最新基因组文库的构建.ppt

NA分子导入宿主细胞， 让其自主复制，重组DNA分子被扩增（重组子机挑取一些转化子或重组子，提取质 粒DNA，电泳量越高，可大大减轻后续 筛选基因工作量。
i. 两菌株分别培养,分别收集和制备，包装前混合---本底低（对λDNA分子大小有严格限制），高效。
ii. 两菌株分别培养，混合收集和制备----操作简单， 本底高，可包装不同大小的λDNA分子。
2） 重组λDNA分子的包装过程 包装制备物（-70℃）于冰上缓慢融化 加入重组 λDNA分子 边融化边混合边包装 离心除去 细胞碎片 λ颗粒于-70℃保存待用
sa c B
K anr
p a c lo x P
D N A h ea d fu l
+
+ p a c c le a v a g e
p r o te in
C re
R e c o m b ila tio n
DNA
A m p lific a tio n七. 利用YAC载体构建基因组1. 两臂DNA片段的制备:
第四章基因的建立来自基因文全部遗传信息的重组D因组DNA长度之比
S
C o s o r i A pr S
SalI Cos
S
H
S
S1 Cos
H
BamH I 小片段
Cos
H
35-45kb DNA 片 段
T4 DNA ligase
Cos
H
利
构用
建双
COS
基
因
组质
文粒
S
离体包装
S
库载
感 染 E.coli
体六. 利用P1载体构建基因组构建过程也与λ载体构建过程十分相似:
1. 两臂DNA片段的制备: pAD10sacB BamHI/ScaI 2. 供体DNA片段的制备: 部分酶切 蔗糖梯度离心 3. 两DNA的连接和重组DAN分子的包装

洗菌体碎片和 Pr
使单链DNA牢 固结合在膜上
• ⑵ 免疫结合法
• 噬菌斑转印到硝酸纤维膜上，各种cDNA 表达并呈现在噬菌体表面的蛋白质便牢 固地结合在膜上。然后将膜放入含有特 异抗体的溶液中进行免疫结合反应，洗 去未结合的抗体后，再与125 I 标记的第 二抗体结合, 从而找出带有放射性示踪信 号的斑点, 进而找出对应噬菌斑, 克隆扩 增, 提取DNA后经酶切可获目的基因。
衔接头：一端为平头，一端为粘末端。
（2）cDNA与载体相连
cDNA与一个载体在T4连接酶作用下以粘末端 互相连接，即为重组DNA 分子。
（3）导入宿主细胞 重组体在一定条件下导入宿主细胞培
养或保存。 宿主细胞必须是来自一个细胞的克隆
体，以保证它们的遗传性状相同。
筛选目的基因
⑴ 核酸杂交法 特殊标记的寡核苷酸链为 探针
利
用
基
因
文
库
筛
选某一Fra bibliotek基因
片 段
An efficient technique commonly used to detect a bacterial colony carrying a particular DNA clone.
4.7 DNA与蛋白质相互作用技术
•凝胶阻滞法
•DNase Ⅰ足迹法
4.7.1 凝胶阻滞实验
DNA来 源
基因组的大 小
（bp）
被克隆的 DN95 P=0.99
大肠杆 菌 酵母 果蝇
4.639X106 1.4X107 1.8X108
1.4X104 1.4X104 1.4X104
720 2300 2300
0
940 300皿内所形成的菌落或噬 菌斑）转印到硝酸纤维素膜上，碱解后加 带标记的探针进行杂交，能显示特异结合 探针的点（克隆）便是目的基因所在处。 确定菌落或噬菌斑的位置，扩增，提取， 再用限制性酶切出cDNA基因片断，即为目 的基因。（如图）

用小体系连接来寻找最适的比 例。 在电转化和包装侵染过程中， 在电转化和包装侵染过程中，首先选择转化 效率高的感受态细胞或行脱盐处理也可以明显地提高 其效率。 其效率。 对于电转化而言，选择合适的转化电压对不 对于电转化而言， 同插入片段的 DNA 的转化效率也有所不同。 的转化效率功与否的关键，载 载体的好坏是影响连接成功与否的关键， 体的制备要求两点： 体的制备要求两点： 一是纯度高； 一是纯度高； 二是去磷酸化好。 二是去磷酸化好。
Hale Waihona Puke 2．高质量大分子量基因组 DNA的提取和 mRNA 分离； 分离； 第一， 第二，第一链 cDNA 合成； 合成； 第二， 第三，第二链 cDNA 合成； 合成； 第三， 第四，双链 cDNA 克隆进质粒或噬菌体载体并 第四， 导入宿主中繁殖。 导入宿主中繁殖。
表示重组克隆平均插入片段的大小和基表示重组克隆平均插入片段的大小和基因组因组dnad体噬菌体phagephage粘粒载体粘粒载体cosmidcosmid细菌人工染色体细菌人工染色体bacterialcosmidcosmid细菌人工染色体细菌人工染色体bacterialbacterialbacterial载体的选择载体的选择artificialchromosomesbacartificialchromosomesbac酵母人工染酵母人工染色体色体yacyacyeastartificialchromosomesyeastartificialchromosomesyacsyacsp1p1bacteriophagep1bacteriophagep1和DNA 片段是互补 DNA （complementary DNA , cDNA）。 cDNA cDNA）。 是由生物的某一特定器官或特定发育时期细胞内 的 mRNA 经体外反转胞内转录水平上的基因的群体， 时期细胞内转录水平上的基因的群体，并不能包 括该生物的全部基因，且这些基因在表达丰度上 括该生物的全部基因， 存在很大差异。 存在很大差D表明，提取的基因组 DNA 分子 实践表明， 量越大，所得到的重组克隆的插入片段越大。 量越大，所得到的重组克隆的插入片段越大。

物体中，不同组织和细胞在不同时段的mRNA 种类不同（即基因基因组基因的构建程序载体和受体的选择
出于压缩重组克隆的数量，用于基因组构建的载体通常选装载量较大的l-DNA或考斯质粒；对于大型基因组（如动植物和人类）需使用YAC或BAC载体
由于绝大多数真核生物的几种载体的最大装载量如下：
质粒
01
02
03
04
05
06
07
08
09
10
ABC
DEF G
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
A
1
1
1
1
B
1
11
1
C
1
1111D Nhomakorabea1
1
11
1
E
1
1
1
1
F
1
1
11
G
1
1
1
1
01 04 12 06 13 14 02 14 07 19 11 15 05 08 16 0的克隆都是随机序列，必须将所有的克隆排 列成一个像天然染色体DNA上所表现出的信息基因的基本概念 基因的构建程序 基因组重组克隆的排序
基因的基本概念基因库与基因
基因库（gene pool） 特定生物e bank） 从特定生物个体中分离的全部基因，这些基因以克隆的形式 存序列为探针，进行第二步走 读，直至线型染色体DNA的端点
染色体走读法（chromosome walking）
亚克隆旁测序列

➢ 经典遗传学中，遗传多态性指等位基因的变异；现代遗传 学中，遗传多态性指基因组中任何座位上的相对差异或 DNA序列的差异；
➢ 遗传标记可用于连锁分析、基因定位、遗传作图、基因转 移、辅助选择育种等；
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形态标记 (morphological markers)
细胞学标记 (cytological markers)
➢ 用具染色体变异的材料与正常材料杂交，特定染色体上的 基因在减数分裂过程中的分离和重组发生偏离，由此可测 定基因所在染色体及其位置；
➢ 克服了形态标记易受环境影响的缺点，但标记材料的产生 需大量的人力物力进行培养选择；
➢ 有些物种对染色体变异的耐受性差，难以获得相应的标19 记 材料。
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➢ 形态标记简单直观、经济方便， 容易观察记载。
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形态标记的不足
➢ 可以观察到的标记非常有限，难以建立饱和的遗传图谱； ➢ 许多形态标记受环境、生育期等因素的影响； ➢ 复等位基因位点很难全部鉴定、标记出来。
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2.1.2 细胞学标记
➢ 指能明确显示遗传多态性的细胞学特征。染色体的结构和 数量特征是常见的细胞学标记；
20世纪80年代后期,人们开始应用微卫星序列(microsatellite,MS)绘制图谱。1994
年底，美、法完成了以RFLP及微卫星ＤＮＡ为标志的遗传图谱.图谱包含了
5826位点，覆盖4000cM，分辨率高达0.7cM．1996年法国报道了完全以微卫星
DNA标志构建的遗传连锁图，包含2335位点，分辩率为1.6cM
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RFLP标记的特征
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➢ 同一亲本及其子代相同位点上的多态性不变；

5. 重组 重组cDNA分子的转移和的建立 分子的转移和的建立选用载体为质粒，可直接转化 载体， 选用载体为质粒，可直接转化E.coli；若为 载体，则 ；若为λ载体 需进行体外包装、感染等。 需进行体外包装、感染等。
ds-DNA合成 与SalI匹配 接头相连 NotI酶切
cDNA的段或条件的某种细胞分 定义：
离到的全部mRNA经反转录成 cDNA后再重 经反转录成 离到的全部 后再重 组和增殖所产生的无性繁殖系的总和。 组和增殖所性
常来自结构基因， 常来自结构基因，仅代表某种生物的一小部分遗传信 且只代表那些正在表达的基因的遗传信息： 息，且只代表那些正在表达的基因的遗传信息：1—5% mRNA，80—85% rRNA，10—n(1―p) ln(1―f)
f为某一特定 为某一特定cDNA（mRNA）的分子数目与全部 为某一特定 （ ） cDNA (mRN1. 载体 载体DNA片段的制备 片段的制备 2. 多聚（A）RNA的分离与纯化 多聚（ ） 的分离与纯化 3. 双链 双链cDNA 的合成
2. 器官特异性
不同器官或组织的功能不一样， 不同器官或组织的功能不一样，因而有的结构基因的 表达就具有器官特异性，故由不同器官提取的mRNA所 表达就具有器官特异性. 代谢或发育特异性
处于不同代谢阶段（或发育阶段） 处于不同代谢阶段（或发育阶段）的结 构基因表达亦不相同
4. 不均匀性在同一个cDNA中，不同类型的cDNA分 中，不同类是大不相同的，尽管它们都是由单拷 贝基因转 贝基因均有相同的克隆数相较，这是两种文 库的另一差别。 库的另一差别。
NotI primer/adaptor
载体
1)SalI/NotI 2)T4 DNA ligase
SalI adaptor

物理剪切—利用振荡、超声等物理方法剪 切可以非常随机地进一步将长片段切割成 小片段，片段末端通常都是平末端
限制性酶解—位点非随机分布。常用的酶 是Sau3A，该酶产生的酶切黏性末端与 BamHI酶解载体产生的末端相同
基因组DNA片段的限制性内切酶酶解
• 使用限制性内切酶酶解基因组DNA可产生非 随机片段，为了获得15－25kb的或更大的基 因组DNA片段（适用于λ噬菌体或黏粒载体 的片段），需要进行部分酶解，即通过合理 使用限制性内切酶（种类和用量），调节酶 切片段的大小
• 也可用反转录酶或Klenow酶延伸引物来合 成第二链。
•
cDNA末端的处理
• 由于大片段的平末端连接效率非常低，因 此为了避免用平末端体（EMBL3等）
• EMBL3 ：载体大小为 43kb ，其左臂、右臂和 填充片段的大小分别为 20kb、 9kb 和 14kb 。 从提高克隆效率角度来看，它们克隆 DNA 片段
的大小为 9-23kb 。在填充片段中带有 red 和 gam 基因，当外源片段替换填充片段后，重组 体将变成 red-gam- ，同时载体上含有 chiC 位
mRNA的提取
• 全长mRNA具有 一个polyA的3’ 末端，可以被用 于mRNA的分离；
• 可以用寡聚纤维 素柱，选择性地 吸附mRNA
• 纯化
• 用结合有寡聚（dT ）的磁珠加到细胞裂解 液，在用强磁铁吸出磁珠并洗出mRNA。
检测mRNA
• 翻译，检测翻译产物： 用无细胞翻译系统（如麦胚抽提液 或兔网织红细胞裂解液）来检测 mRNA的完整性，也可用凝胶电泳 直接检测，用杂交法分离 mRNA。
示差筛)
• 扣除杂交又叫扣除cDNA克隆(subtractive cD)得以实现的。

cDNA 只能反映基因表达的转录及加工后的 mRNA 产物所携带的信息 , 也即 cDNA 序列只与 基因的编码序列有关 , 不能反映基因的内含 子 , 也不能反映基因的转录启动子和终止子 等,所以cDNA便于克隆及大量扩增,构建的文 库复杂性低 , 库中总的克隆数较少，则从中筛选
特异基因比较容易，但由于插入片段较 长，以后的分析比较困难。
因为基因组DNA片段是随机克隆的，所以基因组大小除以
克隆片段大小得到的只是克隆数的理论值，从统计学的角
度分析，从这个理论克隆数中克隆到特定基因片段的几率 只有50%。当克隆数增A数
细胞中某种mRNA的拷贝数
例如 某细胞的总mRNA数为500500个
如 获 得 丰 度 为 每 细 胞 3500 拷 贝 (14 拷 贝 ) 的 mRNA 基 因 , 应 构 建 的 文 库 的 最 小 值 为 500500/3500 (14) =143 (35750) ;
通常选质粒载体或噬菌体载体。
以 质 粒 为 载 体 构 建 文 库 示 意 图 cDNA
以 λ 噬 菌 体 作 载 体 构 建 cD织中,并 非所有的基因都表达,通常表达的基因 仅占基因总数的15%,产生出约15000种 不同的mRNA分子,因此在mRNA水平上分 离目的基因,可以大大地缩小搜寻目的 基因的范围,降低分离目的基因的难度.
真核生物mRNA分子的3`端有多聚腺核苷酸组成 的poly(A)尾巴，这种特性为分离纯化mRNA分子 提供了方便。
cDNA第一链的合成
cDNA第二链的合成
cDNA第二链的合成
cDNA第二链的合成cDNA构建时载体的选择：由于绝大多数真核生物的mRNA00) 个克隆子组成的cDNA文 库中应包含1个如此

目标基因组的大小 载体装载的平均片段＝ 重uestion2装载量 ➢ 所用的内切酶对基因组DNA的完全切割
频率和6Kb
★
G
Chemically synthesized
oligonucleotide
★
Anneal
TCAGGCT
T
★
Wild-type
(1) (1) DNA polymerase + 4 dNTPs
(2) T4 DNA ligase + ATP
正链DNA的合成
按照体外
DNA重组技术,将待突变的DNA片
G
段插入到M13噬菌体上. 然后制备
平末端 连接
加接头造成 粘性末端
细菌转化
重组噬菌体 DNA转染
重组质粒 的转化
体外包装 进行转导
重组体 的鉴定
表型鉴定
核酸杂交
免疫学分析
酶切A，把 所得到的大量基因组DNA片段与载体连接， 然后转化到细胞中去，让宿主菌长成克隆。 是某个生物体全部基因的随机片段的重组 DNA克隆群体。
SI核酸酶处理 Klenow 酶， 连接酶处理
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一、缺失诱变 2、通过酶切图谱完成中间缺失
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第三节：克隆DNA序列的体外诱变
二、盒式突变 1、原理：利用一段人工合成的具有突变序
列的寡核苷酸片段,取代野生型基因中的 相应序列。 2、人工合成的突变序列的特征
由两条合成的寡核苷酸组成的,当它们退火时,会按 设计要求产生出克隆需要的粘性末端, 由于不存在 异源双链的中间体,因此重组质粒全部是突变体。
(1) Screen plaques with 32P-labelled oligonucleotide as hybridization probe; (2) Isolate mutant

Bait plasmid
AD gene prey gene
prey plasmid
诱饵与靶蛋白之间的 相互作用激活了报告 基因的表达
AD Gal4激活域
Prey (Y)
Bait (X)
BD
Gal4结合域
operator
LacZ
Repotep-
精选PPT课件
特点是：已知蛋 白产物，但对其 核酸序列或氨基 酸序列基本未知
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C、利用同源基因中的目标基因序列
用不同来源的DNA分子制备成探针进行检测。 如：用来自鼠的基因A去检测人类中基因A 或基因家族中成员A去检测成员B
精选PPT课件
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D、利用差异表达基因的扣除cDNA探针
表达目标基因
TTTTTTTTTTTTTTT
逆转录polyT引物
C、随机引物
精选PPT课件
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第一节：将mRN有以下二种种方法：
A、降解mRNA-cDNA杂合链中的RNA， cDNA第一链3’端回折充当引物，形成第 二链
mRNA cDNA
E、洗脱的噬菌体感染宿主细胞后经繁殖扩增， 进行下一轮洗脱
F、经过3轮～5轮的“吸附-洗脱-扩增”后，与 靶分子特异结合的噬菌体得到高度富集。所得 的噬菌体制剂可用来做进一步富集有期望结合 特性的目标噬菌体。
精选PPT课件原理
A、转录激活因子GAL4
基因重组
cDNA
精选官或组织中的 比较多，在中 也有少数的克隆代表稀少mRNAs
如果某个基因有多种拼接方式，在中 也有代表该基因不同拼接方式的克隆。
精选PPT课件
✓ N端：147个氨基酸组成的DNA结合域(DNA binding domain,BD)