微生物蛋白酶的分共33页

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用胰酶水解酪蛋白得到的一种10肽 （Arg.Glu.Ser.p.Leu.(Ser)4.4P.Glu.Arg），叫酪 蛋白磷酸肽（CCP），具有促进钙铁吸收的作用，是 众所周知的补钙功能性食品配料。 由大豆蛋白、鱼肉蛋白、酪蛋白酶水解得到的一种 可有2-12个氨基酸组成的抑制血管紧张素的小肽 （ACEIP），可控制血压，因不像化学合成的血管紧 张素抑制剂（ACEI）那样会对肾脏有损害。
动物来源蛋白抽提物及肉味香精基料
Protamex® 复合蛋白酶/ Flavourzyme® 500MG 对原料肉、肉渣、骨、血等动物加工副产品进行水解，生产功能 性骨、肉提取物（骨素）、水产提取物、蛋白胨、肽等 ，保证 原料较彻底的水解及最终产品度较高蛋白质利用率，产品风味醇 厚自然，毫无苦味之干扰。
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3、按蛋白酶来源分为动物、植物和微生物蛋白酶
（1）动物蛋白酶: 如胰蛋白酶（Pancreatic Proteinases）、胃蛋白 酶（Pepsin）、凝乳酶（Rennin） （2）植物蛋白酶： 木瓜蛋白酶(Papain)：最适pH5-7，作用pH范围3-9; 最适温度65℃，作用温度范围30-70℃，生成产物： 氨基酸。 菠萝蛋白酶(Bromelain)、无花果蛋白酶(Ficin)： （3）微生物蛋白酶 酸性蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶
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菠萝蛋白酶使用条件



最适反应温度45℃ ，最佳温度因底物的种 类及浓度不同而有所改变。 最适pH值6-7，最适宜pH因底物的种类、浓 度不同而有所改变。 添加量一般为 0.2—1.0% ，根据不同底物 作适当增减，反应时间在 3-8hr 作相应缩短 或延长。
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微生物蛋白酶
到本世纪初，已经报导的微生物蛋白酶超过900种。目前 我国生产的微生物蛋白酶主要有： 1、酸性蛋白酶，由黑曲霉As3.350，宇佐美曲酶537 生产， 最适pH2.5-3.0，稳定pH2-6,最适反应温度47-55℃， 55℃失活。 2、中性蛋白酶, 由枯草芽孢杆菌1.398生产，最适pH7.0,稳定pH5.5-8.5； 最适反应温度45℃，60℃易失活。 栖土曲霉3.492中性蛋白酶，最适pH7.5及10，稳定pH5-10； 最适反应温度45℃，50℃以上迅速失活。 放线菌166中性蛋白酶，最适pH 7.0-8.0；最适反应温度 40℃，40℃以上易失活。

4、羧基蛋白酶（酸性蛋白酶）
活性中心：有2个羧基。
抑制剂：对-溴苯甲酰甲基溴或重氮试剂。
胃蛋白酶、凝乳酶和许多霉菌蛋白酶在酸性范围
内具有活性。最适pH在2~4。
三、 常用蛋白酶及其特性
1、酸性蛋白酶
羧基蛋白酶，活性中心含有2个天冬氨酸残基 最适pH：2.5~5.0 最适作用温度：45~75 ℃。 分子量：30000-40000 等电点低：3-5
中的蛋白质，对稳定绿茶饮料十分有利。
谢 谢！
4、 丝氨酸蛋白酶
共性与特性： • 主要有胰蛋白酶、α-凝乳蛋白酶和弹性蛋白酶 等。 • 共同特征：内切酶，活性中心含有丝氨酸残基， 此外活性中心还有咪唑基和羧基，并且在一些 蛋白酶活性中心部分的氨基酸连接顺序相似。
（1）α-胰凝乳蛋白酶
由3条多肽链组成，以2个链间二硫键连接在一起。 还含有3个链内二硫键，分子量25000左右。
•
如果采取有控制的酶水解，使蛋白质的水解反 应停止在某一个阶段，使肽链具有足够的长度将疏
水性氨基酸埋藏在它的结构的内部，就能减少水解
蛋白质的苦味。
五、蛋白酶作为食品添加剂的应用
• 1、作为肉类嫩化剂 • 用于肉类嫩化剂的蛋白酶必须具有较高的耐热性。因为嫩
化剂的作用主要发生在当肉类被烧煮，温度逐渐升高，而酶
第六章 蛋白酶
地位
• 蛋白酶是食品工业中最 重要的一类酶。 • 应用广泛，如干酪生产、 肉类嫩化、植物蛋白质 改性等大量使用。
存在
• 广泛
• 植物：菠萝、木瓜、无花果
• 动物：消化道---胃蛋白酶、胰凝乳酶、 羧肽酶、氨肽酶等。 • 微生物：细菌、霉菌、酵母、放线菌。
蛋白酶
水解蛋白质中肽键。
COSR）和异羟污酸（-CONHOH）等。

*
*
（1）木瓜蛋白酶（EC 3.4.22.2）
• 在pH5的弱酸性条件下最稳定。底物不同，它 的最适pH也会改变，酪蛋白最适pH为7，明胶 则为5。 • 最适作用温度一般在65℃,在较高温度下仍然保 持活性，例如在中性条件下70℃加热处理 30min，对牛乳的凝结活性仅下降20%； • 商品化的木瓜蛋白酶中，真正的木瓜蛋白酶一 般只占可溶性蛋白质总量的10%，另外的蛋白 酶还有木瓜凝乳酶、溶菌酶以及木瓜肽酶等。 在肉品嫩化、啤酒加工中有应用。
* Ser-Ser-Cys-Met-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Leu-Val-Cys-Lys-Lys-As *
Ser-Gly-Cys-Gln-Gly-Asp-Ser-Gly-GlyPro-Leu-His-Cys-Leu-Val-As
Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val-Met-Lys-Ser-Pr
• 由三个肽链组成，由双硫键将各部分结 合在一起。胰凝乳蛋白酶原A由245个氨 基酸残基（分子量约为25,000），分子中 有五个双硫键，它没有酶的活性；在胰 蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的作用下，裂解 生成了-胰凝乳蛋白酶。
图
1 Cys
胰凝乳蛋白酶原的激活过程示意图
245 胰凝乳蛋白酶原A 胰蛋白酶 15 Arg 16 胰凝乳蛋白酶 146 Tyr B链 15 147 148 149 Ala C链 Thr Asn 245 胰凝乳蛋白酶 Asp Asp 胰凝乳蛋白酶
蛋白酶
第11问题
蛋白酶的分类、常见的种类
3.1.1、蛋白酶的作用
水解蛋白质或多肽中的酰胺键（肽键）。
COOH R1—CH—N—H + HO—C—CH—R2 H O COOH R1—CH—N—C—CH—R2 + H2O H O NH2 NH2

外肽酶
外肽酶分Aminopeptidase和carboxypeptidase。 n 氨肽酶多为胞内酶，广泛存在于细菌和真菌 中。它从多肽链N端水解下一个氨基酸残基， 二肽或是三肽。 n 羧肽酶作用于多肽链的C端，水解下一个氨 基酸或是二肽。据酶活性位点氨基酸残基的 特点，可将羧肽酶分为:丝氨酸羧肽酶，金属 羧肽酶，半胱氨酸羧肽酶。
微生物蛋白酶的分子和生 物技术方面的概述
Molecular and Biotechnological Aspects of Microbial Proteases
汇报人：马纳纳
2012年9月20日
PROTEASES
1.来源 1.动力学机制
2.分类
2.生理学功能 3.应用
1. 基 因 改 造 2.蛋白质工程 3.序列同源性 及进化关系
Plant Proteases
Animal Proteases
胰蛋白酶 Trypsin （丝氨酸蛋白酶，水解lys， arg羧基形成的肽键） 糜蛋白酶 Chymotrypsin （水解 phe，try，
tyr 羧基形成的肽键）
木瓜蛋白酶 Papain (最适pH5~9)
菠萝蛋白酶 Bromelain ( 最适pH5~9）
例如：用于洗涤剂的碱性蛋白酶应有1）广泛的底 物特异性，以加速多种污迹的去除。2）在洗涤剂 各种助剂如螯合剂、氧化剂等共存下稳定。 纳豆激酶：溶栓作用。



研究蛋白酶动力学，必先纯化，纯化方法有亲和 层析，离子交换层析，凝胶过滤层析等。
四. 蛋白酶动力学机制

1.丝氨酸蛋白酶：据其底物偏好可分为：类胰蛋 白酶，类糜蛋白酶和类弹性蛋白酶。丝氨酸蛋白 酶含有Ser-His-Asp催化三联体。 It involves a two-step reaction for hydrolysis. This acylation step is followed by a deacylation process which occurs by a nucleophilic attack on the interme-diate by water, resulting in hydrolysis of the peptide.

高岭土吸附
洗脱、压滤
汁液
吸附物
洗脱液
盐析
盐析物
离心 湿粗酶饼 溶解、过滤 澄清液
沉淀 湿酶
干燥
精品
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菠萝蛋白酶
(2)单宁沉淀法工艺流程
压榨
菠萝下脚料
汁液
去杂质
澄清液 加稳定剂
稳稳定定液液
加单宁 单宁沉淀物 洗脱
滤液
干燥
酶制品
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菠萝蛋白酶
(3)超滤浓缩法工艺流程
菠萝下脚料 压榨
汁液 去杂质
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金属蛋白酶的特性
❖ 从鲤鱼肌肉中纯化得到的金属蛋白酶活性温 度范围为30～50℃；
❖ 来源于草鱼肌肉的金属蛋白酶最适温度为 40℃；
❖ 来源于微生物的金属蛋白酶其对温度的耐受 性更强。
❖ 最适pH值在7.5～8.0之间。
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1）广泛存在于动物胰脏、细菌、霉菌中,活性中心含 丝氨酸残基,酶活性可受到二异丙基磷酰氟(DFP),苯 甲基磺酰氟(PMSF)和马铃薯抑制剂（PI)等的专一 性抑制。
2）酶学性质 ➢ 酶的最适pH在9.5~10.5，个别为中性 ➢ 分子量在15~30kDa ➢ 等电点PI约9,在低温下于pH9~10稳定,但在65℃时
3、4、2、3 天门冬氨酸蛋白酶类
[carboxyl(asid) pritelnase]
活性中心含 Asp,最适pH 在5以下
胃蛋白酶 凝乳酶
3、4、2、4 金属蛋白酶类
活性中心含有
(metallopritelnase)学习文档Z等n金2+属、 Mg2+
枯草杆菌蛋白酶 嗜热菌蛋白酶
2.1 丝氨酸蛋白酶

Haihui Zhang Email：z_haihui@
影响凝乳酶活性的因素
（1）PH：在酸性环境中凝乳酶活力最强，原奶酸度的任何微小变化 均能显著影响凝乳酶的活力。凝乳酶活力大部分来源于其中的胰蛋白 酶，小部分来源于牛胃蛋白酶（不过猪凝乳酶中的有效成分是猪胃蛋 白酶）。胰蛋白酶的最适PH为5.4，而胃蛋白酶的最适PH低于胰蛋 白酶。 （2）温度：凝乳酶的最适温度是42摄氏度。（到55-60摄氏度，酶 本身受到破坏）因为乳温明显影响凝结速度。乳温30摄氏度时原奶 凝结时间是42摄氏度的2-3倍。不过实际干酪生产中乳温通常保持在 30-33摄氏度，一是考虑到乳酸菌的最适温度（比如链球菌属的最适 温度在30摄氏度左右，最高不能超过40摄氏度）；二是较高乳温下 凝块硬化速度太快，以至随后的切割比较困难。 （3）Ca 2+浓度：只有原奶中存在自由钙离子时，被凝乳酶转化的酪 蛋白才能凝结。因此钙离子浓度将会影响凝乳时间、凝块硬度和乳清 排出。
2、明胶的生产 、
原料 动物的皮或骨 生产方法 酸法或碱法，也可用蛋白酶水解法生产。 酸法或碱法，也可用蛋白酶水解法生产。 酶法生产明胶的工艺流程如下： 酶法生产明胶的工艺流程如下：
原料 炭处理 切割、 切割、捣碎 过滤 干燥 水洗 加酶水解 除酶 提取 活性
明胶产品
Haihui Zhang Email：z_haihui@
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1、氨基酸的生产 、
• 基本工艺流程 蛋白质 酸混合液 • 前处理 一般采用热处理的方法，也可采取生化分离技术将 蛋白质先提取出来，再进行酶解。 原料处理 分离纯化 加蛋白酶 氨基酸产品 水解 氨基
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3、氧化为CO2和H2O
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丙氨酸 苏氨酸 甘氨酸
丝氨酸
碳骨架的氧化
CoASH
精氨酸 组氨酸 谷氨酰胺 脯氨酸
半胱氨酸
柠檬酸
丙酮酸
乙酰CoA 草酰乙酸
乙酰乙酰CoA
天冬酰胺
异柠檬酸
谷氨酸
异亮氨酸
甲硫氨酸
α-酮戊二酸
缬氨酸
苯丙氨酸 酪氨酸 亮氨酸 赖 O2 + H2O D或L－AA氧化E
NH2
O
R－C－COOH + NH3 + H2O2
（存在于动物肝、肾和某些细菌、真菌中）
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COOH
CHNH2 CH2 + H2O CH2 COOH 谷氨酸
COOH C=O 谷氨酸脱氢酶 CH2 + NH3 NAD(P)+ NADPH CH2
嗜热菌蛋白酶
O
O
O
H2N－CH－C－N－CH－C－N－CH－C－N－CH－
R1
H R2
H R3
H R4
氨
胃 芳 胰凝 非
肽
蛋 香 乳蛋 极
酶
白 族 白酶 性
酶 AA
AA
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O
O
O
O
－C－N－CH－C－N－CH－C－N－CH－C－N－CH－COOH
H R5
碱 性
AA Lys Arg
？
体内水循环迅速，NH3浓
度低，扩散流失快，毒
哺乳、两栖动物排尿素 性小。
现在是30页\一共有38页\编辑于星期五
？
H2N

注：PFP．二异丙基磷酰氟 甲基磺酰氟 Ph 马铃薯蛋白酶抑制剂 EDTA：乙二胺四乙酸
PCMB：对氯汞苯甲酸 PMSF．"苯 DAN：重氮乙酰正．DL．亮氨酸甲酯 OP：郯二氮杂菲)(菲绕啉)
2．关于微生物蛋白酶的生产
蛋白酶是用途最广泛的酶制剂之一，主要用于洗涤剂，制革、毛皮、蛋白水解物、酿酒、 酱油，以及纺织、医药品、化妆品等的生产上。全球蛋白酶的销售额占酶制剂市场的60％， 我国2005 年全国(外资合资企业不计)微生物酶制剂产量约48 万吨，总销售额约20 亿 人 民币，其中蛋白酶约10 万吨，销售额近9 亿人民币。
食品、饲料加工
蛋白质水解、脱苦、调味液
食品饲料加工
动植物蛋白水解、面包、发酵食品
面包制造
。·
动植物蛋白水解、调味液
弱碱性蛋白酶、调味液
水解蛋白质
Actinase(科研医药)
灰色链霉菌
试剂、食品加工、医药
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Pantiase NP-2(Yokult)
酸性蛋白酶： SumizymeAP(新日本) Sumizyme RP(新日本) Molsin(Seishin 制药) Neulase F(天野)
奶酪制造
3．蛋白酶的利用 蛋白酶的用途非常广泛(表3)，最大的用户是洗涤剂，其次用于饲料、食品工业、酿
酒酿造，以及制革工业和医药。
用途
说明
表3 蛋白酶的用途
干酪制造
凝固酪蛋白，缩短成熟时间 酱油酿造
预处理大豆，提高蛋白质利用率 天然调
味液制造
水解蛋白质，增强风昧，制HVP、HAP
酒精，酿酒
水解蛋白质，促进酵母发酵
啤酒澄清 酿醋
分解啤酒单宁蛋白沉淀，延长保质期 缩短酿醋周期，增加食醋得率

破碎细胞的方法有: 机械法，物理法，化学法和酶法
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11.2.1 机械破碎法 • 指通过机械运动所产生的剪切力使细胞破碎的方法，常用的有如下几种：
• 1.机械捣碎法
• 利用捣碎机的高速旋转叶片所产生的剪切力将组织细胞破碎。 10000r/min
• 此法在实验室和生产规模均可采用。
• 2.研磨法
• 突然降压法的另一种形式为爆破性减压法是将菌体悬浮在高压 容器中，用氮气或二氧化碳加压到几十至几百大气压，振荡几 分钟，使气体扩散到细胞内，然后突然排出气体，压力骤降， 使细胞破碎。
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压力差破碎法
• （3）渗透压差法是利用渗透压的变化而使细胞破碎。 • 应用时先将对数生长期的细胞从培养液中分离出来，再悬浮在20%左右的蔗糖
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球蛋白溶解度-溶液离子强度关系
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盐析
• 中性盐类使蛋白质发生沉淀的原因： • 1).中和蛋白质分子表面电荷 • 2).与蛋白质颗粒竞争水分子 • 不同蛋白质表面极性基团、带电数目及分布等不
同，因而可以分级沉淀。 • 盐析法应控制pH使接近等纯化酶的等电点。蛋
• 性质
方法
• 分子大小
离心，超离心法、凝胶过滤，
膜分离技术（超滤，反渗透，
微孔过滤，透析，电渗析等）
• 溶解度
法，
盐析法，有机溶剂沉淀法，共沉淀
选择性沉淀法，结晶
• 电荷或基团
离子交换色谱，电泳，等电聚焦，
吸附 色谱，疏水色谱，聚焦色 谱
• 稳定性
选择性变性法（热，酸碱，
表面活性剂）
• 特殊（专一性结合）第30亲页/共和13色9页谱，亲和洗脱，亲和电