综合实验一：植物原生质体的分离、融合与培养

实验五植物原⽣质体的分离和培养实验四植物原⽣质体的分离和培养实验⽬的掌握植物原⽣质体分离和培养的基本⽅法，并对培养的结果进⾏初步观察。

实验原理原⽣质体是除去细胞壁的裸露细胞。

在适宜的培养条件下，分离的原⽣质体能合成新壁，进⾏细胞分裂，并再⽣成完整植株。

植物的幼嫩叶⽚、⼦叶、下胚轴、未成熟果⾁、花粉四b咻、培养的愈伤组织和悬浮培养细胞均可作为分离原⽣体的材料来源。

分离愿⽣厦籀萨采⽤酶解法。

其原理是根据由纤维素酶、罘胶酶和半纤维素酶配制⽽成的溶液对细胞壁成分的降解作⽤，⽽使原⽣质体释放出来。

原⽣质体的产率和活⼒与材料来源、⽣理状态、酶液的组麟，以及原⽣质体收集⽅法有关。

酶液通常需要保持较⾼的渗透压，以使原⽣质体在分离前细胞处于质壁分离状态，分离之后不致膨胀破裂。

渗透剂常⽤⽢露醇，⼭梨醇，葡萄糖或蔗糖。

酶液中还应含⼀定量的钙离⼦，来稳定原⽣质膜。

游离出来的原⽣质体可⽤过筛⼀低速离⼼法收集，⽤蔗糖漂浮法纯既，然后进⾏培养。

实验⽤品⼀、材料1.烟草幼苗的叶⽚、或向⽇葵⽆菌苗的叶⽚、⼦叶或下胚轴等。

2.胡萝⼘根切⽚诱导的松软愈伤组织。

⼆、器材超净⼯作台、台式离⼼机或⼿摇离⼼机、倒置显微镜、普通显微镜、培养室、灭菌锅、⾎细胞计数板、⽯蜡膜带等。

细菌过滤器和0·45µm的滤膜、300⽬不锈钢⽹筛及配套的⼩烧杯、解剖⼑、尖头镊⼦、注射器(5、10m1)和12号长针头、带⽪头的刻度移液管(5、10ml，上部管⼝加棉塞)、培养⽫(直径6cm)或扁平培养瓶(50m1)、⼤培养⽫、吸⽔纸等、使⽤前需经过灭菌。

三、试剂1. 70％酒精。

2. 0.1％升汞⽔溶液，并滴⼊少许TWeen 80。

3. 灭菌蒸馏⽔。

4. 0.16mo／L和0.20mo／L CaCl2·2H2O溶液，并加有0.1％MES（2-N-吗啉已烷磺酸），PH5.8~6.2。

5. 20％和12％蔗糖溶液，pH PH5.8~6.2。

实验七植物原生质体的分离与融合一、实验目的：1、掌握原生质体分离的方法；2、了解并掌握利用PEG原生质体融合的原理和方法。

二、实验原理：PEG为一种高分子化合物，能与水、蛋白质、和碳水化合物等一些基团能形成氢键。

普遍认为聚乙二醇分子能改变各类细胞的膜结构，使两细胞接触点处质膜的脂类分子发生疏散和重组，由于两细胞接口处双分子层质膜的相互亲和以及彼此的表面张力作用，从而使细胞发生融合。

该方法的优点是：用法简单，容易获得融合体，融合效果好。

三、实验材料：（1）韭菜或大蒜叶；（2）红辣椒四、实验步骤：Ι 植物原生质体的分离与纯化1、将撕去表皮的植物叶片和果肉置于酶液（PH 5.4_5.8,去表皮面接触酶液），在25℃黑暗条件下，酶解0。

5小时。

2、用200目网过滤除去未完全消化的叶片等残渣。

3、在1000rpm条件下离心5分钟，弃上清液。

红辣椒800转/分离心5分钟。

加入3～4ml13%CPW洗液，相同条件下离心，弃上清液。

加1ml 13%CPW洗液悬浮。

4、蔗糖漂浮法去除碎片。

** 蔗糖漂浮方法：（1）用细口吸管吸20%蔗糖溶液约3ml，小心插入盛有原生质体悬液的离心管底部，缓缓将蔗糖溶液挤出，由于比重不同，蔗糖溶液与原生质体悬液中间有一明显界面(注意要有明显界面).(2)离心5分钟（1000转/分，辣椒800转/分），此时死细胞及碎片降至蔗糖溶液内，聚集在离心管底部，而活细胞由于有大量泡沫，故漂浮在上下界面处(3)用细管吸取漂浮在上下界面处的健康原生质体，转入干净的离心管中，加入3～4ml13%CPW洗液离心（镜检决定是否需要离心），离心5分钟（1000转/分，辣椒800转/分），收集沉淀，最终原生质体体积控制在0.5ML左右。

Ⅱ细胞融合1．不同的原生质体各300μl与带盖离心管中，另加入300μl 40% PEG液，30℃水浴中温浴15min；2．融合液一滴于载玻片上(注意保持一定湿度，不能太干)，轻轻盖上盖玻片，显微镜观察。

植物原生质体的分离实验实验一植物原生质体的分离与培养一．教学目标：熟悉植物原生质体作为细胞工程研究的重要意义，熟悉原生质体活性鉴定的原理。

掌握分离与培养原生质体的技术、方法与原理。

掌握细胞活性的检测方法。

掌握细胞计数的原理与方法。

二．重点：掌握分离与培养原生质体的技术、方法与原理。

掌握细胞活性的检测方法。

掌握细胞计数的原理与方法。

三．难点：分离与培养原生质体的技术。

四．授课方式与教学方法：讲解原理、实验操作示范或者具体指导。

五．教学内容:实验原理植物原生质体(protoplast)是除去细胞壁后为原生质所包围的“裸露细胞”,是开展基础研究的理想材料。

其中,酶解法分离原生质体是一个常用的技术,其原理是植物细胞壁要紧由纤维素、半纤维素与果胶质构成,因而使用纤维素酶、半纤维素酶与果胶酶能降解细胞壁成分,除去细胞壁,即可得到原生质体。

由于原生质体内部与外界环境之间仅隔一层薄薄的细胞膜,务必保持在渗透压平衡的溶液中才能保持其完整性, 使原生质体分离后不致膨胀破裂，渗透剂常用甘露醇或者蔗糖，酶液还应含一定Ca2+来稳固原生质膜。

其次,还应当考虑取材、酶的种类与纯度、酶液的渗透压、酶解时间及温度等因素对分离原生质体的影响。

将原生质体接种在培养基上进行培养，细胞壁再生，细胞分裂与再生植株。

测定原生质体的活性有多种方法。

荧光素双醋酸酯(FDA)染色是常用的一种方法,FAD 本身无荧光,无极性,可透过完整的原生质膜。

一旦进入原生质体后,由于受到酯酶分解而产生具有荧光的极性物质荧光素。

它不能自由出入原生质膜,因此有活力的细胞能产生荧光,无活力的原生质体不能分解FAD无荧光产生。

细胞计数通常用血细胞计数极，按白细胞计数法进行计数。

从理论上讲，植物体的任何一部分都能够通过酶解作用去除细胞壁而得到原生质体。

但在实际操作中，只有幼嫩的组织才能完成去壁的过程。

因此，为了制备健康的原生质体，通常选用根尖、茎尖、嫩叶及对数生长期的愈伤组织为材料，一旦细胞具有木质化或者次生加厚的外壁，则不能被酶降解。

《细胞生物学》实验指导书（不太全供参考）适用专业:生物科学、生物技术实验目录实验一植物原生质体的分离与融合•••]实验二动物细胞原代培养•••3实验三细胞传代培养…彳实验四植物细胞骨架的光学显微镜观察••Y实验五细胞凋亡的诱导、观察与检测“I实验六环境因素诱变染色体改组的观察实验七红细胞膜蛋白的分离及其电泳检测 (11)实验一植物原生质体的分离与融合实验项目类型:综合性所属课程名称：《细胞生物学》实验计划学时：7学时一、实验目的1.掌握原生质体分离的原理与技术；2.了解细胞融合的基本原理及应用；3.初步掌握PEG融合法和电融合法.二、实验原理植物原生质体是去除了细胞壁的裸露的细胞.原生质体可以从培养的单细胞、愈伤组织和植物器官（叶等）获得.但一般认为从叶肉组织分离原生质体是理想的材料，其优点是材料来源方便，供应及时，而且遗传性较为一致.原生质体的分离通常采用酶解法，对细胞壁成分进行降解后获得.原生质体培养的条件和对营养的要求与组织、细胞相似.但原生质体由于除去了细胞壁,所以需要一定浓度的渗透压稳定剂来保持原生质体的稳定.常用的渗透压稳定剂包括甘露醇、山梨醇、蔗糖等. 其次，还应当考虑取材、酶的种类和纯度、酶液的渗透压、酶解时间及温度等因素对分离原生质体的影响.2个或2个以上的细胞合并成为1个细胞的现象称为细胞融合.细胞融合的主要方法有病毒法、聚乙二醇(PEG)法和电融合3种方法，其原理基本相同，都是两细胞接触点的膜分子发生重组,然后由于表面张力作用,形成一个球形细胞. 原生质体分离融合和培养的意义：1.除去了细胞壁为植物细胞之间的融合扫平了障碍，为制造新杂种开辟了道路.植物原生质体融合和培养在植物遗传工程和育种研究上具有广阔的应用前景.它是植物同源、异源多倍体获得的途径之一，它不仅能克服远缘杂交有性不亲和障碍，也可克服传统的通过有性杂交诱导多倍体植株的麻烦，最终将野生种的远缘基因导入栽培种中，原生质体融合技术可望成为作物改良的有力工具之一.2.原生质体可摄入外源DNA,细胞器、细菌或病毒颗粒,这些特性与植物全能性相结合为高等植物的遗传饰变打下基础.3.获得细胞无性系和选育突变体的优良起始材料.三、实验仪器与材料1.材料:油菜叶子、白菜花2.溶液或试剂:(1)洗涤液:甘露醇0.7mol/L,CaC12 • 2H2O3.5mmol/L,KH2PO4 0.7mmol/L(pH 5.6),高压灭菌；(2)混合酶液:1.5%纤维素酶,1%果胶酶溶于洗涤液中(pH 5.6).(3)50%PEG(4)高pH高钙稀释液：(5)20%蔗糖溶液(6)DPD培养基：3.仪器或其他用具:超净工作台、灭菌锅、显微镜、恒温培养箱、镶子、解剖刀、剪子、接种针、铝饭盒、锡箔纸、记号笔、橡皮筋、试剂瓶、三角瓶移液管、培养皿、酒精灯等.四、实验步骤(一)原生质体的制备：1.取材:取新鲜油菜叶和白菜花瓣自来水洗净，再用70%乙醇浸泡30S,0.5%次氯酸钠消毒lOmin,无菌水冲洗5次.2.酶解：材料切成1mm宽细丝，加入适量酶液，置摇床上(60〜70rpm),在25〜28°C黑暗条件下，酶解5〜7h.3.分离：用200目网过滤除去未完全消化的残渣，在lOOOrpm条件下离心5分钟,弃上清.加入3〜4ml洗涤液，相同条件下离心2-5分钟，弃上清，留1ml洗液.用滴管将混有原生质体的1ml洗液吸出，轻轻铺于20% 蔗糖溶液上(5ml离心管装3ml 20%蔗糖溶液)，在lOOOrpm条件下离心5-10分钟，由于密度梯度离心的作用，生活力强状态好的原生质体漂浮在20%的蔗糖与洗涤液之间，破碎的细胞残渣沉入管底.用200 u 1移液器轻轻将状态好的原生质体吸出（注意尽可能不要吸入下层的蔗糖溶液），放入另一干净的离心管中，加4ml洗涤液,1000rpm离心2-5分钟, 弃上清.（二）原生质体融合：1.将原生质体用DPD调节浓度为1*105个/mL.2.将原生质体混合物滴入小培养皿，静置8〜10分钟.3.然后滴入50%的PEG溶液，静置2分钟.4.依次间隔5分钟加入0.5ml、1 ml和2 ml高钙高pH洗涤液.注意在第二、三次洗液加入前,用移液器轻轻吸走部分溶液，但不能吸干，否则原生质体破碎死亡;最后用液体培养基洗1〜2次.制片，镜检.五、实验报告画出观察到的融合细胞，并计算融合率.六、思考题1.你认为要获得数量多、生活力强的原生质体，在实验中应注意那些问题？增多数量的方法:多取材且尽量切碎，增加酶浓度，提高酶解温度，延长酶解时间，操作轻柔，勿使原生质体破碎等.提高生活力的方法:取新鲜材料,采用合适的酶浓度、作用温度和时间2.举例说明原生质体融合的应用价值.实验二动物细胞原代培养实验项目类型:基础性所属课程名称：《细胞生物学》实验计划学时：4学时一、实验目的1.掌握动物细胞原代培养的基本方法和操作过程；2.熟悉原代培养细胞观察方法.二、实验原理用直接从机体获取的细胞进行的培养称为原代培养.原代培养是建立各种细胞系的第一步，该技术可以在体外进行各种类型细胞的增殖、遗传、变异、分化和脱分化、恶变与去恶变等研究.分为组织块培养法和消化法两种.三、实验仪器与材料1.材料:小鼠心、肝、脾、肾等2.溶液或试剂：(1)RPMI-1640培养基、小牛血清.(2)0.25%胰蛋白酶、(pH 5.6).(3)Hanks液3.仪器或其他用具:CO2培养箱、倒置显微镜、超净工作台、高压锅、水浴锅、解剖器械、培养瓶、微量加样器、吸管、移液管、酒精灯、酒精棉球等.四、实验步骤1.处死小鼠:将小鼠用颈椎脱臼法处死，放入75%酒精种浸泡消毒.2.取材:在超净工作台中用灭菌的解剖器械剖开小鼠腹腔，辨认并取下肝脏、脾脏和肾脏，放入灭菌的培养皿中，加入Hanks液清洗，然后加入2mL胰蛋白酶液,研磨并过滤.3.将液体转移到离心管,1200rpm离心5min收集细胞,加入适量培养液,C02培养箱培养.4.观察:逐日在倒置镜下观察细胞生长情况.五、实验报告画出细胞贴壁前和贴壁后的形态.六、思考题试述细胞原代培养成功的条件？实验三细胞传代培养实验项目类型:基础性所属课程名称：《细胞生物学》实验计划学时：3学时一、实验目的1.熟练掌握贴壁细胞传代的培养方法；2.观察传代细胞贴壁、生长、繁殖过程中细胞形态的变化.二、实验原理离体培养的细胞群体增殖达到一定密度时，细胞的生长和分裂速度就会减慢甚至停止，如不及时分离传代培养,细胞将逐渐衰老死亡.传代培养是指细胞从一个培养瓶以1:2或其它比率转移，接种到另一培养瓶的培养.贴壁培养细胞的传代通常采用胰蛋白酶消化,把细胞分散成单细胞再传代.三、实验仪器与材料1.材料:原代培养的小鼠细胞或Hela细胞2.溶液或试剂：(1)RPMI-1640培养基、小牛血清.(2)0.25%胰蛋白酶、(pH 5.6).(3)Hanks液3.仪器或其他用具:CO2培养箱、倒置显微镜、超净工作台、高压锅、水浴锅、培养瓶、微量加样器、吸管、移液管、酒精灯、酒精棉球等.四、实验步骤1.将长成单层的细胞从二氧化碳培养箱中取出,在超净工作台中倒掉瓶内的培养液，加入少许消化液.(以液面盖住细胞为宜)，静置5~10分钟.2.在倒置镜下观察被消化的细胞，如果细胞变圆,相互之间不再连接成片，这时应立即在超净台中将消化液倒掉，加入3〜5ml新鲜培养液,吹打, 制成细胞悬液.3.将细胞悬液吸出2ml左右，加到另一个培养瓶中并向每个瓶中分别加3ml 左右培养液，盖好瓶塞，送回二氧化碳培养箱中，继续进行培养.五、实验报告分别画出贴壁生长的小鼠细胞和Hela细胞,并说明二者的不同.六、思考题写出细胞传代培养成功的条件？实验四植物细胞骨架的光学显微镜观察实验项目类型:基础性所属课程名称：《细胞生物学》实验计划学时：3学时一、实验目的了解细胞骨架的结构特征及其制备技术二、实验原理细胞骨架是由蛋白质丝组成的复杂网状结构，根据其组成成分和形态结构可分为微管、微丝和中间纤维.它们对细胞形态的维持，细胞的生长、运动、分裂、分化，物质运输，能量转换，信息传递，基因表达等起到重要作用.用适当浓度的Triton X-100处理细胞时，可将细胞质膜和细胞质中的蛋白质和全部脂质溶解抽提，但细胞骨架系统的蛋白质不受破坏而被保存，经戊二醛固定，考马斯亮蓝R250染色或间接免疫荧光标记以后，可在显微镜下观察到细胞骨架结构.三、实验仪器与材料1.材料:洋葱鳞茎和口腔上皮细胞2.溶液或试剂：(1)M-缓冲液(2)6mmol/L(pH 6.8)磷酸缓冲液(3)l%Triton X-100(用M-缓冲液配制)(4)0.2%考马斯亮蓝R250(5)3%戊二醛3.仪器或其他用具:光学显微镜、50ml烧杯、玻璃滴管、容量瓶、试剂瓶、载玻片、盖玻片、镶子、小剪刀、吸水纸、擦镜纸等.四、实验步骤1.撕取洋葱鳞叶内表皮若干片,大小约lcm2,置于青霉素小瓶或小烧杯中.2.用磷酸缓冲液(PBS)浸泡片刻.3.吸去磷酸缓冲液，用1% TritonX-100处理20分钟抽提细胞骨架以外的蛋白质,从而使骨架图像更加清晰.4.吸去TritonX-100,用M-缓冲液洗3次，每次3分钟.M-缓冲液有稳定细胞骨架的作用.5.用3%戊二醛固定15-20分钟6.用PBS洗3次，每次3分钟7.考马斯亮蓝染色15分钟8.蒸馅水洗2次9.置于载玻片上，盖上盖玻片，在光学显微镜下观察.五、实验报告绘出植物细胞骨架微丝结构图.六、思考题说出各步骤的目的和一些重要试剂的在此处的作用.实验五细胞凋亡的诱导、观察与检测实验项目类型:创新设计性实验所属课程名称：《细胞生物学》实验计划学时：9学时一、实验目的1.了解细胞凋亡的概念和原理;2.掌握细胞凋亡诱导的方法;3.认识细胞凋亡的特征.二、实验原理人体内的细胞注定是要死亡的，目前人们已经知道细胞的死亡起码有两种方式，即细胞坏死与细胞凋亡.坏死是细胞受到强烈理化或生物因素作用引起细胞无序变化的死亡过程.表现为细胞胀大，胞膜破裂，细胞内容物外溢，核变化较慢,DNA降解不充分，引起局部严重的炎症反应.凋亡是细胞受到内、外因子刺激后发生的由基因调控的生理性死亡行为.其细胞及组织的变化与坏死明显不同.细胞凋亡的形态学变化: 首先细胞体积缩小，连接消失，与周围的细胞脱离，然后胞质密度增加, 核质浓缩，核膜核仁破碎,DNA降解,胞膜形成小泡，最终为为几个凋亡小体，无内容物外溢,因此不引起周围的炎症反应，凋亡小体可迅速被周围专职或非专职吞噬细胞吞噬.凋亡细胞DNA的有控降解是一种内源性核酸内切酶作用的结果,该酶在核小体连接部位切断染色体DNA,这种降解表现在琼脂糖凝胶电泳中就呈现特异的梯状Ladder图谱,而坏死呈弥漫的连续图谱.三、实验仪器与材料1.鸡血细胞2.溶液或试剂：生理盐水,20mmol/LCaC12顺伯，姬姆萨染色剂，Tris.HCl,SDS, EDTA,乙醇，甲醇，蛋白酶K.3.仪器或其他用具:超净工作台、灭菌锅、显微镜、恒温培养箱、镶子、解剖刀、剪子、接种针、铝饭盒、锡箔纸、记号笔、橡皮筋、试剂瓶、三角瓶移液管、培养皿、酒精灯等.四、实验步骤（一）细胞凋亡的诱导：1.采鸡血10ml,加0.85%的生理盐水混匀,1200r/min离心5min,弃上清液（重复三次），制备红细胞悬液，然后加入50ml血细胞保存液混匀放于4°C冰箱中备用.2.取4个试管，各加入鸡血细胞保存液2ml,在1号管中加入2ml生理盐水作为阴性对照,2号试管加入2ml 10ug/ml的顺伯溶液作为阳性对照;3号试管中加入2ml 20mmol/L的CaC12溶液进行胁迫处理;4号试管不加任何物质，实验时煮沸5 min使细胞坏死.（二）细胞凋亡的形态学观察：1.处理4h取样，用生理盐水稀释5倍，各取50ul细胞悬液均匀涂布于5 片载玻片上,晾干.2.用甲醇固定2min,然后在载玻片上滴加适量姬姆萨染液染色lOmin.3.用蒸馅水轻轻洗去染液，室温晾干，在光学显微镜下观察细胞形态变化.4.照相，并对试验组细胞进行凋亡计数统计.（三）DNA梯状条带的检测：1.离心收集鸡血细胞，弃上清.2.加入1ml的细胞裂解缓冲液重悬，转入1.5ml离心管中，加入蛋白酶K （500ug/ml）20 n 1,混匀.3.在65°C恒温水浴锅中水浴30min（也可转入37°C水浴12〜24h）,间歇振荡离心管数次.4.于台式离心机以12000 rpm离心5min,取上清液入另一离心管中.5.加2倍体积异丙醇，倒转混匀后，可以看见丝状物，用100ul吸头挑出, 或12,000转/分离心5分钟，弃上清,晾干.6.用50ulTE 缓冲液(pH8.0)溶解沉淀,并加入RNase A(10ug/ul)5ul,于37 °C 保温10〜15分钟.7.1.2 %琼脂糖凝胶,75 V电压，电泳45 min左右，8.紫外灯下观察并照相.(琼脂糖凝胶电泳:称取 1.2克琼脂糖加入100ml1*TBE),加热使之溶解，取一个凝胶模子，两端用胶布封好，水平放置.将制孔器(即梳子)放在模子一侧约0.5cm处，其底部距模子约1mm.待琼脂冷至约70°C时，加入10ul 0.5mg/ml EB,混匀，倒入模子，待冷却凝固后，取下梳子，撕去两端胶布,放入电泳槽中，使有加样孔的一端放在负极一端.在电泳槽中加入1*TBE至超过凝胶表面约1mm.加入DNA 电泳样:1.5ul DNA 。

植物细胞原生质体的制备与融合。

1、相关概念：（1）原生质体：是指那些已去除全部细胞壁的细胞。

细胞外仅由细胞膜包裹，呈圆形，要在高渗液中才能维持细胞的相对稳定。

此外，在酶解过程中残存少量细胞壁的原生质体称为原生质球或球状体。

（2）原生质体融合：即体细胞杂交。

用人工的方法，把分离的不同品种或不同种的原生质体诱导成融合细胞，再经离体培养诱导分化和再生完整植株的整个过程。

若取材为体细胞，则成为体细胞杂交。

2、原生质体的制备：在植物组织里，原生质体被坚硬的细胞壁包裹着，而且由于果胶质等使细胞相互紧紧粘连在一起。

在愈伤组织中，这种粘连相对松些；在细胞悬浮培养物中，只有存在细胞团的情况下，有轻度的粘连。

如果破除这种粘连作用，即可使细胞分离开来，进一步去除细胞壁，就能使裸露的原生质体游离出来。

游离效率的高低主要与植物材料和酶混合浓的组成有关。

基本程序如下：取材→除菌→酶解（加酶、渗透压稳定剂）→原生质体的收集与纯化→洗涤→原生质体活力的测定。

（1）取材与除菌：原则上植物任何部位的外植体都可成为制备原生质体的材料。

但人们往往对活跃生长的器官和组织更感兴趣。

因为，由此制得的原生质体一般都生活力较强，再生与分生比例较高。

常用的外植体包括：种子根、子叶、下胚轴、胚细胞、花粉母细胞、悬浮培养细胞和嫩叶。

对外植体的除菌要因材而异，悬浮培养细胞一般无需除菌。

对较脏的外植体往往要先用肥皂水清洗再以清水洗2-3次，然后浸入70%酒精消毒后，再放进3%次氯酸钠处理。

最后用无菌水漂洗数次，并用无菌滤纸吸干。

（2）酶解：现以叶片为例说明如何制备植物原生质体。

①配制酶解反应液:反应液应是一种pH值在5.5-5.8的缓冲液，内含纤维素酶0.3%-3.0%以及渗透压稳定剂，细胞膜保护剂和表面活性剂等。

③酶解：除菌绿。

反应液转绿是酶解成功的一项重要指标，说明已有不少原生质体游离在反应液中。

经镜检确认后应及时终止反应，避免脆弱的原生质体受到更多的损害。

综合性（设计性）实验实验报告实验名称：原生质体的分离培养与融合姓名：马淑媛指导教师：卜婷专业：生物科学实验班级： 10级生物科学2班实验时间： 2012年11月16日实验地点：细胞学实验室成绩：__________________________植物原生质体的分离与融合及培养一实验目的1、掌握原生质体分离的方法；2、了解并掌握利用PEG原生质体融合的原理和方法。

3、掌握原生质培养技术二试验原理植物原生质体是除去细胞壁后为原生质所包围的“裸露细胞”，是开展基础研究的理想材料。

其中酶解法分离原生质体是一个常用的技术，其原理是植物细胞壁主要由纤维素、半纤维素和果胶质组成，因而使用纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶能降解细胞壁成分，除去细胞壁，即可得到原生质体。

由于原生质体内部与外界环境之间仅隔一层薄薄的细胞膜,必须保持在渗透压平衡的溶液中才能保持其完整性。

其次,还应当考虑取材、酶的种类和纯度、酶液的渗透压、酶解时间及温度等因素对分离原生质体的影响。

测定原生质体的活性有多种方法。

荧光素双醋酸酯(FDA)染色是常用的一种方法,FAD本身无荧光,无极性,可透过完整的原生质膜。

一旦进入原生质体后,由于受到酯酶分解而产生具有荧光的极性物质荧光素。

它不能自由出入原生质膜,因此有活力的细胞能产生荧光,无活力的原生质体不能分解FAD无荧光产生。

许多化学、物理学和生物学方法可诱导原生质体融合，现在被广泛采用并证明行之有效的融合方法是聚乙二醇（PEG）法、高钙高pH法和电融合法；聚乙二醇（PEG）作为一种高分子化合物，20～50％的浓度能对原生质体产生瞬间冲击效应，原生质体很快发生收缩与粘连，随后用高钙高pH法进行清洗，使原生质体融合得以完成。

聚乙二醇（PEG）诱导如何的机理：聚乙二醇（PEG）由于含有醚键而具有负极性，与水、蛋白质和碳水化合物等一些正极化基团能形成氢键，当聚乙二醇（PEG）分子足够长时，可作为临近原生质表面之间的分子桥而使之粘连、聚乙二醇（PEG）也能连接钙等阳离子，钙可在一些负极化基团和聚乙二醇（PEG）之间形成桥，因而促进粘连。

植物原生质体培养的技术流程一、原生质体的分离解离液的准备：解离液的组成和浓度直接影响原生质体的分离效率。

常用的解离液包含酶类，如纤维素酶和果胶酶，它们能够分解植物细胞壁。

根据不同植物材料的特性，调整酶液的浓度和pH值，确保其能有效地分解细胞壁而不损伤细胞质。

原生质体的分离与纯化：解离后，将混合液通过筛网过滤，以去除未解离的细胞碎片。

然后，将过滤后的液体转移到离心管中，以低速离心收集原生质体。

使用适当的密度梯度离心技术进一步纯化原生质体，去除细胞碎片和其他杂质。

二、原生质体的培养培养基的选择与准备：原生质体的培养需要合适的培养基，通常选择含有碳源、矿质元素、维生素和生长调节剂的培养基。

培养基的配方会根据不同植物物种和实验目的进行调整。

培养基在使用前需要经过高压灭菌，以确保无菌条件。

原生质体的接种：将纯化后的原生质体悬液接种到固体或液体培养基上。

对于固体培养基，可以将原生质体悬液均匀地涂布在培养基表面。

对于液体培养基，则将原生质体悬液直接倒入培养瓶中。

接种后，培养基应保持无菌环境，并在适宜的温度和光照条件下进行培养。

培养环境的控制：原生质体的培养环境包括温度、湿度、光照等。

一般情况下，原生质体的培养温度为2528℃，光照条件则根据植物种类和培养目的进行调整。

保持适宜的环境条件，有助于原生质体的生长和分化。

三、原生质体的再生诱导再生：在适宜的培养条件下，原生质体开始分化成愈伤组织或小芽。

根据不同植物的需求，可能需要在培养基中添加特定的生长调节剂，如细胞分裂素、赤霉素等，以促进愈伤组织或芽的形成。

转化与选择：对于转基因实验，可能需要使用农杆菌介导的转化方法将外源基因导入原生质体中。

转化后的原生质体应在选择培养基上培养，以筛选出成功转化的细胞。

选择培养基通常含有抗生素，以筛选含有抗性基因的细胞。

分化与生根：成功转化的细胞在培养基中继续生长，并开始分化为完整的植物组织。

此阶段通常需要切换到生根培养基，以促使愈伤组织或芽生根。

S11实验十一植物原生质体的分离及融合（理论）实验十一植物原生质体的分离及融合（理论）原生质体培养的主要目的是实现远缘物种的体细胞杂交，外源染色体、DNA或细胞器的导入，创造新的远缘杂种。

全部技术环节包括原生质体分离、原生质体培养、体细胞杂交、杂种细胞产生愈伤组织及再生植株等。

一、原生质体的概念1、原生质体是指用特殊方法脱去植物细胞壁的、裸露的、有生活力的原生质团。

没有细胞壁，但具有活细胞的一切特征。

2、原生质体培养指将植物细胞游离成原生质体，在适宜的培养条件下，依据细胞的全能性使其再生细胞壁，进行细胞的分裂分化，并发育成完整植株的过程。

二、原生质体的分离方法1、机械分离法采用渗透方法使细胞发生质壁分离，然后切开细胞壁释放出原生质体。

特点是原生质体产量很低；方法繁琐费力；局限性大。

2、酶法分离采用果胶酶、纤维素酶等酶类对植物细胞壁进行酶解，得到原生质体。

三、原生质体纯化与活力测定1、原生质体的纯化a、离心沉淀法应用原生质体的比重大于溶液的性质，将原生质体沉于底部，收集原生质体备用。

b、漂浮法应用渗透剂含量较高的洗涤液使原生质体漂浮于液体表面。

依次通过网筛过滤、离心、收集沉淀，再用蔗糖液洗涤离心2—3次，漂浮收集即可。

c、界面法选用两种不同渗透浓度的溶液，一种溶液密度大于原生质体的密度，另一种小于原生质体的密度，进行界面收集原生质体。

2、活力测定a、形态识别形态上完整，含有饱满的细胞质，颜色新鲜的即为存活的原生质体。

b、染色识别用0.1%酚番红或伊凡蓝进行染色，后进行观察，有活力而质膜完整的原生质体对染料有排斥作用而不被染色，死亡的却被染上颜色。

四、原生质体的培养方法培养方法有四种，即固体薄层培养法、液体浅层培养法、双层培养法和琼脂糖珠培养法。

1、固体薄层培养法又叫平板培养法，指将一定体积的原生质体按照一定细胞密度与等体积的处于45℃的琼脂培养基混合，在培养皿内制成薄层固体平板的方法。

使原生质体位置固定，避免其游动，便于定点观察。

植物原生质体培养的关键技术植物原生质体培养是一种重要的植物组织培养技术，它可以用于植物的无性繁殖、基因工程以及育种等研究领域。

下面介绍一些关键的技术步骤和要点。

原生质体的分离和培养1. 原生质体分离：首先从植物中取得组织样本，如叶片、茎段或花器官等，并在无菌条件下进行处理。

通过切细组织样本，加入酶解液，进行酶解反应，最终获得原生质体。

2. 培养基准备：制备培养基，包括基础培养基和添加物质。

基础培养基提供必要的营养物质和能量，而添加物质则供给原生质体特殊的生长因子和激素。

培养基应在无菌条件下配制，用于培养原生质体。

3. 原生质体培养：将分离得到的原生质体放置在培养基上，以适当的温度和光照条件下培养。

培养过程中要定期观察和检查原生质体的生长状态，以及调整培养基的成分和浓度。

原生质体培养的关键因素1. 无菌技术：无菌条件下进行原生质体培养是确保培养过程成功的关键。

在分离、培养和观察过程中，都要保持严格的无菌操作，避免细菌或真菌的污染。

2. 营养物质和激素：培养基中必须提供适当的营养物质和激素，以满足原生质体的生长需求。

营养物质包括碳源、氮源、矿质盐等，而激素会促进细胞分裂和分化。

3. 光照和温度：适当的光照和温度条件对原生质体的生长和发育至关重要。

光照可以提供足够的能量，而温度则影响酶活性和代谢速率。

原生质体培养的应用1. 无性繁殖：通过原生质体培养，可以实现无性繁殖，快速繁殖大量相同的植株。

这对于育种和植物繁殖的研究非常有用。

2. 基因工程：原生质体培养可用于植物的基因工程研究，如基因表达、基因转导和功能验证等。

这为研究植物基因功能和遗传改良提供了有力手段。

3. 药物及次生代谢产物生产：某些植物的次生代谢产物对药物研发具有重要意义。

通过原生质体培养，可以大规模生产这些药物及代谢产物。

结论植物原生质体培养是一项技术复杂但应用广泛的植物组织培养技术。

通过合理控制培养条件和关注关键步骤，可以成功地进行原生质体培养，并应用于植物研究、育种和基因工程等领域。

原生质体的分离、融合与培养一、实验目的1.了解植物原生质体分离、融合和培养的基本原理。

2.掌握植物原生质体分离、融合和培养的基本过程。

3.了解并掌握利用PEG原生质体融合的原理和方法。

二、实验原理植物原生质体是除去细胞壁后为原生质所包围的“裸露细胞”，是开展基础研究的理想材料。

其中酶解法分离原生质体是一个常用的技术，其原理是植物细胞壁主要由纤维素、半纤维素和果胶质组成，因而使用纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶能降解细胞壁成分，除去细胞壁。

许多化学、物理学和生物学方法可诱导原主质体融合，现在被广泛采用并证明行之有效的融合方法是聚乙二醇(PEG)法、高Ca高pH法和电融合法。

PEG诱导融合的机理：PEG由于含有醚键而具负极性，与水、蛋白质和碳水化合物等一些正极化基团能形成氢键，当PEG分子足够长时，可阼为邻近原生质表面之间的分子桥而使之粘连。

PEG也能连接Ca2+等阳离子，Ca2+可在一些负极化基团和PEG之间形成桥，因而促进粘连。

在洗涤过程中，连接在原生质体膜上的PEG分子可被洗脱．这样将引起电荷的紊乱和再分布．从而引起原生质体融合：高Ca高pH由于增加了质膜的流动性，因而也大大提高了融合频率，洗涤时的渗透压冲击对融合也可能起作用。

三、实验材料、试剂与仪器1．材料新鲜的菠菜叶片2．试剂（1）酶液：依次加入 1.25%纤维素酶、0.3%果胶酶、0.04%甘露醇、20mmol/LKCl和20mmol/L2-吗啉乙磺酸（MES），55℃水浴10min，冷却至室温，再加10mmol/LCaCL2、5mmol/Lβ-巯基乙醇和0.1%BSA，0.45um微孔滤膜过滤，溶液呈透明橙色。

（2）PEG溶液：4GpPEG4000\3mL去离子水、2.5mL0.8mol/L甘露醇和1mL1mol/L CaCL2。

（3）MMg溶液：0.4mol/L甘露醇、15mmol/LMgCl2、mmol/LCaCl2和4mmol/LMES。

植物原生质体的分离与融合第一部分：综合性实验（供同学们学习参考）甘蓝与紫甘蓝原生质体的分离与融合植物原生质体由于已去除了细胞壁，它能够像动物细胞一样，在人为的条件下互相融合，获得细胞杂种植株。

如果用近缘种内或种间的原生质体融合、可以获得稳定的、具有双亲两套染色体的细胞杂种植株，它们往往可育，可以直接作为育种的种质材料；如果用远缘不亲和物种间的原生质体融合，可以获得常规有性杂交得不到的无性杂种植株，不仅克服了远缘杂交不亲和性，而且可以扩大植物的变异范围，拓宽种质来源，选育出新种质，甚至产生新种。

要分离植物原生质体，必须去掉由果胶质、纤维素和半纤维素及木质素等构成的细胞壁。

目前普遍采用酶分离法来获得原生质体。

1.酶：分离原生质体最常用的酶有纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶。

2.渗透稳定剂：植物细胞壁对细胞有良好的保护作用。

去除细胞壁之后如果溶液中的渗透压和细胞内的渗透压不同，原生质体有可能涨破或收缩。

因此在酶液、洗液和培养液中渗透压应大致和原生质体内的相同。

3.植物材料：一般来说，植物各个器官，如：根、茎、叶、花、果实、种子及愈伤细胞和悬浮细胞等都可作为分离原生质体的材料。

但是，要获得高质量的原生质体，则须选用生长旺盛、生命力强的组织作材料。

材料的生理状况是原生质体质量的决定性因素之一。

4.酶溶液的pH值：对原生质体的产量和生活力影响很大。

一般为5-7。

酶的活性还与pH值有关。

Onoznka纤维素酶R－10最适宜pH值为5～6。

不过实际上酶溶液的pH值经常调节4．7～6．0之间。

对于不同的材料、不同型号的酶其所要求的最适值是不同的，应通过实验确定。

5.温度：对酶解效率有影响和植物原生质体得活力都有影响。

酶：40-50摄氏度，适于植物材料的温度一般都在25℃，所以一般在25℃左右进行酶解。

试剂的配制：1、pH5.7的磷酸钾缓冲液10 mL：A液：称取0.272g KH2PO（0.2mol/L4，溶于蒸馏水中，定容至10 mL。