植物原生质体技术及其应用中国蓉亏通报2009,25(08):22—26ChineseAgriculturalScienceBulletin植物原生质体技术及其应用于晓玲,李春强,彭明(中图热带农,『科学院热带生物技术研究所,海口571101)摘要:原生质体技术是在原生质体分离基础上,进行一系列技术操作,包括原生质体融合,遗传转化,植株再生等.原生质体技术为细胞杂交,新品种培育,及其与有关的细胞,分子和遗传等学科的交叉渗透,提供一种使用范围广,可行性强的技术体系.阐述了植物原生质体的分离培养,遗传转化等关键技术及其应用,认为原生质体技术在高等植物遗传性状的改良及生产实践中有着广阔的应用前景.关键词:原生质体;制备;遗传转化中图分类号:$336文献标识码:A AdvancesontheResearchofProtoplastTechnologyYuXiaoling,LiChunqiang,PengMing(b~tituteofTropicalBioscienceandBiotechnology,ChineseAcademyofTropicalAgricultu ralSciences,Haikou571101)Abstract:ProtoplasttechnologyisaseriesoftechnicaloperationsbasedOilprotoplastisolati on,includingprotoplastfusion,genetictransformation,andplantregenerationandSOon.Theprotoplastte chnologiesprovideawideuserangeandfeasibletechnologysystem,forcellhybridizationandbreedingofnewsp ecies,andcross—infiltrationamongsubjectsofcellculture,molecularandgenetics.Inthispaper,theseparation ,cultureandapplicationofprotoplasttechniqueweresummarizes.Webelievethattherehasfartherap plicationinthegeneticimprovementofhigherplantsandpractice.Keywords:protoplast,preparation,genetictransfonnation植物原生质体是指去除细胞壁被质膜所包围的,具有生活力的细胞,其结构包括细胞膜,细胞质(包括各种细胞器,细胞骨架系统及胞基质)和细胞核等部分.原生质体技术是指在原生质体的分离培养基础上进行的一系列技术操作,主要包括原生质体植株再生,原生质体融合和细胞杂交,转基因等培育变异新类型的生物技术等.原生质体培养和植株再生技术具有使用范围广,可行性强等优点,是植物生物工程的基础.对植物原生质体的研究,可追溯到20世纪60年代,英国植物学家Cockingt用酶解方法降解细胞壁,获得了番茄根尖原生质体,自此原生质体的研究得到迅速发展.1970年Nagata和Takeble口首次报道烟草叶肉原生质体经分离,培养得到再生植株.Carlson于1972年利用原生质体融合技术从烟草中获得第一个种间杂种,可部分克服有性杂交不亲和性,获得体细胞杂种,从而为创造和选育优良品种找到了一条新途径.近年来,由于原生质体具有结构简单,发育同步性好,群体数量大,DNA分子易于进入细胞,易获得纯合性转化子的特点,及其培养技术与有关的细胞,分子和遗传等学科的交叉渗透,使植物原生质体的研究越来越受到重视.研究领域也从分离原生质体进行的生理生化和利用不同材料的原生质体得到再生植株的阶段转到原生质体的应用(尤其是遗传性状改良)方面.笔者对植物原生质体的关键技术及其应用进行综述.1原生质体的分离和培养1.1原生质体的分离1.1.1分离方法原生质体的分离方法有两种:机械分离法和酶解分离法.机械分离法由于产量低,方法繁琐费力;以及对分生组织和液泡化程度不高的细胞不适用的特点,现在已很少有人使用.基金项目:中国热带农业科学院中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金资助"橡胶转基因技术平台的建立"(ITBBZD0711)a第一作者简介:于晓玲,女,1979年出生,硕士,研究方向:基因工程通信地址:571101海南省海口市城西学院路4号热带生物技术研究所,E—mail******************.收稿日期:2009.O1.07,修回日期:2009.02.18.于晓玲等:植物原生质体技术及其应用?23?酶解分离法为目前普遍采用的原生质体分离方法.酶解是在25～28℃的恒温,黑暗或弱光下进行;酶解后经过O.038nlnl孔径左右的镍丝网过滤,滤去消解不完全的组织碎块(导管,筛管等)和细胞团.然后将滤液离心,弃去上清液,将离心下来的原生质体重新悬浮在洗液(CPW)中,再次离心,去上清液,重复3次.在倒置显微镜下检查纯化效果,效果好,用原生质体培养基离心,效果不好,用质量分数为20%的蔗糖离心,使完整的原生质体浮于液面.1.1.2影响原生质体分离的因素植物材料的选择,预处理过程,酶制剂的使用等均可影响原生质体的分离效果.(1)材料选择适宜材料是成功分离原生质体的关键,主要包括基因型,材料的类型及材料的生理状态等方面.基因型影响原生质体分离的效果,包括原生质体产量, 活力和植株再生方面.材料及其生理状态对原生质体的制备和活力的影响也很大阁.叶片可以得到大量比较均一的原生质体且不使母细胞受到破坏,许多资料报道双子叶植物分离原生质体的最佳材料是叶片p.此外,子叶,胚轴,茎尖及愈伤组织,悬浮培养物和体细胞胚等均可作为分离原生质体的材料.在木本植物中,愈伤组织或细胞悬浮物是应用最广泛的原生质体培养材料u.但是,采用愈伤组织和细胞悬浮物往往需要经若干次的继代培养才能达到适合分离原生质体的状态;而继代时间的长短在很大程度上影响所获得原生质体的活力和产量n".(2)预处理许多研究报道,酶解之前对材料进行预处理有利于原生质体的分离,对保持原生质体的完整性及提高原生质体的产量都有积极的作用.Power等[1报道,酶解以前对材料进行暗处理,有利于原生质产量的提高.Willin等同把苹果叶片放在附加质量分数为5% PVP并添加0.5mmol/L的蛋氨酸的W5盐.糖溶液中处理30min,原生质体的产量明显提高.金晓玲等的研究表明,在分离草莓叶肉原生质体前将试管苗转入低浓度蔗糖的培养基中预培养2～3周,或暗处理1周,原生质体的产量大大提高【8].但是并非所有的原生质体分离都需要经过预处理,如柑桔试管苗幼叶原生质体的游离.在实验中,材料是否需要预处理要根据不同的情况而定.(3)酶制剂酶的类型及使用浓度:目前用于游离原生质体常用的酶有纤维素酶,半纤维素酶,果胶酶和离析酶等,其中纤维素酶和果胶酶对植物原生质体的制备是最必要的.酶液中纤维素酶与果胶酶或离析酶的浓度和比例对原生质体的解离效果具有较大的影响【".酶制剂的选择要根据材料的不同而定.此外,由于不纯的酶制剂所含杂质对原生质体可能有不同程度的毒害作用,因此,也要特别重视酶的质量和来源.酶液浓度过高或过低均不利于原生质体的解离.而酶浓度随其酶活性高低而异,且每批次酶活性不一,因此不同批次的酶宜先进行最佳浓度预实验.酶液添加物:酶液对原生质体的产量和活力有很大影响.原生质体在无稳压剂的介质中会因过分吸胀而裂.过高或过低的渗透压对原生质体均有损伤,不利于以后的培养.常用的渗透压稳定剂有两大类:一类为糖醇或可溶性糖(如甘露醇,山梨醇,蔗糖或葡萄糖等)组成有机溶液;另一类为无机盐溶液,常由CaC1:,MgSO或培养基中的无机盐组成.通常用甘露醇,山梨醇,葡萄糖来调节酶液的渗透压.W巴尔茨(1983)等认为,代谢活跃的渗透压稳定剂(葡萄糖和山梨醇)与代谢不活跃的渗透压稳定剂(甘露醇)一起使用有利于维持酶液的渗透压.由于酶制剂中常含有核酸酶,影响原生质体的活力,可以用降低保温温度或减少酶解时间,提高原生质体的活力.加入适量的PVP或MES能稳定酶解过程的pHt】.酶液的处理时间:酶解处理～般静置在黑暗中进行,也可偶尔轻摇,酶解时间几小时至几十小时不等. 实践表明:如果酶液处理时间太短,所获得的原生质体量少而不能满足实验的需要,但过长时间酶液又会对原生质体具有一定的伤害作用,从而影响原生质体的产量和细胞壁再生的能力.因此,为了获得大量的具有高活力的原生质体,酶解时间一般以12～14h为宜.酶解温度一般在27℃左右.1.2原生质体的培养1.2.1培养基原生质体的培养基多采用以MS培养基为基础的改良培养基,一般酸度为pH5.6—5.8.无机盐是构成培养基的主要成分,较高的Ca2浓度能提高原生质体的稳定性.高浓度的NH4+对原生质体的生长发育不利".实验证明糖是原生质体培养中较理想的渗透压稳定剂和碳源【l.抗氧化剂(甘氨酸,PVP(聚乙烯吡咯烷酮),维生素C等)的添加可较好地防止木本植物原生质体再生细胞团的褐化现象[2o1.细胞壁脱离后,随着培养天数的增加,RNase酶活性异常升高,加入BSA可降低该酶的活性,保证原生质体的活力".不同植物原生质体培养对激素的种类和浓度的要24?中国农学通报求存在很大的差异,通常在培养前期需要较高水平的生长素和细胞分裂素,才能启动细胞壁的再生和细胞分裂.1.2.2培养方法原生质体的培养方法主要有液体培养,固体培养和固液结合培养等.液体培养法操作简单,对原生质体损伤较小,且易于添加新鲜培养物,但此法常会使原生质体分布不均匀,发育的原生质体之间产生粘连而影响其进一步的生长和发育,尤其是难以定点观察单个原生质体的命运.最简单的固液结合培养法是在培养皿的底部先铺上一薄层含或不含原生质体的固体培养基,再在其上进行原生质体的液体浅层培养,此法有利于固体培养基中的营养成分(或细胞有用代谢物)缓慢地向液体培养基中释放,以补充培养物对营养的消耗,同时培养物所产生的有害物质也可被固体培养基吸收.固体培养法是将原生质体与含琼脂或低熔点琼脂糖的培养基相混合,其中尤其是低熔点琼脂糖固体包埋法可有效地防止液体培养中原生质体出现聚集现象,减轻原生质体局部区域的褐化,并可减轻因凝集而产生的植板率和分裂率统计的困难.它是既便于定点观察,又有利于追踪原生质体再生细胞的发育过程,因此是一种最为有效的培养方法.培养方法作为原生质体再生植株的关键一环,目前已愈来愈引起人们广泛的重视,其总体思路主要围绕着避免原生质体在培养过程中受到机械或化学伤害,使原生质体处于最佳的营养吸收状态,多种培养方法相结合等几个方面展开.Schween等口报道,近年来一种装有玻璃纸层的培养皿被广泛用于原生质体的培养中.1.2_3培养密度原生质体培养的常规技术是群体培养,培养密度对细胞的生长十分重要.密度条件一般在5×10～5×10个/ml时,植物原生质体才能正常的分裂与发育口.密度过高时,由于营养不足或细胞代谢物过多而抑制再生细胞的正常生长:密度过低时,又会使与分裂有关的物质达不到一定的浓度而使再生细胞不能持续分裂.1.3原生质体的低温保存原生质体从制备到转化操作繁琐,每次进行原生质体操作前都必须进行酶解,分离等步骤.为节约时间,避免药品的浪费,需要使原生质体在一段时间内保持其原生质体状态,不形成或减慢形成细胞壁,并保持原生质体的活力.原生质体的超低温保存为此提供了可能.早在20世纪70年代末,Withers和Street首次运用5%DMSO做保护剂,经液氮保存后,胡萝卜的原生质体的存活率达90%.此后,多种原生质体超低温保存获得成功].2原生质体的转化2.1生物介质介导的遗传转化目前应用的生物介质主要是根癌农杆菌和发根农杆菌.它们转化的原理分别是通过活化Ti和质粒的Vir区基因,达到对T-DNA转移的目的.外植体与农杆菌的共培养是获得转化植株的重要途径.根癌农杆菌转化频率比发根农杆菌转化频率高,并能直接从农杆菌转移基因到植物细胞核基因组,是目前较理想的转化系统.徐子勤等1以根癌农杆菌为介质转化苜蓿原生质体取得成功.由于不同品种或同一品种的不同器官或组织的再生能力不同,因此利用农杆菌进行遗传转化之前,首先要对不同的外植体建立相应的高效再生体系.2.2细胞融合法PEG介导法由Davey等.首先建立,主要原理是借助细胞融合剂诱导原生质体摄取外源DNA.PEG法的融合率可达10%～15%,无种属特异性,几乎可诱导任何原生质体的融合[28】.Rasmusse等通过PEG介导法将Gus基因导入油菜的原生质体.Panhar等p.研究PEG介导法指出,用CaC1处理原生质体及低剂量的紫外线处理可以提高DNA的摄取和外源基因的表达.20世纪80年代初开始探索使用电融合法,是目前最流行的物理诱导融合方法p".细胞电融合利用细胞在相对电极之间的介电电泳,诱导细胞按特定方向排列,通过电极间产生的较高场强的电脉冲使相互接触的细胞发生电穿孔,进而发生电融合.近年来,已经测出数十种植物原生质体的电融合参数,并获得部分细胞杂种.2.3激光微束穿刺法激光微束穿刺法就是利用直径很小,能量很高的激光微束引起细胞膜可逆性穿孔,从而使处于细胞周围的外源DNA随之进入细胞的转基因方法.早在1987年,Weber等p就利用微束激光照射油菜细胞,将荧光素标记的外源DNA导入叶绿体,观察到荧光显示, 并且发现这一处理对细胞的分裂能力和叶绿体的光合能力影响较小.由于激光微束穿刺技术操作简便,转化频率高,从而引起了许多科学家的重视,由此带动了此项技术在原生质体遗传转化中的应用与发展.激光微束穿刺法操作简便,对细胞的损伤小,可以准确定位于被照射的细胞,实验重复性好,已成为一种行之有效的转基因手段.但与农杆菌介导法相比,激于晓玲等:植物原生质体技术及其应用?25?光微束穿刺法转化效率较低,且激光微束仪设备复杂, 造价昂贵,因此限制了此技术的推广普及.2.4电击法电击法是利用高压电脉冲作用,在原生质体膜上"电击穿孔",形成可逆的瞬间通道,从而促进外源DNA的摄入,此法在动物细胞中应用较早,并取得了很好的效果.现在这一方法已被广泛应用于各种植物,例如Guerche等用纤维素酶处理油菜2周龄的嫩叶后获得原生质体,于电击仪中电击转化处理,筛选得到了21个抗性克隆,并最终获得了2株转化植株,其形态和育性完全正常;黄家总等p成功的利用电击细胞融合的方法使紫罗兰和桂竹香原生质体融合.该方法对细胞没有毒害作用,并且操作简便,融和同步性好,可在显微镜下观察融合的全过程,整个过程中的参数容易控制.至今已广泛应用于动植物及微生物细胞的融合.2.5其他方法目前植物基因工程中除了运用上述方法外,还有一些其他方法,如脂质体法,显微注射法等.脂质体法就是将包含外源基因的带负电荷的脂质体与植物原生质体融合,从而达到转基因的目的;显微注射法是利用显微注射仪将外源DNA直接注入受体细胞质或细胞核中.这些方法各有其优缺点及适用范围,在油菜育种中运用较少,而在其他作物上有成功的报道.3原生质体技术的应用由于原生质体失去了细胞壁这一屏障,因而使其具有特殊的优点.原生质体不仅可作为一个单细胞系统来研究细胞壁再生,细胞分裂与分化,摄入细胞器, 病毒侵染机理,膜透性及离子转运等基础理论研究的理想材料;同时还是原生质体培养和原生质体融合的基础[36].而且,近年来以原生质体为材料利用膜片钳技术研究离子通道及原生质体在受光,胁迫和激素作用后的调节机制已成为研究的热点.此外,原生质体也被用来作为研究植物细胞钙信号转导及其调节机制的理想材料_3s】.原生质体融合技术可以高效地将供体的目标性状基因转移给受体,解决种间杂交不亲和的缺点,为品种遗传改良,遗传工程和作物改良提供了多种可能.植物原生质体融合技术已在多种植物中获得成功的应用弘Ⅻ.利用原生质体导入外源基因不存在不亲和问题,且没有细胞壁的障碍,便于进行遗传转化操作.人们对利用原生质体导入外源基因及原生质体瞬间表达系统在基因研究中的应用进行了大胆的尝试和实践.杨仲南等【39通过PEG介导研究了外源GUS基因在花椰菜原生质体中的瞬间表达.薛红卫等4o]将GUS基因导人甘蓝下胚轴原生质体并获得转基因植株.Eimert等[4l用花椰菜叶肉原生质体,通过电激法转化得到了抗性芽.Mukhopadhyal等用甘蓝下胚轴原生质体在PEG的介导下,直接摄取了质粒DNA,转化频率为10%～33%,而且获得了转化再生植株㈣.目前,已经建立对芹菜,玉米,胡萝卜,拟南芥和烟草等植物对不同的外界刺激下信号转导机制的研究[431,以及应用原生质体单核化技术解决杂交育种难题等.这对植物遗传转化,性状改良等方面都具有深刻的指导意义【一.4展望几十年来,原生质体技术在细胞生物学,生物工程学,生理学,遗传学,病理学,病毒学和育种学等研究领域中都得到了应用.植物原生质体技术得到了迅速的发展,并取得了可喜的成绩,主要表现在通过原生质体获得再生植株的植物种类不断增加,包括林木,观赏植物,药用植物,果树和作物等.虽然对植物原生质体的研究取得了很大的进展,但是利用原生质体技术改良高等植物的遗传性状并将之运用于生产实践中还有一些距离.今后应重点在以下几个方面开展工作:(1)进一步扩大原生质体培养材料的种类及基因型;(2)加强对原生质体再生植株无性系变异的细胞遗传学研究;(3)继续加强原生质体融合方式方法与应用的研究;(4)加强利用原生质体融合技术进行遗传性状改良的研究.参考文献[1]CockingEC.Amethodfortheisolationofplantprotoplastsand vacuoles.Nature,1960,187:927—929.【2】Nagatat,takebei.Cellwallregenerationandcelldivisioninisolated tobaccomesophyllprotoplasts.Planta,1970,92:301—308.【3】刘继红,邓秀新.植物原生质体非对称融合及其在育种上的应用. 生命科学,1999,l1(增刊):88—91.[4】Patta-ochattEM,POWERJB.Advancesinplantregeneration fromappleprotoplasts.ActaHorticulture,1990(5):285-288.[5]NymanM,wallinA.Plantregeneationfromtrawberry(Fmgaria×ananSSa)mesophyllprotoplasts.PlantPhysiol,1998,133:375—377.[6】wallina,welanderM.Improvedyieldofappleleafprotoplastsfrom invitroculturedshootsbyusingveryyoungleavesandaddingL-methioninetotheshootmedium.PlantCellTissueandOrganCulture,1985,5:69—72.[7]Huancanma-peralesE,shibateM.Plantregenerationfromleaf protoplasmofapple.PlantCellTissueandOrganCulture,1993,34:71.76.【8】金晓玲,何平.木本植物原生质体培养与融合研究进展.浙江师范大学学报:自然科学版,2003,26(1):54.59.26?中国农学通报【9】floj[12】[13】[14][15】[16]【17]f18】[19][2O】[21][22][23】[24】【25】[26]【27][28沈前华,杨柏云,郭金平,等.大花蕙兰原生质体分离的影响因素研究.江西农业学报,1996,8(1):36—40.陈正华.木本植物组织培养及其应用.北京:高等教育出版社.1986: 92—109.陆荣生,韩美丽.木本植物原生质体培养研究进展.广西林业科学, 1998,27(4):197—201.PowerJB,DaveyMR,AnthonyP'eta1.Protoplastcultureand regeneration.In:GoodmanRM,ed.Encyclopediaofplantand cropscience.NewY ork:MarcelDekkerInc,2004:1065—1068. OchaRsJ.CAS0OH.Shootregenerationfromleafmesophyll protoplastsofwildpear(f瑚c0mmunvapyrasterL.).PlantPhysiol,1986,122:243—249.TautorusTE,FOWKELC.Somaticembryogenesisinconifers. CanJBot,1991,69:1873—1899.f西德】巴尔茨赖因哈德E岑克MH.植物组织培养及其在生物技术上的应用.夏镇奥译.北京:科学出版社.1983:205—211. OchattsJ.Woodyplantprotoplasttechnologyrevisisted.Acta Hoaiculturace,1993,336:285—295.V onarnoldS,ERIKSSONTArevisedmediumforgrowthofpea mesophyllprotoplastsPlantPhysiol,1977,39:257-260. UpadhyamD.Isolationandcultureofmesophyllprotoplastsofpotato(SalanumtuberosunL.).PotatoRes,1975,18:438-445.卫志明,许智宏,许农,等.悬铃木叶肉原生质体培养再生植株.植物学报,1991,33(11):813.818.马锋旺,李嘉瑞.抗氧化剂对杏和中国李原生质体培养的影响.西北农业学报,1998,26(6):10.13.赵颖,梁海曼.植物原生质体培养及有关生理基础问题.广西植物, 1994,14(1):74—80.SchweenG,HoheA,KopfivovaA,eta1.Effectsofnutrients, celdensityandculturetechniquesonprotoplastregenerationand earlyprotonemadevelopmentinamoss,Physcomitrellapatens. PlanPhysiol,2003,160:209-212.MichaelR,Dave~PaulAnthony,J.BrianPower,eta1. Plantprotoplasts:statusandbiotechnologicalperspectives. BiotechnologyAdvances,2005:1-41.张士坡,钱迎倩.植物原生质体培养.北京:科学出版社,1991:41—46. 徐子勤,贾敬芬,胡之德.苜蓿根癌农杆菌转化系原生质体培养研究.武汉植物学研究,1997,15(3):283—285.MRDavey,AKumarHigherplantprotoplasts—retrospectand prospect.IntRevCytolSuppl,1983,16:219—299.FAKrens,LMolendijk,GJWullems,eta1./nvitrotransformation ofplantprotoplastswithTi?plasmidDNA,Nature,1982,296:72-74.徐文锦,刘湘,宁勇.植物原生质体融合技术的研究进展,湖北中医学院学报,2008,10(1):46-48.[29】RasmussenJO,rasmussenOS.PEGmediatedDNAuptakeand transientGusexpressionincarrot,rapeseedandsoybeanprotoplants.PlantSci,1993(89):199—207.[301PariharDs,maheshwariSC,PARAMJITKeta1.Influenceofheat shockanduvirradiationonPEG—mediatedDNAuDtakeand transientexpressionofNPTIIgeneinprotoplastsofBrassieanapas. IndiardofExpbio,1998,36(10):1002—1006.f31]Cora/G.ElectrofusionofSacchavonmyeescerevisiaeat~xotropphic mutantsofidenticalmatingtypeusingalaboratory-madesysteni. TurkishJournalofBiology,2003,27(1):1—5.【32】汪和睦,谢廷栋.细胞电穿孔,电融合,电刺激一原理技术及应用. 天津:天津科学技术出版社,2000:183—196.【33】WeberG,monajembashiS,GREULICHK0.UptakeofDNAin chloroplastsofBrassicanapusbymeansofamicro—focusedlaserbeam.EurJCellBiol,1987(43):63—65.【34】GuercheCHARBONNIERM,JOUANINL.Directgenetransfer byelectroporationinBrassicanapus.PlantSci,1987(52):Il1-116.[35】黄家总,冈田芳明,傅家瑞.紫罗兰与桂竹香原生质体培养及电激细胞融合的研究.中山大学学报:自然科学版,2003,42(3):64—68. [36]夏镇澳.植物原生质体的理论研究//孙勇如,安锡培.植物原生质体培养E京:科学出版社,1991:7—12.【37]GilroyS,jonesRL.Gibberellicacidandabscisicacidcoordinately regulatecytoplasmiccalciumandsecretoryactivityinbarely aleuroneprotoplasts.ProcNatlAcadSciUSA,1992,89:3591—3995.【38】KnightMR,anthonyKC,STEVENMS.Transgenicplant aequorinreportstheeffectsoftouchandcold—shockandelicitorson cytoplasmiccalcium.Nature,1991,352:524.【39]杨仲南,许智宏.外源GUS基因在PEG介导的花椰菜原生质体中的瞬间表达.植物生理学报,1994,20(3):272.[401薛红卫,卫志明.转化脂介导甘蓝转化获得转基因植株.科学通报, 1996,41(4):358.【41]EimertSiegemundFTransformationofcauliflower(Brassica oleraeeaL.var.botrytis)andexperimentalsurvey.PlantMolecular Biology,1992,19(3):485—490.[42】MukhopadhyalA,TopferR,PredhanAeta1.Efjfjfjf~/ent regenerationofBrassicaoleraceahypocotylsprotuplastsgenericand llighfrenquencytransformationbydirectDNAuptake.PlantCellRep,1991,10:375.'【43]Jensheen.SignaltransductioninmaizeandArabidopsismesophyU protoplasts.PlantPhysiology,2001,127(4):1—446.[44]孙敬三,桂耀林.植物细胞工程实验技术.北京:科学出版社,1995: 1.】9.。
