重组基因导入受体细胞

– 基因组为原核型，除了裸露的染色体DNA外，不含叶绿体DNA 和线粒体DNA，遗传背景简单，便于基因操作和外源DNA的检 测。 – 细胞壁属G-，主要由肽聚糖组成，便于外源DNA的转化。 – 营光合自养生长，培养条件简单，只需光、CO2、无机盐、水和 适宜的温度就能满足生长需要。 – 多种蓝藻含内源质粒，为构建蓝藻质粒载体提供了极好的条件。 – 蓝藻富含蛋白质，并且多数蓝藻无毒，早已用作食物或保健品， 在此基础上采用转基因技术，把一些重要药物的基因转入无毒 蓝藻，就可达到锦上添花的效果。
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关于细菌的感受态本质与存在
• 局部原生质体化假说——细菌表面的细胞壁结构发生变化， 即局部失去细胞壁或局部溶解细胞壁，使DNA分子能通过 质膜进入细胞。
• 酶受体假说——感受态细胞表面形成一种能接受DNA的酶 切位点，使DNA分子能进入细胞。 通常制备高效转化的感受态细胞的方法是：在冰浴中，用 一定浓度的CaCl2处理对数生长期的细菌。 CaCl2处理后的细菌一般4℃可保存48h,用于转化，大多数 能在1-2天内具有吸收外源DNA的能力。
(二)枯草杆菌受体细胞
• • 枯草杆菌又称枯草芽孢杆菌，是一类革兰氏阳性菌。 优点： 1. 枯草杆菌具有胞外酶分泌－调节基因，能将具有表 达的产物高效分泌到培养基中，大大简化了蛋白表 达产物的提取和加工处理等，而且在大多数情况下， 真核生物的异源重组蛋白经枯草杆菌分泌后便具有 天然的构象和生物活性。 2. 枯草杆菌不产生内毒素，无致病性，是一种安全的 基因工程菌。 3. 枯草杆菌具有芽孢形成的能力，易于保存和培养。 4. 枯草杆菌也具有大肠杆菌生长迅速、代谢易于调控、 分子遗传学背景清楚等优点。 应用：已成功的用于表达人的β干扰素、白细胞介素、 乙型肝炎病毒核心抗原和动物口蹄疫病毒VPI抗原等。
基因工程中常用的受体细胞类型：
• 原Байду номын сангаас生物细胞 • 真核生物细胞
– 真菌细胞 – 植物细胞 – 动物细胞
一、原核生物细胞
优点：
1. 大部分原核生物细胞无纤维素组成的坚硬细胞壁，便 于外源DNA的进入。 2. 没有核膜，染色体DNA没有固定结合的蛋白质，为外 源DNA与裸露的染色体DNA重组减少了麻烦。 3. 原核生物多为单细胞生物，容易获得一致性的实验材 料，并且培养简单，繁殖迅速，实验周期短，重复实 验快。 4. 基因组小，遗传背景简单，并且不含线粒体和叶绿体 基因组，便于对引入的外源基因进行遗传分析。
至今被用作受体菌的原核生物有大肠杆菌、 枯草杆菌、蓝细菌等。
(一) 大肠杆菌受体细胞
• 大肠杆菌属革兰氏阴性菌，它是目前为止研究得最为 详尽、应用最为广泛的原核生物种类之一，也是基因 工程研究和应用中发展最为完善和成熟的载体受体系 统。 • 优点：繁殖迅速、培养简便，代谢易于控制。 • 缺点：大肠杆菌细胞间隙中含有大量的内毒素，可导 致人体热原反应。
重组体分子导入受体细胞的途径 将外源重组体分子导入受体细胞的途包括转化、转染、 转导、显微注射、电穿孔等多种方式。这些途径将随载 体种类和受体系统的不同而异。转化和转导主要适应于 细菌一类的原核细胞和酵母这样的低等真核细胞，而显 微注射和电穿孔主要应用于高等动植物的真核细胞。
把带有目的基因的重组质粒DNA引入受体细胞的过程称为转化 （transformation）。
将重组噬菌体DNA直接引入受体细胞的过程称为转染 （transfection）。 若重组噬菌体DNA被包装到噬菌体头部成为有感染力的噬菌体颗 粒，再以此噬菌体为运载体，将头部重组DNA导入受体细胞中， 这一过程称为转导（transduction）。
转化反应
DNA分子转化的过程如下： 1.吸附——完整的双链DNA分子吸附在受体菌的表面； 2.转化——双链DNA分子解链，单链DNA进入受体菌，另一链降解； 3.自稳——外源质粒DNA分子在细胞内又复制成双链环状DNA； 4.表达——供体基因随同复制子同时复制，并被转录、翻译。 有的实验结果表明，进行转化的是双链DNA，有的则证明吸附在 细胞表面的是双链DNA,但是以单链DNA进入细胞。 至于质粒DNA转化质粒构型的关系，认为只有闭环DNA与开环DNA 的转化，才能获得转化子，而线性质粒DNA进行转化不能得到转 化子，因为用超螺旋闭合环状和开环质粒转化大肠杆菌不会受 到菌体酶的破坏。
缺点：
1. 原核生物细胞不具备真核生物的蛋白质折叠复性系统， 即使真核生物基因能得到表达，得到的多是无特异性空 间结构的多肽链。 2. 原核生物细胞缺乏真核生物的蛋白质加工系统，而许多 真核生物蛋白质的生物活性正是依赖于其侧链的糖基化 或磷酸化等修饰作用。 3. 原核细胞内源性蛋白酶易降解异源蛋白，造成表达产物 不稳定。
二、丝状真菌受体细胞
霉菌的基因结构、表达调控机理，以及蛋白质 加工与分泌都具有真核生物的特征，利用其表达 高等动植物基因具有原核生物细胞无法比拟的优 点。 霉菌培养条件简单，可以大规模培养； 霉菌可以分泌表达目的基因产物，大大简化目 标产物的分离纯化过程。
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(三) 蓝细菌（蓝藻）
• 蓝藻——又称蓝绿藻或蓝细菌，它含有叶绿素a(缺乏叶 绿素b)和藻胆素，具有光合系统Ⅰ (PS Ⅰ) 和光合系统Ⅱ (PS Ⅱ)、能进行光合作用，但它又具有细菌的特征，无 细胞核及双层膜结构的细胞器，染色体裸露，是一种典 型的原核生物。 • 蓝藻作为表达外源基因的受体菌兼具微生物和植物的优 点，具体表现在：
作为基因工程的宿主细胞必须具备以下特性：
① ② ③ ④ ⑤ ⑥ ⑦ ⑧ 便于重组DNA分子的导入； 能使重组DNA分子稳定存在于细胞中； 便于重组体的筛选； 遗传性稳定高，易于扩大培养或发酵生长； 安全性高，无致病性，不会对外界环境造成生物 污染； 有利于外源基因蛋白表达产物在细胞内的积累， 或促进外源基因的高效分泌表达。 在遗传密码的应用上无明显偏倚性； 具有较好的翻译后加工机制，便于真核目的基因 的高效表达； 在理论研究和生产实践上有较高的应用价值。