技术 和核酶(Ribozyme)技术。
21
3.1 反义寡核苷酸技术 反义核苷酸是一类经人工合成或构建的反义表达载体 表达的寡核苷酸片段，长度多为15-30个核苷酸，通过 碱基互补原理，干扰基因的解旋、复制、转录、mRNA 的剪接加工乃至输出和翻译等各个环节，从而调节细 胞的生长、分化等。根据结合部位的不同分为反义DNA （asDNA）、反义RNA（asRNA）、自催化性核酶（ribo zyme）。
3
原理: 原理: 将成千上万条DNA片段(cDNA、表达序列标 签(expressed sequence tag ,EST) 或特异的寡核苷 酸片段) 按横行纵列方式有序点样在固相支持物上。 固相支持物为硝基纤维膜或尼龙膜时称为微阵列。固 相支持物改为指甲盖大小的玻片或硅片时所形成的微 阵列就称为DNA芯片。
26
•
• •
反义寡聚 核苷酸 与mRNA特 异性结合， 阻断翻译 过程
27
4.基因敲除和敲入 4.基因敲除和敲入
4.1 基因敲除( Gene knockout ) 又称基因打靶 (genetargeting) ,是同源重组技术的形象说法。通过 一定的途径使特定的基因失活或缺失的技术。它是指用 外源DNA 与受体细胞基因组中顺序相同或者非常相近的 基因发生同源重组,整合到受体细胞基因组中并得到表 达的一种外源DNA 导入技术。
7
•
原位合成法：主要是美国Affymetrix公司开发的寡聚核苷 原位合成法：主要是美国Affymetrix公司开发的寡聚核苷 Affymetrix 酸原位光刻DNA合成技术。 DNA合成技术 酸原位光刻DNA合成技术。 采用的技术原理是在合成碱基单体的5’羟基末端连上一个 采用的技术原理是在合成碱基单体的5’羟基末端连上一个 技术原理是在合成碱基单体的5’ 光敏保护基，利用光照射使羟基端脱保护，然后逐个将5’ 光敏保护基，利用光照射使羟基端脱保护，然后逐个将5’ 端保护的核苷酸单体连接上去， 端保护的核苷酸单体连接上去，这个过程反复进行直至合 成完毕。此方法的优点是合成循环中探针数目呈指数增长， 优点是合成循环中探针数目呈指数增长 成完毕。此方法的优点是合成循环中探针数目呈指数增长， 面积上合成40万组寡核苷酸。 40万组寡核苷酸 在1.6cm2面积上合成40万组寡核苷酸。
17
主要通过构建病毒载体来完成) 生物学方法 (主要通过构建病毒载体来完成) 病毒表达载体:以病毒为载体介导的基因转移技术因其转 病毒表达载体 染效率高、目的基因可稳定表达等优势被广泛应用。 1>.逆转录病毒(retrovirus，Rv):构建简单，装载外源基 因容量最大达8kb，整合入宿主细胞基因组而无病毒蛋 白表达。但仅能感染分裂期细胞，体外制备滴度较低， 且其随机整合有引起“插入性突变”的可能。
11
物理方法 1>. DNA直接注射法: 是目的基因导入的最简单方法, 但 注入量有限, 能够接触到的细胞有限,故获得的细胞转 化率很低, 多通过肿瘤局部多点注射给药。 2>. 颗粒轰击技术:将目的基因包被金属以后,利用高压 发射装置, 加速包裹目的基因的金属颗粒进入细胞,从 而提高肿瘤细胞的转化率。
5
芯片的制作
• •
目前常用的基因芯片制作方法： 目前常用的基因芯片制作方法： 接触点样法、喷黑法、原位合成法。 接触点样法、喷黑法、原位合成法。 接触点样法：是将样品直接点在基体上， 接触点样法：是将样品直接点在基体上，其优点是仪器结 构简单、容易研制，是一种快速、经济、多功能的仪器， 构简单ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ容易研制，是一种快速、经济、多功能的仪器， 可以在3.6cm 面积内点上10000 cDNA。 10000个 可以在3.6cm2面积内点上10000个cDNA。不足之处是每个 样品都必须合成好、经过纯化、事先保存的。 样品都必须合成好、经过纯化、事先保存的。
28
优点：此技术整合位点确定、精确,转移基因频率较高, 既可以用正常基因敲除突变的基因,以进行性状的改良 和遗传病的治疗;又可以用突变的基因敲除正常的基因, 以研究此基因在发育和调控方面的作用。
29
目前利用基因敲除得到转基因动物的程序可简述如下: 目前利用基因敲除得到转基因动物的程序可简述如下: (1) 克隆基因组中某一基因的全部或部分DNA 序列, 用 插入、删除、置换、修饰等手段重建DNA 序列,使之成 为靶载体; (2) 将靶载体导入小鼠的胚胎干细胞中,使外源DNA 与 胚胎干细胞基因组相应部分发生同源重组,将靶载体的 DNA 序列整合到内源基因组中;
22
3.2 反义RNA技术 反义RNA 技术是利用基因重组技术,构建人工表达载 体,使其离体或体内表达反义RNA ,反义RNA 能与靶mRN A形成较稳定的二聚体,从而抑制靶基因的表达。其作 用机理可能在DNA 复制、转录及翻译多水平上抑制靶 基因的表达。
23
3.3 核酶技术
核酶(Ribozyme) 技术是一类具催化活性的特殊RNA 分 子,通过碱基配对原则特异性灭活靶RNA 分子。可裂解 与其互补的mRNA及在DNA内插入DNA片段构成三链结构， 单个核酶分子可以结合多个mRNA 分子并使之在特定部 位断裂,而其本身具有较稳定的空间结构,不易受RNase 攻击,因而催化效率比反义RNA 高。常见的核酶有锤头 状、发夹状和斧头状三种,应用最多的是锤头状核酶。
34
6.人工染色体的转导 6.人工染色体的转导
转基因技术是进行蛋白功能分析和基因表达调控 的有力手段,但使用小的质粒重组体存在表达水平低、 缺乏组织特异性等缺点,若将大的DNA片段克隆入酵母 人工染色体( YACs)或细菌染色体，可产生较好的表达 水平和组织特异性,并可精确地调节同源重组。
35
•
18
2>.腺病毒 腺病毒(adenovirus, Adv): 为近年肝细胞肝癌基因 腺病毒 治疗中报告最多的一种病毒载体。装载外源基因容量 最大达35kb，不整合入宿主细胞基因组因而避免插入 突变的危险，能感染分裂细胞和非分裂细胞。但易引 起宿主免疫反应而使转染效率下降。
19
20
3. 反义技术
33
基因敲入的设计,是一个类似于普通基因敲除法的 一步同源重组过程。不同之处在于,设计打靶载体时需 将靶基因第一个外显子的N-端序列缺失,并将新的替换 基因置于靶基因的调控序列之下,使其能精确地按照靶 基因的调控模式表达。此方法不仅能用一种基因置换 另一种基因,且可以系统地改变基因的结构,分析其蛋 白产物各功能区的作用。
•
6
•
喷黑法:是以定量供给的方式， 喷黑法 :是以定量供给的方式 ，通过压电晶体或其他推进 形式从很小的喷嘴内把生物样品喷射到玻璃载体上。 形式从很小的喷嘴内把生物样品喷射到玻璃载体上。同样 需要合成好的纯样品，包括cDNA 染色体DNA片段和抗体。 cDNA、 DNA片段和抗体 需要合成好的纯样品，包括cDNA、染色体DNA片段和抗体。 在 1 c m 2 面 积 上 可 喷 射 1 0 0 0 0 个 点 。
酵母人工染色体(yeast artificial chromosome，YAC) 是一类酵母穿梭载体。YAC具有自主复制序列、克隆位 点以及可在细菌和酵母菌中选择的标记基因。此外，Y AC还具有酵母菌染色体的一些特点。可以接受100-100 0kb的外源DNA片段。
36
人工酵母染色体就是把酵母染色体上与基因复制 和表达有关的主要组件都组装在质粒上，令质粒行使 酵母的转录功能和复制功能。 YAC DNA 转导的方法主要有核注射、脂质体介导 和酵母原生质体融合等。采用YAC 转导基因的方式可 使导入基因的水平与内源基因相当,并且具有类似于天 然的剪接机理,适用于复杂的基因功能分析。
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随着生物学研究在分子水平上的不断深入 和推进，越来越多的新基因得以成功克隆，对 新基因功能的研究显得日益重要，这也是后基 因组时代功能基因组学的重要研究内容。
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1. 微阵列分析
微阵列(microarray) 是近年来发展起来 的可用于大规模快速检测基因差异表达、基因 组表达谱、DNA 序列多态性、致病基因或疾病 相关基因的一项研究基因功能的新技术。它包 括cDNA微阵列(cDNA microarray)和DNA芯片。
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化学方法 1>.脂质体载体：方法具有安全、简单、低毒、无免疫原 性等优点，适用于注射方法进行器官靶向性转移并有 一定的转移效率。是除病毒载体转移方法之外的另一 种有价值的体内基因转移方法。
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2>.受体介导法：利用肝细胞上富含转移因子和糖蛋白受 体的特点，人工合成多聚阳离子氨基酸，进而连接转 移因子(或糖蛋白)和目的基因构成复合物，通过与肝 细胞表面的受体结合来实现目的基因的转移。 优点:靶向性好，但受体介导的内吞小泡会被转运到溶 酶体，易被溶酶体降解而造成目的基因表达时间短暂， 表达效率低下。利用腺病毒与内吞小泡相融合而将其 破坏释放出外源DNA，可提高转化效率。
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(3) 将胚胎干细胞受体细胞注入小鼠的囊胚,将这些囊 胚导入假孕母鼠子宫中,产生的雄性嵌合鼠子代与正常 的雌鼠交配即可获得生殖系统携带该基因的纯合鼠,进 而分析被剔除基因的功能。
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32
4.2 基因敲入 基因敲除技术已经成为研究基因功能的强
有力手段,但对于许多基因来说,简单的失活常导致令 人费解的无改变的表型。最常见的解释是某些其它基 因取代了靶基因的功能,但要在普通基因敲除小鼠中证 明这一点十分困难。基因敲入即通过基因打靶用一种 基因替换另一种基因以确定它们是否具有相同功能。
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微阵列法分析过程 首先用来自不同生理状态和发育阶段的mRNA 作为 模板,以放射性同位素或荧光标记的dNTP为底物反转录 合成cDNA。再用所得cDNA与微阵列或DNA芯片进行杂交, 然后通过计算机对结果进行判读和处理,这样就可以知 道芯片中哪些基因在细胞里表达,哪些基因不表达;同 样也可以测知哪些基因的表达水平高,哪些基因的表达 水平低。
反义技术是根据碱基互补原理,利用人工或生物合 成的特异互补的DNA 或RNA 片段(或其修饰产物) 来抑 制或封闭目的基因的表达。包括反义寡核苷酸技术(An tisense oligonuclerotides , ASON)、反义RNA技术 和核酶(Ribozyme)技术。
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3.1 反义寡核苷酸技术 反义核苷酸是一类经人工合成或构建的反义表达载体 表达的寡核苷酸片段，长度多为15-30个核苷酸，通过 碱基互补原理，干扰基因的解旋、复制、转录、mRNA 的剪接加工乃至输出和翻译等各个环节，从而调节细 胞的生长、分化等。根据结合部位的不同分为反义DNA （asDNA）、反义RNA（asRNA）、自催化性核酶（ribo zyme）。
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原理: 原理: 将成千上万条DNA片段(cDNA、表达序列标 签(expressed sequence tag ,EST) 或特异的寡核苷 酸片段) 按横行纵列方式有序点样在固相支持物上。 固相支持物为硝基纤维膜或尼龙膜时称为微阵列。固 相支持物改为指甲盖大小的玻片或硅片时所形成的微 阵列就称为DNA芯片。
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反义寡聚 核苷酸 与mRNA特 异性结合， 阻断翻译 过程
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4.基因敲除和敲入 4.基因敲除和敲入
4.1 基因敲除( Gene knockout ) 又称基因打靶 (genetargeting) ,是同源重组技术的形象说法。通过 一定的途径使特定的基因失活或缺失的技术。它是指用 外源DNA 与受体细胞基因组中顺序相同或者非常相近的 基因发生同源重组,整合到受体细胞基因组中并得到表 达的一种外源DNA 导入技术。
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原位合成法：主要是美国Affymetrix公司开发的寡聚核苷 原位合成法：主要是美国Affymetrix公司开发的寡聚核苷 Affymetrix 酸原位光刻DNA合成技术。 DNA合成技术 酸原位光刻DNA合成技术。 采用的技术原理是在合成碱基单体的5’羟基末端连上一个 采用的技术原理是在合成碱基单体的5’羟基末端连上一个 技术原理是在合成碱基单体的5’ 光敏保护基，利用光照射使羟基端脱保护，然后逐个将5’ 光敏保护基，利用光照射使羟基端脱保护，然后逐个将5’ 端保护的核苷酸单体连接上去， 端保护的核苷酸单体连接上去，这个过程反复进行直至合 成完毕。此方法的优点是合成循环中探针数目呈指数增长， 优点是合成循环中探针数目呈指数增长 成完毕。此方法的优点是合成循环中探针数目呈指数增长， 面积上合成40万组寡核苷酸。 40万组寡核苷酸 在1.6cm2面积上合成40万组寡核苷酸。
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主要通过构建病毒载体来完成) 生物学方法 (主要通过构建病毒载体来完成) 病毒表达载体:以病毒为载体介导的基因转移技术因其转 病毒表达载体 染效率高、目的基因可稳定表达等优势被广泛应用。 1>.逆转录病毒(retrovirus，Rv):构建简单，装载外源基 因容量最大达8kb，整合入宿主细胞基因组而无病毒蛋 白表达。但仅能感染分裂期细胞，体外制备滴度较低， 且其随机整合有引起“插入性突变”的可能。
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物理方法 1>. DNA直接注射法: 是目的基因导入的最简单方法, 但 注入量有限, 能够接触到的细胞有限,故获得的细胞转 化率很低, 多通过肿瘤局部多点注射给药。 2>. 颗粒轰击技术:将目的基因包被金属以后,利用高压 发射装置, 加速包裹目的基因的金属颗粒进入细胞,从 而提高肿瘤细胞的转化率。
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芯片的制作
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目前常用的基因芯片制作方法： 目前常用的基因芯片制作方法： 接触点样法、喷黑法、原位合成法。 接触点样法、喷黑法、原位合成法。 接触点样法：是将样品直接点在基体上， 接触点样法：是将样品直接点在基体上，其优点是仪器结 构简单、容易研制，是一种快速、经济、多功能的仪器， 构简单ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ容易研制，是一种快速、经济、多功能的仪器， 可以在3.6cm 面积内点上10000 cDNA。 10000个 可以在3.6cm2面积内点上10000个cDNA。不足之处是每个 样品都必须合成好、经过纯化、事先保存的。 样品都必须合成好、经过纯化、事先保存的。
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优点：此技术整合位点确定、精确,转移基因频率较高, 既可以用正常基因敲除突变的基因,以进行性状的改良 和遗传病的治疗;又可以用突变的基因敲除正常的基因, 以研究此基因在发育和调控方面的作用。
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目前利用基因敲除得到转基因动物的程序可简述如下: 目前利用基因敲除得到转基因动物的程序可简述如下: (1) 克隆基因组中某一基因的全部或部分DNA 序列, 用 插入、删除、置换、修饰等手段重建DNA 序列,使之成 为靶载体; (2) 将靶载体导入小鼠的胚胎干细胞中,使外源DNA 与 胚胎干细胞基因组相应部分发生同源重组,将靶载体的 DNA 序列整合到内源基因组中;
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3.2 反义RNA技术 反义RNA 技术是利用基因重组技术,构建人工表达载 体,使其离体或体内表达反义RNA ,反义RNA 能与靶mRN A形成较稳定的二聚体,从而抑制靶基因的表达。其作 用机理可能在DNA 复制、转录及翻译多水平上抑制靶 基因的表达。
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3.3 核酶技术
核酶(Ribozyme) 技术是一类具催化活性的特殊RNA 分 子,通过碱基配对原则特异性灭活靶RNA 分子。可裂解 与其互补的mRNA及在DNA内插入DNA片段构成三链结构， 单个核酶分子可以结合多个mRNA 分子并使之在特定部 位断裂,而其本身具有较稳定的空间结构,不易受RNase 攻击,因而催化效率比反义RNA 高。常见的核酶有锤头 状、发夹状和斧头状三种,应用最多的是锤头状核酶。
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6.人工染色体的转导 6.人工染色体的转导
转基因技术是进行蛋白功能分析和基因表达调控 的有力手段,但使用小的质粒重组体存在表达水平低、 缺乏组织特异性等缺点,若将大的DNA片段克隆入酵母 人工染色体( YACs)或细菌染色体，可产生较好的表达 水平和组织特异性,并可精确地调节同源重组。
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2>.腺病毒 腺病毒(adenovirus, Adv): 为近年肝细胞肝癌基因 腺病毒 治疗中报告最多的一种病毒载体。装载外源基因容量 最大达35kb，不整合入宿主细胞基因组因而避免插入 突变的危险，能感染分裂细胞和非分裂细胞。但易引 起宿主免疫反应而使转染效率下降。
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3. 反义技术
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基因敲入的设计,是一个类似于普通基因敲除法的 一步同源重组过程。不同之处在于,设计打靶载体时需 将靶基因第一个外显子的N-端序列缺失,并将新的替换 基因置于靶基因的调控序列之下,使其能精确地按照靶 基因的调控模式表达。此方法不仅能用一种基因置换 另一种基因,且可以系统地改变基因的结构,分析其蛋 白产物各功能区的作用。
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喷黑法:是以定量供给的方式， 喷黑法 :是以定量供给的方式 ，通过压电晶体或其他推进 形式从很小的喷嘴内把生物样品喷射到玻璃载体上。 形式从很小的喷嘴内把生物样品喷射到玻璃载体上。同样 需要合成好的纯样品，包括cDNA 染色体DNA片段和抗体。 cDNA、 DNA片段和抗体 需要合成好的纯样品，包括cDNA、染色体DNA片段和抗体。 在 1 c m 2 面 积 上 可 喷 射 1 0 0 0 0 个 点 。
酵母人工染色体(yeast artificial chromosome，YAC) 是一类酵母穿梭载体。YAC具有自主复制序列、克隆位 点以及可在细菌和酵母菌中选择的标记基因。此外，Y AC还具有酵母菌染色体的一些特点。可以接受100-100 0kb的外源DNA片段。
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人工酵母染色体就是把酵母染色体上与基因复制 和表达有关的主要组件都组装在质粒上，令质粒行使 酵母的转录功能和复制功能。 YAC DNA 转导的方法主要有核注射、脂质体介导 和酵母原生质体融合等。采用YAC 转导基因的方式可 使导入基因的水平与内源基因相当,并且具有类似于天 然的剪接机理,适用于复杂的基因功能分析。