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基因组文库构建文稿演示

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基因工程DNA文库的构建讲课文档

基因工程DNA文库的构建讲课文档
常见筛选工具：探针（probe）
狭义：核酸，抗体
广义：还包括其他筛选手段。
现在三十四页，总共五十页。
一、表型筛选法
生物体的表型特征由控制其性状的基因编码。因此，可以通过观 察表型的变化来筛选目的基因。表型筛选法就是根据目的基因编码比 较特殊的功能，并且载体的帮助下可以在宿主菌（如大肠杆菌）中表 达该基因，表现出其特殊的功能所决定的表型性状来，这样就很容易 通过导入的基因带来新的功能或恢复其缺失的功能来确定目的基因。
随机引物引导的 cDNA 合成是采用 6－10 个随机碱基的寡核苷酸短片段 来锚定 mRNA 并作为反转录的起点。由于随机引物可能在一条 mRNA 链 上有多个结合位点而从多个位点同时发生反转录，比较容易合成特长的 mRNA 分子的 5'-端序列。随机引物 c39; 末端，如 RT-PCR 和 5'择一盖倍数又等 于所有探针筛到的阳性克隆的总个数/使用的总探针数的比值
现在十一页，总共五十页。第二节 cDNA的构建现在十六页，总共五十页。
Oligo（dT）引导的 cDNA 合成是在 cDNA 的合成过程中加入高浓 度的 Oligo（dT）引物， Oligo（dT）引物与 mRNA 的 3‘ 末端的 poly（A）配对，引导反转录酶以 mRNA 为模板合成第一链 cDNA 。 cDNA 末端存在较长的 poly（A）而影响 cDNA 测序。
现在十五页，总共五十页。
二、cDNA 第一链的合成
常用的反转录酶： • AMV （来自禽成髓细胞瘤病毒） • MMLV （来自 Moloey 鼠白血病病毒）
依赖于 RNA 的 DNA 聚合酶，有 5'--3' DNA 聚合酶活性。
合成 DNA 常用的引物： Oligo（dT）和随机引物。 OБайду номын сангаасigo（dT）引物一般 包含 10～20 个脱氧胸腺嘧啶核苷和一段带有稀有酶切位点的引物共同组 成，随机引物一般是包含 6～10 个碱基十页。

基因组文库的构建.ppt

基因组文库的构建.ppt
重 组cDNA的总和，通常是在细菌或酵母中。 这些克隆代表从某个特定物种或器官的所 有mRNA制备得到的cDNA。
cDNA分子克隆(cDNA clone) ：将 cDNA片段装在载体上转化细菌,组中分离单拷贝的基因；N
AAAAAAA mRNA
(b)寡聚(dT)引物
第一条 cDNA 的合成
An
An
Tn
(c)发夹引物
第二条 cDNA 的合成
TTTTTTຫໍສະໝຸດ GGGGGGCCCCCC
加接头 1
TTTTTT
GGGGGG
AAAAAA
CCCCCC
(d)同聚物加尾反应 TTTTTT
TTTTTT AAAAAA
连接 DNA 片段和载体
重组载体 DNA 导入 E.coli (体外包装或转化)
基因库的鉴定与段的产生与分离
一.基因组DNA的片段化
1.用限制酶片段化:
用限制酶消化DNA，不经凝胶电泳分部离,直接和载体 连接的克隆方法叫鸟枪法(shot-gan approach)
(2)有的基因表达具有严格的时空性，要获得 其mRNA并非易事。用不同发育阶段，或差A。不能用于基因结构和调节的研 究。一个基因经不同的剪接可产生不同的部 分重叠的cDNA克隆。
高速搅拌：1500转/分×30分 长度8kb的分子群体。
可切 平均
3.双酶消化
单酶消化的产物一般分子较大，选择时要考 虑到载体容量，如噬菌体插入片段不超过 25kb,为此可选用识别4bp的限制酶(切割平 均长度为256bp) ,识别6bp的限制酶切割平 均长度4096 bp.
双酶切产生的DNA片段平均大小不超过1kb, 但如采用双酶部分消化，产物的分子量 可达10～30kb,它们存在着随机序重叠， 用蔗糖梯度离心或凝胶电泳可将这些片 段群体按大小分开，可得到的分子量大 小约为20kb的随机DNA片段群体。

基因组学的合成和加工文稿演示

基因组学的合成和加工文稿演示
特征：1）形成发夹不如内源 性终止子牢固，但可以使RNA 聚合酶暂停；
2）ρ因子有解旋酶活性，当 RNA聚合酶暂停时，它跟上并 打开RNA-DNA碱基配对，释放 出转录物，终止转录。
延伸和终止的选择调控
• 抗终止作用忽略终止信号 • 衰减作用导致提前终止 • 转录物降解蛋白能够防止后退的聚合酶被卡住
• 加一个G到5’ 端—鸟苷酸转 移酶
• G甲基化---鸟 嘌呤甲基转移 酶
• 帽子结构在不 同生物中甲基 化程度不同。
加帽反应
真核细胞mRNA的延伸
• 真核转录物更长，需要延伸因子来帮助聚合酶以 保持转录复合物稳定
合成终止与加尾反应
• Poly(A)聚合酶是加尾 酶
• 3’端内部切断，再加 尾
特征：1）反向回文序列转 录后形成发夹结构，在发夹 的基部有GC富含区；
2）回文序列后有一段A， 转录出最末端连续多个U，形 成的A-U碱基配对仅有两个氢 键，从而终止比延伸更有利 。
活性位点 翼状结构Fra bibliotek转录的终止(2)--ρ-依赖性终止子
ρ-依赖性终止子(Rho dependent terminator)，需要ρ因子辅助。
枯草芽孢杆菌：只存在 衰减机制，而且衰减与 否不由核糖体在mRNA 上移动速度决定，而由 一种RNA结合蛋白 TRAP(trp RNA-binding attenuation protein)介导
转录物降解蛋白防止后退的 RNA聚合酶被卡住
细菌RNA的加工
E. coli 前体rRNA的加工
E. coli 前体tRNA的加工
细菌RNA的降解
• 特异性mRNA降解是调节基因 组表达的一种强力方式。
• 细菌mRNA通常很快被降解， 其半衰期一般不超过几分钟。

第二章基因组的结构与功能演示文稿

第二章基因组的结构与功能演示文稿
inside the nucleus of the cell in the familiar form of chromosomes; and a mitochondrial genome -outside the nucleus in the cytoplasm of the cell, usually in the form of one round chromosome (the mitochondrial chromosome).
④与进化有关 不同种属的高度重复序列的核苷酸序列不同，具有
种属特异性，但相近种属又有相似性。
⑤与个体特征有关
同一种属中不同个体的高度重复序列的重复次数不 一样，这可以作为每个个体的特征，即DNA指纹。 ⑥与染色体减数分裂时染色体配对有关。
第20页，共53页。
高度重复序列类型 （1）反向（倒位）重复序列
第二章基因组的结构与功能演 示文稿
第1页，共53页。
优选第二章基因组的结构与功 能
第2页，共53页。
Genome：
a set of integrated monoploid genetic material sum total in cellule or organism.
Structure of genome：
人基因组中，大约占60%-65％。
第26页，共53页。
三、多基因家族与假基因
multigene family：
from ancestral gene to group genes by repetition and mutation long time.
histone family: clustering in same chromosome.
第12页，共53页。

基因组DNA 文库的构建PPT课件

基因组DNA 文库的构建PPT课件
注1：高纯度大分子量基因组DNA (High molecular weight DNA采用包装蛋白进 行包装并侵染宿主。/共17页
λ噬菌体载体；
• 分离有用的目的基因：
• 分离特点的基因片段； • 分析特点基因结构；
• 研究基因表达调控。 • 保存生物的全部基因：
• 全基因组物理图谱的构建； • 全基因组序列测定。
第5页/共17页基因组DNA的特点• 代表性• 中所有克隆所携带的 DNA 片段重新体DNA片段
第12页/共17页
② 载 体 的 制 备
④③
HMW DNA
真核基因组DNA （约3×109bp）
脉
Sau3 A做局部消化
冲 电
被限制酶切开的DNA片段
泳
分的
琼脂糖凝胶电泳
级提
S
S 纯化约20kb片段
分取
离
第13页/共17页
cos L B S
S B R cos T4连接酶
约20kbDN片段 体外包装
①
工
限制性内切酶Sau3A、BamHⅠ；
具
准
琼脂糖凝胶（或蔗糖）；
备
T4连接酶；
注1：Sau3A与BamHⅠ，是一对同尾酶。 注2：同尾酶是指切割不同的DNA片段但产生相同的粘性末端的一类限制性内切酶。
第11页/共17页
BamH Ⅰ位点
cos L
R cos
载体DNA
弃去中间片段
cos L B B R 插入片段的大小和基因组
DNA 大小的比值。
的载体。 • 广泛用于细菌、真菌等基因组##
第1页/共17页基因组DNA与cDNA• cDNA：
• 以mRNA为模板，经反转录酶催化，在体外反 转录成cDNA，与适当的载体连接后转化受体菌， 每个细菌含有一段cD阶看！

基因组文库MicrosoftPowerPoint演示文稿

基因组文库MicrosoftPowerPoint演示文稿
体 （YAC） • 克 可以用来克隆完整的动物基因。在人类基 因组计划中，YAC被广泛的用 • ⅰ载体DNA的酶切 一般用Sau3AⅠ或MboⅠ限制性核酸内切 酶 • ⅱ载体DNA的纯化 氛-氯仿抽提和酒精沉淀法 蔗糖密度梯膜培养法段的制备 • （1）基因组DNA的提取 • 经典方法是在EDTA和SDS存在下，用蛋白 酶K消化细胞，然后用酚-氯仿混合液抽提 蛋白质，并用透制备 • 关键是将基因组DNA降解成大小适中的随 即片段。 • 方法：机械剪液器抽吸法和超声 波裂解法 • 随机性最高 • 但产生的DNA片段以平头末端为主，其连 接能产生与载体相匹配的黏粒末端的DNA片 段 • 不仅可直接与处理过的载体连接，而且连 接的效率较高。 • 酶切往往具有非随机倾向 • 在限制性核酸内切酶部分消化后，有必要 对产生的基因组DNA片段进行分离，以便 从中含有P)/ln(1-f) • 式中 N——重组子（空斑或菌落）的数量； • P——所要求的概率; • F——某一插入片段与相析研究基因的完整结构 包括基因编码区和各种调控提取高分子量的真核细胞染色体DNA。 3.用琼脂糖凝胶电泳，脉冲场凝胶电泳或 蔗糖密度梯度离心法，分离所需大小片段。 • 4.载体DNA与外源DNA片段的连接反应。 • 5.对于λ和cosmid载体，重组DNA需要进行 体外包装反应，形成噬菌段，仅需筛选几千个重组 子。而对于较大的基因组来说，插入片段 越大，所需筛选的重组子就越少，这就是 人们为什么研究大容量黏粒和Y：由mRNA逆转录的DNA，因组DNA，是一 种生物体全部染色体DNA被随机切割成适 应为模板，经反转录 酶催化，在体外反转录成cDNA，与适当 的载体（常用噬菌体或质粒载体）连接后 转化受体菌，则每个细菌含有一段cDNA， 并能繁殖扩增，这样包含着细胞全部 mRN的载体 两端各有一个黏性末端可以被无关的外源 DNA序列取代。 • 替代型λ噬菌体载体的插入片段的适宜粒）载体 • 真核生物的许多基因含有内含子序列，使 得整个基因长达40kb以远远大于质粒载体 和噬菌体载体的装载量。 Cosmid载体能• 黏粒载体克隆片段的库来说，将包装反应置 于密封的试管内，加入少量氯仿，在四度 冰箱内可较长时间的保存(六个月内低度保 持稳定)，低温冰箱中可建 • 主要是插入片段与经过特定限制性核酸内 切酶处理的载体的连接，从而产生重组 DNA分子的过程。 • 连接效率主要受两种因素影响 ：插入片段 与λ噬菌体DNA两臂的摩尔数比 ；反应受体细胞 • 以噬菌体颗粒的形式将重组DNA分子导入 大肠杆菌细胞中，可大大提高建立基因文 库的效率 • 噬菌体颗粒的体外包装 ：将适当量的包装 抽提物与欲包装的重组DNANA用限制 性内切酶部分酶切后，将酶切片段插入到 载体DNA分子中，所有这些插入了基因组 DNA片段的载体分子的集合体，将包含这 个生物体的整时期析研究基因的完整结构 包括基因编码区和各种调(3*109bp)而言，欲获得 概率为0.99，大小为20kb的插入片段所要 筛选的重组子的数量分别是： • N（大肠杆菌）=ln(1-0.99)/ln[1(2*104/4.6*106)]=1.1*103 • N（人类）=ln(1-0.99)/ln[1(2*104/3*109)]=6.9*105

DNA文库的构建和目的基因ppt课件

含
▪ 从特定组织提取的染色制性 内切酶
……
克隆、转化、培养、鉴定基因 91)基因组 (Genomic library) ：
▪ 是指将某种生物体基因组转录的全部
mRNA经反转录产生的cDNA片段分别与克 隆载体重组，储存于某种受体ntary DNA，互补
DNA)：是由生物的某一特定器官或特定发 育时期细胞内的mRNA经体外反转录后形 成的互补DNA。
因，因此从特定组织中制备的mRNA通常会 富集某些特异序列。所以起始材料的选择 十分重要。
30
1、mRNA的制备: 动物细胞或植物细胞mRNA的制备
2、mRNA的来源: 选用mRNA含量高的组织材料，或通过药物等方
法提高mRNA的含量。 3、mRNA完整性的检测
1)mRNA分子的大小：哺乳动物mRNA长度为5008000bp，大部分mRNA位于1.51
▪ 外源基因：插入到载体内的那个特定
的片段基因。
▪ 目的基因：那些已被或者准备要分离、
改造、扩增或表达的特定基因或DNA片 段。
2
对于高等真核生物而言，基因组DNA 十分庞大,基因可达数万个，且基因组成 结构复杂，除编码序列，还有非编码序 列及调控序列，基因间还存在大量的间 隔序列和重复序列，因此，单个目的基 因在整个基因组中所占的比例极其微小， 除少数例外，绝大多数基因难以直接分 离得到。
15
（二）基因组DNA的不完全酶切 1、根据实验需要选择合适的限制性内切 酶 2、分离目的酶切片段大小的确定
a) 克隆单个基因：< 10 kb b) 克隆基因族：< 20kb 3、DNA不完全酶切条件的确定 a) 确定限制酶用量，改变酶切时间 b) 固定酶切时间，改变限制酶的用量
16

小片段基因组文库的构建PPT演示文稿


130-150 大肠杆菌 电转
120-300 大肠杆菌 电转
250-4
N = ln (1-P ) / ln (1-f )
P是希望得到的覆盖率，
f是插入片段大小与基因组DNA大小的比值，
N是所需的克隆数，去上清 7. 用75%乙醇洗沉淀1次后，在超净工作台中吹干，加10μl ddH2O溶解.
17
Plasmid 10×H buffer Eco R I Pst I RNase
H2O
10 μl 2 μl 1.0 μl 1.0 μl 0.5 μl 5.5μl
37 C酶切过夜，0.8 %琼脂糖电泳检测
把能携带外源DNA进入受体细胞的DNA分子
（1）在宿主细胞内能独立复制。 （2）有选择性标记。 （3）有一段多克隆位点。
外源DNA插入其中不影响载体的复制。
（4）分子量小，拷贝数多。 （5）容易从宿主细胞中分离纯化。
4
3. 载体的种类
常用的载体有5类：
质粒（plasmid） 单链DNA噬菌体M13 噬菌体的衍生物 柯斯质粒（cosmid） 动物病毒（virus）
子的分子比率。
4. 重组DNA分子的转移和基因组的扩增利用转化或感染方法将连接DNA分子导入宿主细胞，让其自主复
制，重组DNA分子被扩增（重组机挑取一些重组子，提取质粒DNA，电泳测定插入片段大小，然后根据上述公式计算大小。5基因组载体
➢P1噬菌体载体 ➢cosmid黏粒载体 ➢BAC载体（细菌人工染色体） ➢ PAC载体（P1人工染色体） ➢YAC载体（酵母人工染色体）
6
各种载体的比较
载体 黏粒 P1 PAC BAC YAC
容量（kb） 宿主 导入细胞 方式
30-45 大肠杆菌 转导
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一.λ噬菌体载体
§ 基础：裸露的噬菌体重组DNA转化宿主细胞或 包装后转染宿主细胞。
§ 载体筛选：在细菌菌苔中形成噬菌斑。 § 重组筛选：
插入载体—通过可见标记的插入失活(cI基 因的打断阻止溶源性，产生的噬菌体更清澈； 现代的载体携带lacZ基因，以兰-白筛选)。
TTTTTT AAAAAA
切除发夹
TTTTTT AAAAAA
通 过 以 下 途 径 将 cDNA 插 入 载 体 a. 平 端 克 隆 b. 加 接 头 c. 进 一 步 进 行 同 聚 物 加 尾 反 应
加接头 2
TTTTTT AAAAAA 经酶切进行定向克隆
cDNA 克 隆第二节 构建的载体建库的目的： 1.从复杂的基因组中分离单拷贝的基因；的关键： 如何产生足够数量的重组DNA 建库应注意： 1.保证载体DNA和靶DNA均不被外源DNA
序列污染； 2.尽可能用“ 电话克隆”。
组织
mRNA cDNA
甲基化，加接头 的 双 链 DNA
§ 将数据代入上式
N ln1(0.99) ln1(17kb/30M)b
= 8.1×105 N的含义是克隆大小为1799％是通过反转录mRNA，并制备双链
§ (2)有的基因表达具有严格的时空性，要获得 其mRNA并非易事。用不同发育阶段，或差异A。不能用于基因结构和调节的研 究。一个基因经不同的剪接可产生不同的部 分重叠的cDNA克隆。
DNA
部分或完全 消 化 的 DNA
载体
( 选择一种)
大小分级
可供克隆的 DNA 片 段
连 接 DNA 片 段 和 载 体
重 组 载 体 DNA 导 入 E.coli (体 外 包 装 或 转 化 )
基因库的鉴定与A 和 cDNA 文 库 的 流 程 示 意 图
三.目的基因克隆片段的富集。
) ln(1 I / G )
N:该序列 I：待克隆DNA片段的长度，假定为17kb; G: 基因组DNA的总长度，如人类为3×109bp
筛选(4)建库时已排除了其它的RNA，使假阳筛选。
但应注意：
§ (1) 细胞中不同mRNA的丰度不同，低丰度的 mRNA要求很高的克隆数(要用公式来计算)。
(a) 随 机 六 碱 基 NNNNNN
AAAAAAA mRNA
第 一 条 cDNA 的 合 成 An
(b)寡 聚 (dT)引 物
An Tn
(c)发 夹 引 物
第 二 条 cDNA 的 合 成
TTTTTT
GGGGGG
CCCCCC
加接头 1
TTTTTT
GGGGGG
AAAAAA
CCCCCC
(d)同 பைடு நூலகம் 物 加A library) ： 克隆的重 组cDNA的总和，通常是在细菌或酵母中。 这些克隆代表从某个特定物种或器官的所 有mRNA制备得到的cDNA。
cDNA分子克隆(cDNA clone) ：将 cDNA片段装在载体上转化细菌,不超过1kb, 但如采用双酶部分消化，产物的分子量 可达10～30kb,它们存在着随机序重叠， 用蔗糖梯度离心或凝胶电泳可将这些片 段群体按大小分开，可得到的分子量大 小约为20kb的随机DNA片段群体。
二. DNA片断大小的分部
如已知含目的基因克隆片段的大小范围， 可在克隆前用蔗糖梯度离心或琼脂糖凝 胶电泳将DNA群体按大小分部分离。
第一节 DNA克隆片段的产生与分离
一.基因组DNA的片段化
1.用限制酶片段化:
用限制酶消化DNA，不经凝胶电泳分部离,直接和载体 连接的克隆方法叫鸟枪法(shot-gan approach)
存在的问题：
①所形成的重组体分子是一群带有大小不同插入片段 的混合群体。以每个载体可插入1～3kbDNA计算，
cDNA(double stranded对丰度；
(2)筛选方法：
除简单的分子杂交法外还可对表达产rRNA和tRNA因其丰 富和大小的一致性，可以通过分级直接分离)。 mRNA的提取可以通过多胸腺嘧啶的柱子分离。 然后被反转录。cDNA第一链的合成用oligo(dT) 引物，因为长的mRNA没有被完全反转录,因此 中部可加另一引物。第二链cDNA的合成是用 自身引物的，一个更有效的方法是在cDNA第 一链加尾(如多聚胞嘧啶)，然后用oligo(G)为 引物起始第二链的合成。这样产生的双链 cDNA可以通过加接头或同聚尾巴插入载体。
基因库至少含10～30万个重组质粒。从中筛出目的基 因工作量是很大的。
②目的基因内部可能有一个以上的酶切位点，即一个 基因分载在 几个重组质粒上，完整筛出更不容易。
2.随机片段化：
超声波：可产生300bp的短片段。
高速搅拌：1500转/分×30分 长度8kb的分子群体。
可切 平均
3.双酶消化
单酶消化的产物一般分子较大，选择时要考 虑到载体容量，如噬菌体插入片段不超过 25kb,为此可选用识别4bp的限制酶(切割平 均长度为256bp) ,识别6bp的限制酶切割平 均长度4096 bp.