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细胞培养常见污染的判别及应对措施2011-01-02 10:19:04| 分类：实验| 标签：污染无菌细胞培养基灭菌|字号大中小订阅一、避免细胞培养污染的措施：污染是细胞培养中一个大敌，一旦污染，前功尽弃！决定要进行细胞培养，首先一定要有强烈的无菌意识！操作中要遵守严格的操作规程，不要怕麻烦，越细心越好！注意以下几点，大部份的污染是可以避免的：1. 每次开始实验前，先用紫外照无菌台和实验室20分，用酒精擦手，台面和不消毒的器械（如移液枪等）；实验中，如允许，尽量多过火，开起或盖盖都靠近火焰或在无菌台深处；使用无菌台后，再用酒精擦台面，紫外照20分！2. 滴管不要接触瓶口，吸取废液及加入新鲜培养基时都要注意不要滴在瓶口上等等。
3. 凡是接触瓶口后都要用酒精灯烧烧。
4. 提取组织时，往往头会距离组织很近，所以带口罩很重要！还要换无菌衣（紫外照过的白大褂）。
5. 注意配制完全培养基时不要发生污染，在使用前一定要做无菌培养，因为一般应用污染后的培养基培养细胞后，很快就会发生特别严重的污染。
6. 操作时一定按照实验室的要求，切忌粗心大意。
7. 使用完的东西尽快移出无菌台！另外无菌台上的器械，试剂摆放，也尽量遵循一定的顺序！依污染可能程度依次向外摆。
二、常见的细胞培养污染：下面是几种细胞培养过程中常见的污染：1. 支原体污染：传说中的黑焦虫，长得暴快。
24小时就满视野都是了。
污染源大多数情况下是培养用血清。
图1 支原体污染的光镜检测（圆圈所示，×10倍）图2 支原体污染的光镜检测（×20倍）图3 支原体污染的荧光检测图4 支原体污染的电镜检测（×30k，煎蛋状和其他形状）图5 支原体污染的电镜检测2. 念珠菌污染：似乎无处不在，而且顽固得很。
长得暴快（12h就能在细胞上面密布）。
培养液澄清。
低倍显微镜下像黑色的沙子铺在细胞上，高倍镜下呈树枝状或葡萄状。
图6 念珠菌污染的光镜检测（低倍镜）图7 念珠菌污染的光镜检测（高倍镜）图8 念珠菌污染的光镜检测（高倍镜）图9 念珠菌污染的检测（革兰氏染色阳性）这么大面积的污染，你可以看看是不是操作上出了问题，要不然就是培养基的问题。
细胞培养常见问题的原因及其解决的办法：问题1培养液pH值变化太快可能原因(1)CO2张力不对(2)培养瓶盖拧得太紧(3)NaHCO3缓冲系统缓冲力不足(4)培养液中盐浓度不正确(5)细菌、酵母或真菌污染建议解决方法(1)按培养液中NaHCO3浓度增加或减少培养箱内CO2浓度，2.0g/L到3.7g/L浓度NaHCO3对应CO2浓度为5%到10%。
(2)松开瓶盖1/4圈。
(3)改用不依赖CO2培养液。
加HEPES缓冲液至10到25mM终浓度。
(4)在CO2培养环境中改用基于Earle′s盐配制的培养液，在大气培养环境中培养改用Hanks盐配制的培养液。
(5)丢弃培养物，或用抗生素除菌。
问题2：培养液出现沉淀，但pH值不变可能原因(1)洗涤剂清洗后残留有磷酸盐，将培养基成分沉淀下来(2)冰冻保存培养液建议解决方法(1)用去离子水反复冲洗玻璃器皿，然后灭菌。
(2)将培养液加热到37℃，摇动使其溶解如沉淀仍然存在，丢弃培养液。
问题3：培养液出现沉淀，同时pH发生变化可能原因细菌或真菌污染建议解决方法丢弃培养物，或用抗生素除菌。
问题4：培养细胞不贴壁可能原因(1)胰蛋白酶消化过度(2)支原体污染(3)培养瓶瓶底不干净(4)培养液pH值过碱(NaHCO3分解)(5)消化液或培养液配制错误、过期储存、储存不细胞老化(如传代前细胞已汇合导致失去贴附性)(7)接种细胞起始浓度太低或太高建议解决方法(1)缩短胰蛋白酶消化时间或降低胰蛋白酶浓度。
(2)分离培养物，检测支原体。
清洁支架和培养箱。
如发现支原体污染，丢弃培养物。
(3)注意刷洗，或换用一次性塑料培养瓶(4)使用无菌醋酸溶液调整pH值或充入无菌CO2(将培养液敞口放入培养箱也可)(5)重新配置消化液或培养液启用新的保种细胞(7)调节最佳接种细胞浓度问题5：悬浮细胞成簇可能原因(1)培养液中含钙、镁离子(2)支原体污染(3)蛋白酶过度消化使得细胞裂解释(4)DNA污染建议解决方法(1)用无钙镁平衡盐溶液洗涤细胞，轻轻吹吸细胞获得单细胞悬液。
如何预防细胞培养污染问题细胞培养是生物学和医学研究中常用的一种技术方法，但细胞培养过程中常常会面临细胞污染问题。
细胞培养污染会严重影响实验结果的准确性，因此需要采取一系列措施来预防细胞培养污染。
本文将介绍几种常见的细胞培养污染问题以及预防措施。
1. 细菌污染细菌污染是细胞培养中最常见的问题之一。
来自操作人员、试剂、培养器具和工作环境等多方面的细菌污染都可能导致细胞培养中的细菌污染。
预防措施：•穿戴合适的实验服和手套，并进行消毒处理，减少操作人员带入的细菌污染。
•使用无菌、高质量的试剂，并在实验中进行常规无菌操作，保持培养器具的无菌状态。
•经常对实验室进行清洁和消毒，保持工作环境的无菌。
2. 真菌污染真菌污染是细胞培养中另一个常见的问题。
真菌往往来自环境中的空气、试剂、培养器具或操作人员。
真菌污染会导致细胞生长异常，细胞死亡或实验结果异常。
预防措施：•定期消毒工作环境，特别是操作台和培养箱，避免真菌的滋生。
•使用高质量的培养基和抗生素，抑制真菌的生长。
•采取无菌技术操作，减少操作人员带入的真菌污染。
•定期更换培养器具，特别是培养瓶和培养皿，避免真菌滋生。
3. Mycoplasma 污染Mycoplasma 污染是细胞培养中常见但容易被忽视的问题。
Mycoplasma 是一类细小的细菌样微生物，常常会导致细胞株的污染。
Mycoplasma 污染会影响细胞生长、代谢以及实验结果的可靠性。
预防措施：•定期检测细胞株的 Mycoplasma 污染情况，可以使用 PCR 或流式细胞术等方法进行检测。
•新购买的细胞株进行隔离培养，并进行 Mycoplasma 检测，确保细胞株的无菌性。
•严格控制培养器具、培养基和操作人员的无菌操作，减少Mycoplasma 污染的可能性。
•定期更换培养基并添加抗生素，可以抑制 Mycoplasma 的生长。
4. 交叉污染交叉污染是指在细胞培养过程中，不同细胞株之间发生的细胞混合现象。
细胞培养中的常见问题解决方法细胞培养是生物医学研究和药物开发中不可或缺的重要工具。
然而，细胞培养过程中常常会遇到一些问题，例如污染、细胞凋亡、不适当的生长条件等。
本文将介绍细胞培养中的一些常见问题以及相应的解决方法。
1. 细胞污染细胞污染是细胞培养中最常见的问题之一。
它可能是由细菌、真菌、酵母、病毒等微生物引起的。
污染会导致细胞生长受阻、实验结果的不可靠以及其他严重后果。
为了解决这个问题，可以采取以下几种方法：- 严格按照无菌操作操作培养细胞。
使用无菌操作条件，包括在无菌环境下穿戴手套、使用消毒液清洗操作台面和器具、对培养皿和培养物进行灭菌处理等。
- 经常检查细胞培养物的外观。
细胞培养物应呈现透明、均匀的状态。
如果有任何可疑的异常，请及时进行检查和处理。
- 使用含有抗生素的培养基。
对于某些细胞株来说，添加适量的抗生素可以阻止细菌等污染物的生长。
2. 细胞凋亡细胞凋亡是正常细胞生命周期的一个重要阶段，但在细胞培养过程中，过量的细胞凋亡会导致细胞数量的减少，对实验结果造成不利影响。
以下是一些常见的细胞凋亡问题及其解决方法：- 减少细胞培养的过度处理。
频繁的细胞移植和传代会导致细胞凋亡增加。
适当延长传代周期，避免过多的细胞移植。
- 提供适当的细胞营养来源。
细胞需要足够的营养物质来维持正常的生长。
不合适的培养基组分或者浓度可能会导致细胞凋亡。
确保培养基中的营养物质符合细胞的需求，并根据细胞株的特点进行相应的调整。
- 坚持细胞培养的无菌操作。
如前所述，细菌或其他微生物的污染会导致细胞凋亡的增加。
通过无菌操作避免细胞污染，继而减少细胞凋亡。
3. pH值失调培养基的pH值是细胞培养中一个重要的生长条件。
pH值的不稳定性会影响细胞的代谢和生长。
以下是一些解决pH值失调的建议：- 定期检测和调整培养基的pH值。
使用pH计或试纸进行测定，及时调整pH值，保持在适宜的范围内。
- 确保培养基的配制正确。
细胞培养基的配制过程中，需要严格按照配方中所指定的浓度和比例添加各种成分。
如何正确判别细胞培养中的细菌与真菌污染在进行细胞培养实验的过程中，细菌与真菌污染是一个常见但也十分令人头疼的问题。
当我们在观察和分析细胞时，准确判断细胞培养中的细菌与真菌污染是至关重要的。
本文将从不同的角度探讨如何正确判断细胞培养中的细菌与真菌污染。
一、观察细胞形态观察细胞形态是判断细胞培养中是否存在细菌与真菌污染的一种重要方式。
细菌和真菌的形态和生长方式有很大的差异。
细菌在培养皿中呈现为小圆点状或线状的结构，而真菌则可能形成大而明显的菌落或菌丝。
此外，真菌会产生孢子，看起来像是一串串小颗粒。
通过观察细胞周围的结构，可以初步判断是否存在细菌与真菌污染。
二、检测培养基上的生长情况细胞培养中的细菌与真菌污染通常会导致培养基上的生长情况发生变化。
如果培养基上有细菌或真菌的存在，通常可以观察到菌落的形成。
在培养过程中，我们可以观察细胞生长的速度、密度和均匀性等指标，如果存在污染，这些指标可能会出现异常情况。
在评估培养基上的生长情况时，需要结合细胞培养的实际要求进行综合判断。
三、使用染色试剂染色试剂在细胞培养中的细菌与真菌污染判别中发挥着至关重要的作用。
常用的染色试剂有格拉姆染色和甲苯胺蓝染色等。
通过染色试剂的使用，细菌和真菌会呈现不同的颜色和形态。
细菌会呈现出紫色或蓝色，而真菌则通常呈现为绿色或红色。
通过对样品进行染色和观察，可以明确判断是否存在细菌与真菌污染。
四、利用PCR技术PCR技术是一种高灵敏度和高特异性的基因检测技术，可以用于检测和鉴定细菌和真菌。
通过PCR技术，可以对细胞培养样品中的DNA进行扩增和分析，从而确定是否存在细菌与真菌污染。
PCR技术可以选择合适的引物，针对不同的细菌和真菌进行特异性扩增，提高判断污染的准确性。
五、更加严格的无菌操作在细胞培养实验中，更加严格的无菌操作是避免细菌与真菌污染的关键。
在实验过程中，我们应该始终保持实验室台面、培养皿、试管等工作区域的清洁。
在进行细胞培养前，用酒精或其他消毒液对操作台面进行清洁和消毒，避免细菌的传播。
最近看到不少问有关细胞培养污染的事，正好我看到了一个有关这方面的总结，很全很好很强大，跟大家分享下细胞培养中常见的污染情况总结如下:常见的污染如下：1、细菌：细菌在普通倒置显微镜下为黑色细沙状，根据感染细菌的不同，可有不同的外形，培养液一般会浑浊变黄，对细胞生长影响明显。
仔细检查一下器皿的灭菌情况，是否在高压灭菌时放气时间足够，压力足够！尤其是和储存培养液接触的移液管等物品，连续两次污染的话有可能造成储存液污染，一定要注意！下次使用前检查一下培养液是否存在浑浊的现象！可在培养液中加相应的抗生素处理2、霉菌：培养液是清亮的，倒置显微镜下无杂质，37度孵箱培养2-3天，仍清亮，但出现絮状杂质，镜下可见呈细丝状的团状漂浮物，可看到明显的菌丝，细胞仍可生长，但时间长之后，细胞的活力状态变差，用硫酸铜溶液擦拭CO2孵箱内，再把水盘里也加上饱和量的硫酸铜。
或者在培养箱的托盘加入饱和的消毒磷酸氢二钠高盐液体,可以防止霉菌污染。
CO2孵箱被霉菌污染后，可把所有细胞暂时转移，采用过氧乙酸擦洗孵箱（包括隔板，箱壁）。
并把过氧乙酸放置在孵箱内一个小时，使其蒸汽弥漫。
待过氧乙酸的气味消散后，再移入细胞。
孵箱应定期清洁（2月左右），尤其在多雨的季节。
其它培养箱清洗方法是：用84液擦洗－清水擦洗－75%酒精擦洗－紫外灯照。
预防霉菌污染，可在培养基里加3u/ml的两性霉素或制霉菌素或放线菌素D或双抗；但细胞一旦污染，很难挽救，制霉菌素或放线菌素D或双抗都于事无补，建议舍弃该污染细胞。
，将环境彻底消毒，如果所有细胞都污染，可能是系统污染，检查一下培养基和器材，如果只是个别污染，可能是操作问题，就要注意操作3、支原体：黑色的，好象多为多形，培养液一般会浑浊，原体感染，国内血清很多都没有做支原体阴性检测，而支原体是牛血清中最常见的微生物之一。
而且它不能用过滤的办法除去。
支原体感染细胞以后，细胞病变不很明显，只是慢慢死去。
用泰乐菌素，兽用支原体病的药，但可用于细胞培养，无任何不良反应。
【干细胞细菌内毒素超标的可能原因】干细胞技术作为一项备受关注的生物医学领域，近年来取得了巨大的发展成就。
干细胞的应用范围越来越广泛，然而，在干细胞的应用过程中，细菌内毒素超标的情况时有发生，给干细胞研究和应用带来了很大的困扰。
那么，干细胞细菌内毒素超标的可能原因是什么呢？1. 操作不当导致的细菌污染在实验室中进行干细胞培养和扩增的过程中，如果操作不当，比如无菌操作规范不严、培养条件不合理等，就会导致细菌的污染，从而引发内毒素超标的问题。
实验室环境的卫生状况和操作人员的培训水平也会直接影响细菌污染的情况。
2. 原料污染在干细胞培养的原料中，比如培养基、添加剂等，如果存在细菌污染或本身就含有内毒素，就会成为细菌内毒素超标的潜在原因。
制备和储存这些原料的条件如果不合理也会导致原料污染，进而影响干细胞培养的质量。
3. 干细胞自身特性干细胞作为一种特殊的细胞类型，其生长特性和分化能力决定了在培养的过程中容易受到细菌内毒素的影响。
一些细胞培养过程中的压力条件、营养物质供应等因素也会影响干细胞对内毒素的敏感性，从而导致内毒素超标的情况。
4. 实验设备不合格实验室中的培养设备、检测设备如果不符合规范要求，就会影响到细菌内毒素的检测和控制。
不合格的设备可能会导致细菌内毒素超标的情况发生，带来一定的安全隐患。
总结回顾：在干细胞研究和应用过程中，细菌内毒素超标的问题一直是一个备受关注的难题。
要解决这一问题，就需要从操作规范、原料质量、细胞特性和设备条件等多个方面进行全面评估和控制。
只有加强对这些可能原因的监测和管理，才能更好地提高干细胞培养的质量和安全性。
个人观点：在解决干细胞细菌内毒素超标问题的过程中，需要加强实验室规范管理、培训操作人员、完善原料质量监控和优化培养条件等方面的工作。
加强相关法规的制定和执行力度，也是非常重要的。
这样才能更好地保障干细胞研究和应用的安全和可持续发展。
结语：干细胞细菌内毒素超标问题是一个复杂而严峻的挑战，需要科研人员共同努力，不断提高技术水平和安全意识，才能更好地推动干细胞研究和应用的进步。
听说你的细胞被污染了？导语学会正确地进⾏细胞培养是细胞实验的基础，然⽽⼩⼼翼翼的你，怎奈何体外细胞的脆弱，百密终有⼀疏。
你偶然的⼀个喷嚏，不经意得捋捋你的头发丝，对于这些丢失体外抵抗能⼒的细胞都可能是毁灭性的灾害。
但是，并⾮所有的细胞污染都是致命的，若是及时发现，还是可以得到挽救的。
今天咱们的主题就是：教⼤家辨别各种细胞污染及如何应对。
如下图：实验室常见的细胞污染，你都知道属于哪种污染吗？细胞培养中的常见污染主要包括：细菌、霉菌、⽀原体、⿊胶⾍、病毒和交叉污染等，每⼀种污染都有各⾃的特点。
如细菌和霉菌增殖迅速，短时间就对细胞造成明显伤害；⽽⽀原体和病毒对细胞的影响则是⼀种缓慢长期的过程。
下⾯就具体看看每⼀种污染。
1. 细菌污染（较容易被发现）引起原因：操作不规范或⽆菌措施不到位等；细菌污染种类：⽩⾊葡萄球菌，⼤肠杆菌，假单孢菌、枯草杆菌等；细胞污染后的变化：①污染后由于有⼤量酸性物质产⽣，因此培养基会短时间内由红⾊变为黄⾊；②由于细菌⼤量增殖，培养基变浑浊，稍微振荡后可见培养基表⾯有漂浮物；③普通倒置显微镜⾼倍镜观察，胞浆内可见⼤量颗粒（如下图红⾊箭头）；④细胞⽣长缓慢，逐渐变圆脱落。
如下图所⽰：左：悬浮细胞污染后，可见悬浮细胞个体远⼤于杆状细菌，⽽细菌呈⿊⾊颗粒状并会有较快的运动速度；右：贴壁细胞，可看到球状细菌分布于细胞周围并做剧烈运动。
细菌污染的细胞（左悬浮细胞，右贴壁细胞）图⽚来源：UNC School of Medicine处理措施：在培养液中添加双抗（P/S）处理；可⽤抗⽣素的常⽤量的5~10倍作冲击疗法，⽤药24~48h后再换常规培养液；另外添加西司他丁钠和亚胺培南（泰能）处理细胞，适⽤于培养⽤具被打翻、使⽤了污染的培养液或要培养污染的组织或者冻存细胞的污染情况[1]。
裸⿏体内接种法是⽐较有效和彻底的除菌⽅法。
主要包括腹⽔接种和⽪下荷瘤分离细胞。
既能彻底清除污染细菌，⼜能保持肿瘤细胞的来源特征和恶性特性。
常见细胞污染及其处理方法麦~粒（2012级生物化学与分子生物学专业）摘要：细胞培养是生命科学实验及生物医药产业化中的一项关键技术，细胞污染问题一直是细胞培养中的大敌。
本文综述了细胞培养中污染的类型、处理方法和预防措施等，以期为实验室细胞培养中遇到的细胞污染的解决提供参考。
关键词：细胞培养，细胞污染，支原体污染细胞培养技术是现代生命科学研究中不可缺少的一项基本实验技术，同时也是细胞工程中的核心技术之一。
细胞培养的质量好坏直接关系到实验结果的可靠性与否以及产品质量的合格与否。
在细胞培养中，最基本的原则就是无菌操作，污染是细胞培养最致命的大敌，预防和避免污染是细胞培养成功的关键之一。
特别是对于一些珍贵的细胞株，一旦污染对实验可能就是毁灭性的。
1 污染的类型细胞污染的类型可分为物理、化学、生物三类。
其中化学、生物因素最为常见，物理因素最易被忽视。
1.1物理污染物理性污染通过影响细胞培养体系中的组分，从而影响了细胞的代谢。
最为常见的是温度和辐射（紫外线照射）。
过冷或过热的温度对细胞可引起细胞生理状态的改变，如从冰箱中取出的培养液直接加至37℃培养的细胞中可能会造成细胞应激，影响某些实验现象的观察。
在生物安全柜紫外灭菌时，应当遮蔽对紫外线敏感的试剂，同时普通操作中也要注意对见光易分解的物质进行避光处理。
对于需要使用同位素标记的某些实验，应当注意细胞、试剂周围不能放同位素。
除此之外，有时操作过程中偶尔有异物落入，极易造成污染。
一些小的颗粒状异物作为是微生物污染的载体进入培养液中造成细胞污染。
另外，实验过程中酒精棉球的棉絮、移液器枪头上的某些塑料碎屑等都有可能增加染菌的概率。
1.2化学污染细胞培养中的化学污染大多是由于实验准备或实验过程中造作不当造成的。
在实验准备阶段，细胞培养室中的器皿应做到专用，避免与常用器皿混用。
此外，细胞用器皿洗刷过程中要注意洗刷彻底，不可有洗涤剂等残留。
高压灭菌时应灭菌彻底，并在灭菌后的生物安全柜中打开使用。
培育技术中常见的细胞污染处理方法细胞污染是培育技术过程中一个常见而严重的问题。
细胞污染指的是外源性的微生物、真菌、细菌或其他细胞种类在细胞培养中的存在。
细胞污染会对实验结果产生不可预测的影响，甚至使实验失效。
因此，对于细胞污染的处理方法和预防措施的研究非常重要。
本文将介绍一些在细胞培养中常见的细胞污染处理方法。
一、消毒剂处理消毒剂处理是最常见的细胞污染处理方法之一。
消毒剂可以有效杀灭微生物和其他细胞种类，以减少污染。
常见的消毒剂有乙醇、过氧化氢和氯化物等。
在使用消毒剂处理细胞污染时，应选择适当的浓度和处理时间，并确保消毒剂不会对目标细胞产生不良影响。
二、培养基更换培养基更换是另一种常见的细胞污染处理方法。
培养基中添加抗生素可以有效抑制污染微生物的生长。
常用的抗生素包括青霉素、链霉素和庆大霉素等。
更换含有抗生素的培养基可以杀灭或抑制细菌和真菌等微生物的生长，从而有效处理细胞污染。
三、细胞分离细胞分离是一种通过分离感染的细胞来处理细胞污染的方法。
这可以通过细胞离心、细胞分选或免疫磁珠分离等技术来实现。
通过分离感染的细胞，可以有效减少细胞污染，同时保留无污染的细胞进行后续实验。
四、细胞冻存细胞冻存是另一种有效处理细胞污染的方法。
将无污染的细胞分装入液氮等低温环境中冻存，可以有效抑制细菌、真菌和其他细胞种类的生长。
在需要时，可以从冻存样品中恢复细胞，以继续实验。
然而，细胞冻存也存在一定的风险，如细胞冻存过程中可能引起的细胞损伤等问题需要注意。
五、污染原因的分析和改进污染原因的分析和改进是细胞污染处理的重要环节。
通过分析细胞污染的原因，可以采取相应的改进措施来预防细胞污染的再次发生。
污染原因的分析可以包括对实验设备、试剂和操作流程等的检查和评估。
通过对可能存在的问题进行改进，可以有效提高细胞培养的纯度和可靠性。
细胞污染是培育技术中一个常见且严重的问题。
为了有效处理细胞污染，研究并应用适当的处理方法和预防措施是非常重要的。
细胞培养常见污染的判别及应对措施2011-01-02 10:19:04| 分类：实验 | 标签：污染无菌细胞培养基灭菌|字号大中小订阅一、避免细胞培养污染的措施：污染是细胞培养中一个大敌，一旦污染，前功尽弃！决定要进行细胞培养，首先一定要有强烈的无菌意识！操作中要遵守严格的操作规程，不要怕麻烦，越细心越好！注意以下几点，大部份的污染是可以避免的：1. 每次开始实验前，先用紫外照无菌台和实验室20分，用酒精擦手，台面和不消毒的器械（如移液枪等）；实验中，如允许，尽量多过火，开起或盖盖都靠近火焰或在无菌台深处；使用无菌台后，再用酒精擦台面，紫外照20分！2. 滴管不要接触瓶口，吸取废液及加入新鲜培养基时都要注意不要滴在瓶口上等等。
3. 凡是接触瓶口后都要用酒精灯烧烧。
4. 提取组织时，往往头会距离组织很近，所以带口罩很重要！还要换无菌衣（紫外照过的白大褂）。
5. 注意配制完全培养基时不要发生污染，在使用前一定要做无菌培养，因为一般应用污染后的培养基培养细胞后，很快就会发生特别严重的污染。
6. 操作时一定按照实验室的要求，切忌粗心大意。
7. 使用完的东西尽快移出无菌台！另外无菌台上的器械，试剂摆放，也尽量遵循一定的顺序！依污染可能程度依次向外摆。
二、常见的细胞培养污染：下面是几种细胞培养过程中常见的污染：1. 支原体污染：传说中的黑焦虫，长得暴快。
24小时就满视野都是了。
污染源大多数情况下是培养用血清。
图1 支原体污染的光镜检测（圆圈所示，×10倍）图2 支原体污染的光镜检测（×20倍）图3 支原体污染的荧光检测图4 支原体污染的电镜检测（×30k，煎蛋状和其他形状）图5 支原体污染的电镜检测2. 念珠菌污染：似乎无处不在，而且顽固得很。
长得暴快（12h就能在细胞上面密布）。
培养液澄清。
低倍显微镜下像黑色的沙子铺在细胞上，高倍镜下呈树枝状或葡萄状。
图6 念珠菌污染的光镜检测（低倍镜）图7 念珠菌污染的光镜检测（高倍镜）图8 念珠菌污染的光镜检测（高倍镜）图9 念珠菌污染的检测（革兰氏染色阳性）这么大面积的污染，你可以看看是不是操作上出了问题，要不然就是培养基的问题。
既然已经污染了，就全部更换你的器皿。
培养箱的水没有必要用无菌水，但最起码要是蒸馏水。
3.霉菌污染比较常见的一种污染，常常来源于污染的空气、水和器械。
图10 霉菌污染的光镜检测（低倍）图11 霉菌污染的光镜检测（典型的霉菌污染，肉眼看到白色的团块或白点，镜下呈丝状。
400倍）图12 霉菌污染的光镜检测（树枝状，高倍）图13 霉菌污染的倒置显微镜检测（树枝状）4. 杆菌污染：培养基中加入抗生素可以减少此种污染，但也不是绝对的。
图14 杆菌污染的光镜检测（瑞氏染色，高倍）图15 杆菌污染的光镜检测（瑞氏染色，低倍）细胞中的颗粒到底是怎么回事？我的细胞总有颗粒，开始是细胞中有，后来细胞之间也好像有许多颗粒。
好像是细胞碎片一样。
是什么东西啊？是支原体污染吗？这可是我刚买回来的细胞啊!我们实验室也有这种情况，是不是黑的小碎片，有人说是细胞代谢产物，后来拿到高倍镜下看还会动，就怀疑是污染了，也想问问大家到底是什么是黑色的小碎片。
我没注意到它会动，只是觉得不像是活的微生物。
我觉得是由于某种污染或外界因素导致的细胞状态变差，裂解出的东西。
但是，是什么东西不清楚。
的确很常见在以前帖子见到说是“黑焦虫”。
长时间培养的很容易出现，我根据自己的经验估计是一种污染，因为随着黑点增多，本来生长旺盛的细胞逐渐停滞甚至死亡。
而且我后来原代培养的几批细胞并没有发现，我怀疑有好多细胞系本身就是污染的。
不过增加换液次数的情况下，好象一般不太娇气的细胞生长不是很受影响。
以前听很有经验的老师说黑焦虫是国产血清的问题，可以有条件换进口血清试试，或者离心一下也可能能解决问题。
那么所谓的“黑焦虫”到底是什么东西啊？有谁知道？我培养的细胞也出现过此中问题，放到高倍镜下看时有东西在动，但培养液不混浊，估计不是细菌污染，可能是血清问题，是支原体污染。
我培养的细胞也出现过这样的问题，我个人认为是一种支原体污染。
国产血清是罪魁祸首，因为只要将细胞饥饿一下，不超过24小时，这种东西就会疯长我培养的细胞也有出现这中情况。
但是并不影响细胞生长。
应该不是支原体污染最近，我复苏细胞细胞的时候也发现过这样的东西，尽管我用的是GIBCO的FBS，后来，每天换液之前洗几遍后，就慢慢变少，现在没了细胞培养的细菌污染我们新建的细胞室。
每周都会做清洁，用0。
2%新洁尔灭消毒，照紫外。
实验前也会照至少30分钟。
培养基中加青霉素，链霉素。
可是培养细胞时还是常有细菌污染，有时甚至分析不出原因。
用培养瓶还好一点，用多孔板或平皿就更凄惨。
我养的是哺乳动物细胞，不知各位有什么好的方法避免污染！谢谢！很可能是超净台无效了，，或者培养基？其实严格操作箱污染都难我们是新的超净台，不可能失效。
而且用同一瓶培养基，一瓶传两瓶，原始的一瓶污染，新传的很好。
所以我分析不出原因呀那么假如把原始的那瓶换新瓶养可以么？都污染了，我仍还来不及，那还敢换新瓶染菌有很多原因，因为整个细胞操作过程均要求无菌，所以看看操作是否规范，例如戴手套等。
多半是环境因素，做点平板，操作时放在几个地方，培养后看看长菌情况。
消毒用新洁尔灭好象不是太有用。
人是最大的污染源，不知你做好手部的消毒工作以及戴口罩没有，其实，只要你操作的好，严格在靠近火的附近操作，污染的几率是很小的。
从你的描述中可以看出培养基应该没有问题，新的一瓶很好，老的一瓶污染，只有操作不当引起的，还需要加强练手。
求助！关于细胞培养中的真菌污染！感激！先谢谢大家的帮助！现在细胞培养基里出现了很多白色和黑色的小点，有好长的时间了！细胞的形态看起来不太好，但是有些细胞也长的很好，如成纤维细胞，但是内皮细胞就差很多！加大量的抗生素没有效果！不知道是不是真菌污染，怎么鉴别！因为培养了很长时间都没有出现真菌的菌丝，所以不能肯定是真菌！那些白色的小圆点有点象白色链球菌或链珠菌，但是不能确定！怎么样才能判断确定，改用什么办法解决！谢谢大家的帮助！杀灭真菌听说用两性霉素，但从没试过。
真菌污染是件很麻烦的事，可能重新复苏细胞是最好的办法。
同时该注意如何防止污染。
我觉得如果是真菌污染，培养基会浑浊，是肉眼可见的浑浊。
在这种情况下最好赶紧将该瓶细胞扔掉，免得引起培养箱中的大规摸污染。
在显微镜下，真菌是成念珠状的，这时细胞界限不清。
这可能是不规范操作引起的，安全起见还是将细胞室全面打扫一下，用新洁尔灭擦，紫外照！谢谢大家的帮助，因为实验室以前从来就没有这样的污染，所以大家也没有经验！现在就是不能确定是不是污染。
我不可能把实验室所有的细胞都扔掉，因为有好多人都在一起养不同类型的细胞！现在确实是问题，培养基也没有浑浊，操作的时候已经十二分的小心了！我想问一下，你看到的那些白色或黑色的圆点是在低倍还是高倍显微镜下？若培养基不混浊，可能真的是细胞状态太差，没有贴壁还缩成球状。
难道你们实验室所有细胞都用一瓶培养基？只要将污染的扔掉就行，没必要都扔掉！两性霉素！sigma在华美有分装！但是浓度很小，关键还是环境问题！黑白圆点在100倍显微镜下有多大，是不是酵母菌小黑点和小白点是在200倍的显微镜下观察所见，大小可能是细胞核的1/5到1/4左右！细胞状态不好是因为跟以前培养的细胞来比较所得，细胞能贴壁，能生长，但是没有以前的那么快，而且形态看的也不好！另外问一下sleevexz，酵母菌是什么样的，怎么鉴别！还有一个问题就是，实验室用的双抗是从Gibco公司买过来的直接使用的液体，具体规格是100ml一瓶，Pelicillin-Streptomycin 一起，50倍的，要求储存在－20 C，但是有效期只到2002年9月，现在都已经差不多过期半年了，但是实验室的老师都说没有问题，可以用，现在大家就都是一直用这样的抗生素在！你们说会不会是抗生素的问题的！养细胞经常无缘无辜的染菌？烦烦烦！！！！我是一个新手，但已养细胞近半年，最近一段时间经常染菌，有时是培养基，有时连原因都找不到，在实验中我也非常小心，但结果总让我伤心。
现在都有点神经质了，请各位指点你这个问题说大不大，说小也不小。
说不大呢，七个字就可以回答你：严格按照无菌要求。
说不小呢，这无菌要求的话匣子一打开太大。
还是简要吧：1.将试验用品放入超净工作台用紫外线照射30分钟；2. 照射30分钟后，进入缓冲间，换灭菌的无菌衣，换专用拖鞋；3.手部用5％的洁尔灭浸泡2分钟，进入洁净区后，用75％的酒精棉球再次擦拭裸露的手部。
4.最好戴口罩；5.操作时尽量靠近火焰；6.装培养基的瓶子等不要直接口向上，用一个架子斜放，瓶口朝向火焰；7.标准操作，不要让无菌吸管到处碰来碰去；8.中途出入无菌室，再次操作时，一定要再次用75％的酒精棉球消毒。
一下也想不了那么多，具体的你再问吧。
最好把你怎么操作的过程描述一遍，我们就好针对性的指出错误了。
建议你把细胞室，好好清理一下，污染是这样的，出现一次就比较麻烦，千万别急。
还有，你们的紫外灯没有问题吧？非常感谢楼上的回信，在操作中我也严格按照无菌要求去做，因为操作台是公用的，而其它同学很少染菌，我想主要问题应在我身上，但是又找不到主要原因。
我一般是这样操作的：紫外照后，用酒精棉檫拭手部开始操作，基本步骤是吸培养液到方瓶，再在方瓶中吹打混合，按比例传代，有时吸管头部碰在培养瓶口，有时吸管口棉花塞的太紧或太松不好用，有时原因都找不到，请各位指点。
戴手套试试巴最好是涂片看看是什么菌？注意操作，吸管碰别处立即更换。
污染是常有的事，也不必太给自己压力，熟能生巧。
你的滴管吸管进培养液瓶和细胞培养瓶前要在酒精灯上仔细烤一下，滴管不要反复用。
其实无菌操作第一重要的就是你的超净台是不是还能用，滤网要及时清洗的。
其次就是瓶口、滴管、移液器操作是过火的是否正确。
还有一点很重要，手一定不能在任何瓶口上方经过！从你操作的步骤来看，你的细胞应该是很好操作的。
没看到你要用消化液，这就减少了污染的机会。
你用的吸管是自己做的吗？经常练练，熟能生巧，时间长了，你就知道如何控制所塞的棉花量了。
（用牙签或12号针头等工具来塞比较方便，塞完后用火将露出的部分烧掉再灭菌，这样就不会在上吸耳球的过程中，出现将棉花弄掉的情况），另外，你要勤剪指甲，不要戴首饰，吸管一周灭一次菌，不要没用完老用。
操作是导致污染的最主要原因根据本人的经验，操作是导致细菌污染的最主要原因。
本人以前曾经在一个相当严格的实验室工作过，那里的细胞室的要求是按照外科手术室要求的，更衣，换鞋，洗手，酒精擦手，戴口罩、帽子，所有培养液中加双抗，所有细胞操作器械专用；每天紫外灯照射40分钟后才允许进入。
