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![一种基因突变检测试剂盒[发明专利]](https://img.taocdn.com/s1/m/3bed7e8d561252d380eb6ee9.png)
专利名称：一种基因突变检测试剂盒
专利类型：发明专利
发明人：张佳炜,葛维挺,古莹,胡涵光,蔡文,吴德昊,慕佳怡,郑树
申请号：CN202011299523.2
申请日：20201118
公开号：CN112391472A
公开日：
20210223
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明公开了一种基因突变检测试剂盒，所述检测试剂盒包括：基因组DNA提取试剂、含有捕获CAMK1G基因探针的文库构建试剂、二代测序试剂；所述捕获CAMK1G基因探针捕获区域为染色体编号chr1，区域位置209583729～209613938，区域为外显子区域及外显子内含子交接区域。
根据该检测试剂盒可帮助判断黑色素瘤患者接受免疫治疗的疗效，提高黑色素瘤患者接受免疫治疗的有效率，降低患者死亡风险。
申请人：浙江大学
地址：310058 浙江省杭州市西湖区余杭塘路866号
国籍：CN
代理机构：杭州求是专利事务所有限公司
代理人：邱启旺
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一管式点突变试剂盒使用说明One-Stop Point mutation Kit产品及特点基因的定点突变是重要的分子生物学技术，广泛用于载体构建、基因改造、蛋白质功能研究等领域。
但传统的方法需要使用单链DNA模板，而得到单链DNA模板又需要先将基因克隆到类似M13这种载体中，操作过程冗长。
为了克服这些缺点，本公司将突变位点设计到一对互补的引物中，用高保真扩增质粒模板，然后用Dpn I去除原始的甲基化模板，新合成的DNA通过互补形成带切口的双链质粒，直接用于转化感受态细菌。
本方法过程示意图如下：本产品具有下列特点：1.直接使用质粒DNA作为模板，免去了制备单链DNA的步骤。
2.基于高保真PCR，对模板DNA序列没特殊要求，可以用于突变任何序列。
同时对模板的需求量很少。
3.一管式，全部在一个优化的缓冲体系中完成，非常简单。
4.使用Dpn I去除未突变模板，突变效率高达90%。
5.可用于制备点突变，缺失突变和插入突变。
6.本产品A型适用于8kb一下，B型适用于8-15kb。
规格及成分成份A型10次包装B型10次包装高保真酶A型10uL无高保真酶B型无10uL5×高保真酶Buffer A型100uL无5×高保真酶Buffer B型无100uLdNTP（2.5mM each）50uL50uLDpn I酶10uL10uL超纯水1mL1mL使用手册1份1份运输及保存低温运输、-20℃保存,有效期一年。
自备试剂质粒DNA、突变引物、细菌转化试剂使用方法一、引物设计及注意事项用于特定基因突变的引物必须用户单独设计，请参考如下一些基本原则进行设计。
1.共需设计两条完全互补的一对引物，它们覆盖要扩增的突变区位点，突变位点最好放在引物的中心。
可以先集中设计一条，然后就可得互补的另一条引物。
2.引物的长度通常为25-45个碱基。
引物中突变位点任何一侧都必需满足Tm大于45的条件，Tm计算方式为Tm=4×(GC碱基数)＋2×(AT碱基数)。
碧云天生物技术/Beyotime Biotechnology 订货热线：400-1683301或800-8283301 订货e-mail ：******************技术咨询：*****************网址：碧云天网站 微信公众号基因组编辑突变检测试剂盒产品编号 产品名称包装 D0508S 基因组编辑突变检测试剂盒 25次 D0508M基因组编辑突变检测试剂盒100次产品简介：碧云天生产的基因组编辑突变检测试剂盒(Genome-Editing Mutation Detection Kit)，也称基因编辑突变检测试剂盒(Gene-Editing Mutation Detection Kit)，是一种简单、可靠、快速的基于T7 Endonuclease I (T7EI)的用于检测基因组DNA 在基因编辑后发生突变的试剂盒。
本试剂盒主要利用了T7 Endonuclease I (T7EI)能识别并酶切不完全配对的DNA 双链(也称异源双链DNA ，heteroduplex DNA)的特性。
本试剂盒组分特别齐全。
提供了包括一步法基因组DNA 提取、高保真PCR 扩增、变性退火和T7EI 酶切的全套试剂，并且还提供了阳性对照。
本试剂盒使用特别便捷。
一步法基因组DNA 提取非常快速便捷，并且提取后可以直接用于高保真PCR 扩增，PCR 扩增产物也可以直接用于后续的变性退火和T7EI 酶切。
无需额外的分离纯化步骤。
本试剂盒检测基因组编辑突变的原理如下。
首先需要编辑的细胞、组织或器官通过转染、病毒感染等技术手段表达CRISPR/Cas9 (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/Cas9 nucleases)、TALEN (Transcription activator-like effector nucleases)或ZFN (Zinc-finger nucleases)等核酸酶。
基因定点突变试剂盒产品简介：碧云天生产的基因定点突变试剂盒(Site-directed Gene Mutagenesis Kit)可以用于点突变，多个邻近密码子的突变，单个或多个邻近密码子的缺失(deletion)或插入(insertion)。
本试剂盒是一个利用目前最新的基因点突变技术设计而成的试剂盒。
只需通过基于PCR的突变质粒的合成，和基于Dpn I的模板质粒的消化，转化培养以及后续的酶切或测序鉴定，即可得到预期的突变质粒(参考图1)。
累计操作时间不足2小时即可完成基因的定点突变。
参考图1，使用本试剂盒时需要先设计长度通常为30个碱基以上的互补的两个引物，在引物中含有预期的突变位点。
然后以待突变的质粒为模板，用这两个引物进行PCR扩增反应。
这样可以产生含有预期的突变位点的双链质粒，但这个双链质粒中有两个nick位点。
待突变的质粒通常来源于大肠杆菌等细菌，在细菌中会被甲基化修饰，而在体外通过PCR扩增得到的质粒不会被甲基化。
这样用甲基化酶Dpn I处理，可以消化掉待突变的质粒模板，而使通过PCR扩增出来的含有突变位点的质粒被选择性地保留下来。
这样把Dpn I处理过的产物转化细菌后，质粒中有两个nick位点可以被大肠杆菌修复，得到的克隆就会含有预期的突变质粒了。
本试剂盒提供了DH5α甘油菌，可用于感受态细菌的制备。
本试剂盒共可以进行十次基因定点突变反应。
图1. 基因定点突变试剂盒原理图保存条件：-20℃保存，一年有效。
注意事项：需自行配制LB液体培养基和LB平板以用于细菌的培养。
需自行设计和合成用于基因定点突变的引物。
需自备用于细菌转化的试剂。
使用本试剂盒前请先阅读后面的常见问题。
为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
使用说明：1. 引物设计：用于特定基因突变的引物需要单独设计，请参考如下一些基本原则进行设计：(1) 共需设计两条互补的引物。
可以先集中设计一条，然后就可以得到互补的另一条引物。
定点突变试剂盒定点突变试剂盒概述：定点突变试剂盒可以在克隆于质粒DNA序列的特定位点诱导突变。
理论上可以保证突变率达到100%。
整个实验过程简单快捷只需要两个步骤。
试剂盒不需要用到M13载体和甲基化步骤。
该试剂盒可以诱导某个已知基因的特定碱基进行定点突变、再突变成野生型、密码子突变、插入或者缺失等，因此可以用于功能基因组学和蛋白质组学的研究。
另外由于试剂盒能够诱导特异基因突变，又可以应用于蛋白质工程学研究领域。
定点突变试剂盒操作十分简单（根据我们提供的引物设计原则设计引物；用Muta-directTM酶进行15~18个循环的PCR扩增反应；MutazymeTM酶处理选择突变克隆；转化）。
理论上在LB平板上的克隆100%是突变克隆，通过对突变克隆的测序分析，正确的突变可以应用于后续实验。
目录号规格价格SDM-15 15次950元产品特点:4. 样品反应体系（50μl反应体系）10x reaction buffer 5μl Sample plasmid （10ng/μl，total 20ng）2μl Sample primer (F) （10pmol/μl)1μl Sample primer (R) （10pmol/μl)1μl dNTP mixture（each 2.5mM）2μl dH2O 38μl Muta-directTM Enzyme 38μl5. PCR反应条件[注]按如下参数设置PCR扩增条件。
6. PCR扩增反应完成后冰育5分钟，然后置于室温（避免反复冻融）。
[注] 按下列提供的PCR条件进行扩增，控制PCR循环数。
注意当突变点位点超过4个时会发生突变率降低的现象。
[B] 突变质粒选择PCR反应结束后使用MutazymeTM酶消化甲基化质粒从而选择突变质粒DNA。
1. 准备PCR反应产物。
2. 加入1μl（10U/μl）MutazymeTM酶37℃温育 1小时。
[注]当质粒DNA用量过多时MutazymeTM酶可能发生与样品反应不完全的现象。
点突变试剂盒原理
1 点突变试剂盒原理
点突变试剂盒是第三代测序技术的一种，它可以实现样本的高通
量和高灵敏度的分析和检测，尤其适用于病毒病原体核酸的检测。
点
突变试剂盒通常包含多种组合以及试剂，是一种可以检测核酸浓度和
碱基改变的试剂装置。
2 原理
点突变试剂盒是根据病毒核酸的特定基因序列，检测病毒特征的
碱基（比如点突变、基因的重排），然后根据此类碱基组成的新序列
来检测。
点突变试剂盒为检测核酸浓度以及碱基改变提供高灵敏度和
高通量的分析和检测。
其原理是：经过宏基因组测序后，对测序结果
进行特定组合核酸引物（Primer）选择，按照一定序列进行扩增，在
原病毒基因序列基础上引入荧光标记，再通过荧光检测仪进行信号检测，最后根据检测结果计算出病毒的浓度及其碱基的改变情况。
3 优势
点突变试剂盒具有试剂装置便携性好，可在现场快速检测病原体、病毒核酸等特殊样本，准确率和效率高。
此外，这种试剂可以用来检
测叶酸基因、微生物基因以及病原体细菌的抗药性基因。
它还可以检
测一些新发病毒的浓度及其碱基的改变，帮助医务人员及时了解病毒
的变化趋势。
点突变试剂盒也具有一定程度的缺点，比如样本质量要求高，扩增的特异度要求高，有可能检测的结果偏差大，等等，但是它可以帮助我们准确检测病毒，大大提高了病毒检测的灵敏度和准确性。
点突变试剂盒原理
点突变试剂盒是一种基于聚合酶链反应（PCR）技术的分子诊断工具。
其原理是通过PCR技术快速扩增样品中的DNA，然后利用特定的酶切系统识别和检测DNA片段中的点突变。
点突变指的是DNA序列中单个碱基的改变，这种改变可能导致蛋白质结构或功能的变化，从而引起疾病或遗传性状的变化。
点突变试剂盒中包含一系列引物、酶切酶和荧光探针等试剂，这些试剂能够快速、准确地检测出样品中存在的点突变。
首先，PCR反应将样品中的DNA扩增至足够多的数量，以便后续检测。
然后，引物和酶切酶会寻找并切割DNA中存在的点突变位点，最后荧光探针会结合到切割后的DNA片段上，发出可见的荧光信号。
根据荧光信号的数量和强度，可以确定样品中是否存在点突变。
点突变试剂盒已经广泛应用于临床诊断、遗传咨询、药物研发等领域。
其优点包括操作简单、灵敏度高、选错率低等。
但同时也需要注意一些限制，如样品质量的要求、突变位点的局限性等。
- 1 -。
StarMut XL Site-directed Mutagenesis Kit
StarMut 超长基因定点突变试剂盒
【货号和规格】T113-01，10 rxn 【产品概述】
本试剂盒采用反向PCR (Inverse PCR) 技术，对含有目标基因的双链环状质粒进行扩增，直接导入突变序列，从而实现单个或多个邻近碱基的突变(mutation)、缺失(deletion)、或插入(insertion)。
该技术的原理如右图所示。
首先以甲基化的质粒DNA 为模板，使用人工合成含有目的突变碱基的引物进行扩增反应，然后用DpnI 限制性内切酶消化不含突变的质粒模板，再进行转化和筛选。
本试剂盒采用保真性能和扩增效率俱佳的StarMut XL Enzyme ，能够快速扩增15 kb 以下的质粒DNA (15~30 sec/1 kb)，最大限度地保持扩增质粒的保真性，大大缩短反应时间，是StarMut Site-directed Mutagenesis Kit (货号T111-01)的升级产品。
该方法操作简单快捷，突变阳性率高，对引物设计的要求相对宽松、灵活。
严格按说明书操作，6个以下连续碱基的突变率可达90%以上，最多可实现21个连续碱基的插入或删除。
对于非甲基化的质粒(例如从大肠杆菌JM110或SCS110菌株中提取的
质粒)，可通过转化dam ＋
的大肠杆菌菌株(如DH5α、TOP10、JM109、XL1-Blue 等)，再抽提获得甲基化的质粒作为PCR 反应模板。
本试剂盒提供一个 4.5 kb 、含有突变的lacZ 基因的对照质粒(Control Plasmid)。
质粒转化大肠杆菌后在含Amp 、IPTG 和X-gal 的琼脂平板上呈白色菌落；采用试剂盒提供的Control Primers 成功进行突变反应后，菌落呈现蓝色，可据此检测突变效率。
【产品组分】
*
使用前请先短暂离心；¶
使用前请完全解冻并充分混匀
【保存条件】
−20℃保存，有效期一年。
【操作步骤】
1．引物设计原则：
(1) 正、反向突变引物各一条，长度约25~45个碱基，分别包含带有突变点的互补区和3' 端延伸区(见下图)； (2) 突变点分别位于正、反向引物的互补区，互补区应包含至少15个碱基； (3) 引物突变点的3' 端应包含10~15个与质粒模板互补的碱基；
(4) 引物的3'端应包含至少一个G 或C 碱基，尽量避免三个以上的重复碱基，以免错配； (5) 尽量将引物的GC 含量控制在40~60％；
(6) 请使用经过PAGE 或HPLC 纯化的引物，否则会降低突变阳性率。
引物设计举例：
互补区 延伸区 互补区 延伸区
Forward Primer ： 5'-GATTACGCCAAGCT T CTAAATTAACCG-3' 5'-CCAAGCT T CTAAATTAACCGTG-3'
Reverse Primer ： 3'-GATACTGGTACTAATGCGGTTCGA A G-5' 3'-CTAATGCGGTTCGA A GATTTAATTG-5'
延伸区 互补区 延伸区 互补区
StarMut XL Enzyme *
8 μl 5 x StarMut XL Reaction Buffer ¶
100 μl High-GC Additive *
30 μl dNTPs * 25 μl Dpn I (10 U/μl)*
12 μl Control Plasmid (5 ng/μl)* 10 μl Control Primers (10 μM of each)* 10 μl ddH 2O
1 ml
图1. StarMut 超长基因定点突变试剂盒原理和操作流程示意图
或
PCR 合成突变链
Dpn I 消化掉含有甲基化的DNA 质粒模板
转化至高效感受态细胞中
CH 3
CH 3
3CH 3 CH 3
CH 3
CH 3 CH 3
2．定点突变反应：
(1) PCR反应体系：
向PCR薄壁管中依次加入下列试剂
Template Plasmid (5~10 ng/μl) 1 μl
5 x StarMut XL Reaction Buffer 5 μl
Primer Mixture (10 μM of each) 1 μl
dNTPs 2 μl
ddH2O 补足体积至24.5 μl
对于GC含量偏高的质粒模板，可向反应体系中添加1.5 μl High-
GC Additive。
(2) 混匀后加入 0.5 μl StarMut XL Enzyme，混匀，短暂离
心后放入PCR仪。
(3) PCR循环参数的设置：
95℃* 1 min
95℃*30 sec
55~60℃30 sec 12~25 cycles¶72℃15~30 sec/1 kb
72℃5~10 min
*对于难以扩增的高GC含量质粒，必要时可将变性温度升至98℃¶ 12 cycles: 单个碱基突变
16 cycles: 单个氨基酸 (三个连续碱基) 的突变
≥18 cycles: 多个氨基酸 (三个以上连续碱基) 的插入或删除
3．待反应完成，冷却至室温以下后，加入1 μl Dpn I，混匀后短暂离心，37℃温育1小时以上(可反应过夜)。
Dpn I消化完毕后可以直接用于转化，或于-20℃保存备用。
4．转化、培养：
(1) 将感受态细胞置于冰上融解；如需分装，请使用4℃预冷的0.5 ml或1.5 ml离心管；
(2) 取2~5 μl Dpn I消化过的PCR反应液加入至50~100 μl感受态细胞中，混匀，冰中放置10~30分钟；
(3) 42℃加热45~60秒后，冰中放置2分钟；
(4) 加入800 μl SOC或LB培养基，37℃振荡培养约40分钟；
(5) 将转化后的菌液离心浓缩后，均匀涂布到一块含有适当抗生素的LB琼脂平板上，37℃温箱倒置培养过夜。
对照点突变反应产物应使用可用于蓝白斑筛选的菌株，如DH5α、JM109、TOP10、XL1-blue等，进行转化，并使用含100 μg/ml氨苄青霉素 (Amp) 、IPTG 和X-gal的LB琼脂平板培养。
5．鉴定：
(1) 以18个循环的定点突变反应为例(循环数增加，克隆数量相应增加，但可能增加非预期突变率)，使用转化效率在108
cfu/μg DNA的感受态细胞通常可得到数十个克隆。
(2) 根据突变序列的长度，取3~5个单个菌落进行测序，以确认得到的克隆是否含有预期的突变序列。
对于插入限制性内切
酶位点的突变菌落，可直接挑选5~10个单克隆菌落培养，提取质粒进行酶切鉴定。
(3) 对照点突变反应可根据下列公式计算突变率，以判断试剂盒中的组分是否失效：突变百分率=蓝斑数÷菌落总数x 100%
【点突变常见问题分析】
问题可能原因解决方法
没有或极少量菌落转化失败
使用转化效率高于 108 cfu/μg DNA的感受态细胞
取10 μl PCR 产物用1%的琼脂糖凝胶电泳检测(EB或其他高灵敏度方法染色)，即使有其他杂带，
只要可见一条大小与线形状态下的模板质粒相同的条带，则提示有目标质粒，可重新取2~5 μl DpnI
消化后的PCR 产物进行转化
如果使用了矿物油，应尽量使用尖、细的枪头，伸入到矿物油下方吸取反应液
PCR反应失败
如电泳检测未见目的条带，则表示PCR产量不足，应重新设置反应，并适当增加循环次数；建议设
立对照反应
使用高纯度的质粒DNA作为模板，电泳检测质粒完整性和浓度
可将95℃预变性时间延长为2 min，退火时间延长至50~60 sec
抗生素用错或浓度过高使用适当浓度的抗生素琼脂糖平板
突变阳性率过低Dpn I消化效果不佳加入Dpn I后应混匀并短暂离心；适当延长消化时间模板质粒用量过多建议使用1~10 ng模板
引物降解失效适量分装，-20℃保存，避免反复冻融
突变位点与预期不符引物设计不理想重新设计引物；提高退火温度
合成的引物质量较差或纯度不
够
仅通过脱盐处理的引物突变效率偏低；请选择可信赖的引物供应商，使用PAGE或HPLC纯化级别
的引物
菌落过多Dpn I消化不完全加入Dpn I后应混匀并短暂离心；适当延长消化时间未加抗生素或抗生素浓度过低使用适当浓度的抗生素琼脂糖平板
【备注】
本产品仅供科研使用。
在确认产品质量出现问题时，本公司承诺为客户免费更换等量的质量合格产品。
在所有情况下，本公司对此产品所承担的责任仅限于此产品的价值本身。
