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原生质体培养与细胞融合第一节原生质体培养一、原生质体的培养概况1、概念：植物的原生质体：指除去细胞壁以后的裸露细胞。
原生质体培养：是将植物细胞游离成原生质体，在适宜的培养条件下，使其再生细胞壁，进而细胞进行持续分裂形成细胞团，进一步生长形成愈伤组织或胚状体，最后分化或发育形成完整植株的过程。
原生质体培养特点是：①比较容易摄取外来的遗传物质，如DNA；②便于进行细胞融合，形成杂交细胞；③与完整细胞一样具有全能性，仍可产生细胞壁，经诱导分化成完整植株。
原生质培养首先在烟草上获得成功。
2、原生质体培养的意义①比较容易摄取外来的遗传物质（壁中有活性很强的核酸酶）—研究植物原生质体培养和再生植株技术，有可能采用细胞遗传工程的方法培育出新品种。
②便于进行细胞融合，形成杂交细胞—可广泛地重组植物界优良遗传性状，创造新物种和新品种（如能固N的禾本科植物，高光效植物，高抗植物）③原生质体可作为遗传理论研究的材料—细胞生物学、植物生理学、遗传学、分子生物学等，如细胞起源、壁生物合成、胞间相互作用、不亲和性、激素作用机理等3、原生质体培养程序取材→预处理→分离→纯化→活力检测→培养→细胞壁再生→细胞分裂分化→愈伤组织→愈伤分化→再生植株取材：大田叶片（消毒灭菌）、无菌试管苗叶片、愈伤组织或悬浮细胞预处理：黑暗、低温、叶片萎蔫处理、预培养、和不同光质照射等，可提高原生质体产量和代谢活力。
二、原生质体的分离和纯化1 原生质体的分离叶肉组织是制备原生质理想的材料，遗传性状一致。
细胞壁主要成分是纤维素、半纤维素、果胶质等。
分离原生质的方法主要有以下两种：机械法和酶解法（1）机械法①首先将细胞放在高渗的糖溶液中（水势低），使细胞发生质壁分离（细胞失水），原生质体收缩成球状；②破碎组织，从伤口处可释放出完整的原生质体。
最早在19世纪末，利用机械法分离藻类原生质。
（缺点）获得的原生质体少、产生的原生质体的细胞类型受到限制。
一般取材局限于具有液泡化程度较大的细胞或长形细胞的组织。
第六章原生质体培养和体细胞杂交第六章原生质体培养和体细胞杂交第一节原生质体分离与培养一、原生质体培养的意义与研究概况原生质体（protoplast，PPT）: 用机械或酶解法去掉细胞壁的裸露细胞。
1. 原生质体培养的意义与研究概况1.1 培养意义1）体细胞杂交；作物遗传改良，这是一种新的远缘杂交方法，为人们提供新的育种方法。
两个亲缘关系较远的植株用一般杂交方法是不容易成功的，而用细胞融合的方法却成为可能。
2）遗传转化的受体，避免嵌合体；3）突变体筛选：体细胞无性系变异+ 离体诱变；4）基础研究：细胞壁再生、膜结构、跨膜运输、病毒侵染、抗寒性、抗热性等；5）种质资源超低温保存，并可研究低温伤害与胞内结冰等；6）细胞器和大分子分离。
1.2 研究概况1880，Hanstein, 提出原生质体；1892，Klercker, 机械法分离少量原生质体；1960，Cocking，纤维素酶分离番茄幼根，得大量活性原生质体，奠基；1968，纤维素酶和离析酶上市，迅速发展；1971，Takebe，酶解分离烟草叶肉原生质体，再生植株；1985，Fujimura等，世界第一例禾谷类作物，水稻原生质体再生植株；1986，通过甘蓝型油菜单个原生质体培养获得再生植株。
单个原生质体培养成功；至1999，46科、161属、368种高等植物，原生质体再生植株，但若干重要作物仅限于少数基因型，再生率不高，培养基和培养程序复杂，规律少。
二、原生质体的分离与纯化2.1 原生质体分离2.1.1 原则：大量、避免损伤，高活力，能进行分裂并形成愈伤组织或胚状体是原生质体培养成功的基础。
取材：叶片，愈伤组织，悬浮细胞2.1.2分离方法：1）机械法: 用解剖刀切碎质壁分离的组织，再通过质壁分离[pl?z’m?lisis]的复原释放出原生质体。
优点：物理损伤，排除了外加酶的有害影响。
缺点：产量低，操作不便，只限于能发生质壁分离的组织（适于高度液泡化细胞，不适于分生组织）；费时费力。
