教你判断你的细胞是何种污染

支原体污染及其检测支原体污染在细胞培养中最为常见，培养体系中支原体污染的最可能途径是经已被支原体污染的细胞蔓延和传扬，据报道目前约有11％的二倍体细胞和传代细胞存在支原体污染；支原体污染的另一重要来源是培养液中加入了被支原体污染的血清。

支原体是一种介于细菌和病毒之间的能自立生活的微生物，它无细胞壁，形态呈多形性。

最小的支原体直径约200nm，可通过滤菌器。

支原体污染后培养基普通不发生混浊，细胞形态无显然变幻，但事实上细胞已受到各方面的潜在影响，如影响DNA合成，代谢减慢，生长被抑制等。

这种污染造成的危害较大，但支原体污染不易被发觉，因此对支原体的污染必需引起足够的重视，应严加防范。

支原体污染常用的检查办法如下。

1．形态学检查常用相差显微镜检测取洁净载玻片，滴加少许待检的细胞悬液，压上盖片，用相差显微镜油镜观看。

如有支原体污染，镜下可见暗色极小颗粒，类似布朗运动，可位于细胞表面或细胞之间。

要注重支原体与细胞破裂后溢出的内容物如线粒体等相区分。

电镜检测：用普通染色办法难以确定时，可用电镜检查。

详见电子显微镜技术一节。

2．支原体染色镜检支原体经低张处理后用地衣红染色观看，本法简便易行，不仅适用于检测支原体，亦可用于检查真菌和细菌。

【材料】 (1)待检疑有支原体污染的培养物； (2）检测用试剂：低张处理液（0.45%），Carnoy固定液（配方：60ml纯加30ml和10m1）,2％的地衣红染液（配方：2g地衣红，60ml加蒸馏水至100m1 )。

【办法】 (1)取材：吸取待检培养液1 ml, 500～800r/min，离心5分钟后去上清液，余留0.2m1备用。

(2）低张处理：用新奇配制的0.45％溶液0.2m1，加入上述待检标本中，静止低张处理10分钟，然后离心去上清液，留取沉淀物0. 2m1，涂片2～3张，晾干。

(3）固定：用新配制的Carnoy液固定2次，共10分钟。

(4）染色：将晾干的涂片用2％的地衣红染5分钟。

细胞培养常见污染的判别及应对措施2011-01-02 10:19:04| 分类：实验| 标签：污染无菌细胞培养基灭菌|字号大中小订阅一、避免细胞培养污染的措施：污染是细胞培养中一个大敌，一旦污染，前功尽弃！决定要进行细胞培养，首先一定要有强烈的无菌意识！操作中要遵守严格的操作规程，不要怕麻烦，越细心越好！注意以下几点，大部份的污染是可以避免的：1. 每次开始实验前，先用紫外照无菌台和实验室20分，用酒精擦手，台面和不消毒的器械（如移液枪等）；实验中，如允许，尽量多过火，开起或盖盖都靠近火焰或在无菌台深处；使用无菌台后，再用酒精擦台面，紫外照20分！2. 滴管不要接触瓶口，吸取废液及加入新鲜培养基时都要注意不要滴在瓶口上等等。

3. 凡是接触瓶口后都要用酒精灯烧烧。

4. 提取组织时，往往头会距离组织很近，所以带口罩很重要！还要换无菌衣（紫外照过的白大褂）。

5. 注意配制完全培养基时不要发生污染，在使用前一定要做无菌培养，因为一般应用污染后的培养基培养细胞后，很快就会发生特别严重的污染。

6. 操作时一定按照实验室的要求，切忌粗心大意。

7. 使用完的东西尽快移出无菌台！另外无菌台上的器械，试剂摆放，也尽量遵循一定的顺序！依污染可能程度依次向外摆。

二、常见的细胞培养污染：下面是几种细胞培养过程中常见的污染：1. 支原体污染：传说中的黑焦虫，长得暴快。

24小时就满视野都是了。

污染源大多数情况下是培养用血清。

图1 支原体污染的光镜检测（圆圈所示，×10倍）图2 支原体污染的光镜检测（×20倍）图3 支原体污染的荧光检测图4 支原体污染的电镜检测（×30k，煎蛋状和其他形状）图5 支原体污染的电镜检测2. 念珠菌污染：似乎无处不在，而且顽固得很。

长得暴快（12h就能在细胞上面密布）。

培养液澄清。

低倍显微镜下像黑色的沙子铺在细胞上，高倍镜下呈树枝状或葡萄状。

图6 念珠菌污染的光镜检测（低倍镜）图7 念珠菌污染的光镜检测（高倍镜）图8 念珠菌污染的光镜检测（高倍镜）图9 念珠菌污染的检测（革兰氏染色阳性）这么大面积的污染，你可以看看是不是操作上出了问题，要不然就是培养基的问题。

细胞出现小黑点是什么，支原体污染怎么办炎炎夏日，细胞污染严重，它们正在被这越来越热的天气“折磨”。

你会慢慢发现细胞出现了一些不知何物的小黑点那些讨厌的小黑点到底是什么呢？今天我们就来说道说道吧~1.细胞碎片细胞生长状态不好，吹打过多或者多次吹打导致碎片，加大血清浓度，降低离心速度养两代试试。

碎片一般会离心出去。

这就是细胞碎片2.黑胶虫黑胶虫污染，黑胶虫一般小而且密。

“黑胶虫”与细胞竞争性生长，开始时对细胞并没有什么影响，但当黑胶虫的数量多到一定程度的时候，细胞生长就会受到影响直至死亡。

3.支原体污染支原体污染不易发现，很多细胞即使支原体污染，在没有出现猛烈爆发时细胞形态也不会有明显的变化，因此支原体污染经常被人们所忽视。

但是支原体污染对细胞的伤害比人们想象的要大得多，会直接对您的实验结果产生影响，包括以下几个方面：①严重降低细胞的基因转导效率:无论是病毒载体还是脂质体介导的基因转导，细胞都会因为支原体的污染而导致效率低下。

②严重影响细胞的功能表型:支原体严重影响细胞的分化方向，扰乱细胞的增殖、活力与代谢水平，造成实验中极其不稳定的细胞表型结果。

那么出现这些情况之后细胞怎么“自救”呢对于细胞支原体污染，向已经污染支原体的细胞中加入汉恒自主研发特效抗支原体试剂SaveIt™ 后，再用PCR检测培养细胞的支原体，电泳图如下。

结果显示，加入汉恒生物抗支原体试剂后，污染的支原体被有效清除。

虽然有试剂可以帮我们清除支原体，但是既然存在支原体污染那就说明别的地方是存在污染可能性的，例如生物安全柜，工作台，培养箱等等，对于这些情况，我们又可以怎么去解决呢？“喷一喷”汉恒生物SaveIt™抗支原体喷雾预防支原体污染效果显著，可用于生物安全柜、超净工作台、CO2培养箱、显微镜等常用仪器以及细胞房门把手等易污染的死角的消毒中，只需轻轻一喷，就可让您远离支原体污染带来的烦恼。

所以汉恒生物不仅有细胞“自用”的抗支原体试剂，还有“外用”的抗支原体喷雾。

细胞培养污染的途径、危害及预防措施污染是细胞培养技术中面临的主要问题。

由于每一种细胞有其独特的培养体系，因此污染造成的后果也不尽相同。

某些污染的发生往往难以察觉和检测，而且污染源能长期共存于培养体系中，这类污染事实上大部分被人们忽视了。

培养的细胞作为一个生物体，会对培养环境以及环境中的污染物作出相应的反应，造成培养细胞生物学特性的改变，而对实验结果造成潜在的威胁，而且随着污染时间的延长而增加。

培养环境中的物理、化学及生物因素都可能侵入培养环境造成污染。

由于入侵的微生物在培养体系中不断增殖、代谢，因此生物性的污染对细胞的危害最大。

随着污染微生物的不断增殖，交叉污染的可能性也不断增加。

此外，微生物代谢消耗大量必需的养分，同时产生多种有毒的代谢产物，如酶、抗原及毒素等，进一步对细胞产生毒害作用。

因此，熟悉细胞培养污染的途径及其危害性，建立细胞培养规范的操作方法及规章制度，可以有效地防止污染，保证实验体系的稳定性和可靠性。

1细胞培养基本技术为了减少污染对细胞培养的影响，必须建立细胞冻存库。

细胞冻存库应该分主细胞库和工作细胞库，当需要做实验时从主细胞库中复苏细胞建立工作细胞库。

每一个冻存标本都应明确记录细胞的性质、代数及有无污染。

同时还应建立规范的检测程序进行菌检及细胞鉴定［1］。

为了保证培养细胞系的完整性，必须进行具体的实验记录，应包括以下内容：细胞系的种类及来源、有无污染、细胞代数和倍增时间、以及选择性突变。

具体的记录有利于对细胞的遗传及生理特性在常规传代培养中因突变、污染及各种原因导致的改变进行分析。

经过连续传代培养的细胞与它较早代数的冻存细胞相比，随着培养时间的延长，细胞在适应环境的过程中，其生物特性已发生了改变。

培养的细胞由若干生长速度及活力各异的亚群组成。

随着培养时间的延长，生长速度快及活力高的细胞亚群逐渐占优势，这种选择性趋势会影响整个细胞群的生物特性。

应用不同代数的细胞连续进行实验则结果会发生偏差。

如何正确判别细胞培养中的细菌与真菌污染在进行细胞培养实验的过程中，细菌与真菌污染是一个常见但也十分令人头疼的问题。

当我们在观察和分析细胞时，准确判断细胞培养中的细菌与真菌污染是至关重要的。

本文将从不同的角度探讨如何正确判断细胞培养中的细菌与真菌污染。

一、观察细胞形态观察细胞形态是判断细胞培养中是否存在细菌与真菌污染的一种重要方式。

细菌和真菌的形态和生长方式有很大的差异。

细菌在培养皿中呈现为小圆点状或线状的结构，而真菌则可能形成大而明显的菌落或菌丝。

此外，真菌会产生孢子，看起来像是一串串小颗粒。

通过观察细胞周围的结构，可以初步判断是否存在细菌与真菌污染。

二、检测培养基上的生长情况细胞培养中的细菌与真菌污染通常会导致培养基上的生长情况发生变化。

如果培养基上有细菌或真菌的存在，通常可以观察到菌落的形成。

在培养过程中，我们可以观察细胞生长的速度、密度和均匀性等指标，如果存在污染，这些指标可能会出现异常情况。

在评估培养基上的生长情况时，需要结合细胞培养的实际要求进行综合判断。

三、使用染色试剂染色试剂在细胞培养中的细菌与真菌污染判别中发挥着至关重要的作用。

常用的染色试剂有格拉姆染色和甲苯胺蓝染色等。

通过染色试剂的使用，细菌和真菌会呈现不同的颜色和形态。

细菌会呈现出紫色或蓝色，而真菌则通常呈现为绿色或红色。

通过对样品进行染色和观察，可以明确判断是否存在细菌与真菌污染。

四、利用PCR技术PCR技术是一种高灵敏度和高特异性的基因检测技术，可以用于检测和鉴定细菌和真菌。

通过PCR技术，可以对细胞培养样品中的DNA进行扩增和分析，从而确定是否存在细菌与真菌污染。

PCR技术可以选择合适的引物，针对不同的细菌和真菌进行特异性扩增，提高判断污染的准确性。

五、更加严格的无菌操作在细胞培养实验中，更加严格的无菌操作是避免细菌与真菌污染的关键。

在实验过程中，我们应该始终保持实验室台面、培养皿、试管等工作区域的清洁。

在进行细胞培养前，用酒精或其他消毒液对操作台面进行清洁和消毒，避免细菌的传播。

细胞支原体污染的图片、危害、表现和怎么办（2016年10月16日）一、细胞支原体污染的图片我们首先来认识一下，细胞支原体污染与非污染的图片有什么区别。

如上图所示，左侧为未经支原体清除试剂处理的人Hela细胞,经DAPI染色后，除了细胞核为蓝色外，细胞质也有大量的絮状核酸物质被染成蓝色，这些处于细胞质的核酸物质就是支原体DNA，说明细胞支原体污染非常严重。

而右侧为经过本公司的支原体清除试剂2处理7天的Hela细胞，经DAPI 染色后，除了细胞核为蓝色外，细胞质没有任何絮状核酸物质被染成蓝色，说明支原体已经被清除。

（版权声明：上图来自上海易色医疗科技有限公司网站。

）二、细胞支原体污染的危害和表现细胞支原体污染的危害（1）培养的细胞被支原体污染后，几乎可以改变细胞的所有功能，其可以导致细胞染色体的异常和损伤，改变细胞的代谢、生长、形状、附着，影响病毒的扩增能力和产量等等。

例如，Miller CJ等人通过Microarray的研究表明：支原体污染严重改变被污染细胞的基因表达谱 [1, 2]，支原体污染后与无污染的同一细胞系相比，表达差异达2倍以上的基因就有200多个！！！（详细数据请见参考文献1）。

Edward Burnett 和 Liz Penn认为：被支原体污染的细胞系已经不是原来的细胞系，而是另外一个细胞系了 [3]！此外，严重的支原体污染将彻底摧毁一株细胞系。

从2013年开始，《Nature》期刊已正式要求投稿的文章，如涉及细胞培养都要进行支原体检测。

相信会有越来越多的高水平期刊将做出同样的支原体检测要求。

总之，在细胞系上进行生物医学方面的科学研究，如果不能保证所用的细胞系无支原体污染（Mycoplasma-free），则所得出的结论是极端不可靠甚至是完全错误的！可以想象：全球范围内，每年因支原体污染导致白白浪费的科研经费的数量是多么的巨大，有人估计至少高达数十亿美金！细胞支原体污染的危害（2）1. 细胞生物学：支原体污染将直接导致最常用的MTT细胞毒性实验结果的严重错误！●结果：由于支原体对MTT的额外还原作用，对阿霉素（Doxorubicin, 一种抗肿瘤药物）的抗性，支原体污染和非污染的细胞二者相差15倍！（Due to an additional reduction of tetrazolium by mycoplasmas, contaminated cells appeared up to 15 fold resistant to doxorubicin.）●参考文献：Falsification of tetrazolium dye (MTT) based cytotoxicity assayresults due to mycoplasma contamination of cell cultures. Anticancer Res. 1999 Mar-Apr; 19(2A):1245-8.2. 免疫学：支原体污染本身将可以直接诱导树突状细胞的成熟！这对于目前国内外普遍开展的人体免疫细胞的肿瘤治疗将是灾难性的。

最近看到不少问有关细胞培养污染的事，正好我看到了一个有关这方面的总结，很全很好很强大，跟大家分享下细胞培养中常见的污染情况总结如下:常见的污染如下：1、细菌：细菌在普通倒置显微镜下为黑色细沙状，根据感染细菌的不同，可有不同的外形，培养液一般会浑浊变黄，对细胞生长影响明显。

仔细检查一下器皿的灭菌情况，是否在高压灭菌时放气时间足够，压力足够！尤其是和储存培养液接触的移液管等物品，连续两次污染的话有可能造成储存液污染，一定要注意！下次使用前检查一下培养液是否存在浑浊的现象！可在培养液中加相应的抗生素处理2、霉菌：培养液是清亮的，倒置显微镜下无杂质，37度孵箱培养2-3天，仍清亮，但出现絮状杂质，镜下可见呈细丝状的团状漂浮物，可看到明显的菌丝，细胞仍可生长，但时间长之后，细胞的活力状态变差，用硫酸铜溶液擦拭CO2孵箱内，再把水盘里也加上饱和量的硫酸铜。

或者在培养箱的托盘加入饱和的消毒磷酸氢二钠高盐液体,可以防止霉菌污染。

CO2孵箱被霉菌污染后，可把所有细胞暂时转移，采用过氧乙酸擦洗孵箱（包括隔板，箱壁）。

并把过氧乙酸放置在孵箱内一个小时，使其蒸汽弥漫。

待过氧乙酸的气味消散后，再移入细胞。

孵箱应定期清洁（2月左右），尤其在多雨的季节。

其它培养箱清洗方法是：用84液擦洗－清水擦洗－75%酒精擦洗－紫外灯照。

预防霉菌污染，可在培养基里加3u/ml的两性霉素或制霉菌素或放线菌素D或双抗；但细胞一旦污染，很难挽救，制霉菌素或放线菌素D或双抗都于事无补，建议舍弃该污染细胞。

，将环境彻底消毒，如果所有细胞都污染，可能是系统污染，检查一下培养基和器材，如果只是个别污染，可能是操作问题，就要注意操作3、支原体：黑色的，好象多为多形，培养液一般会浑浊，原体感染，国内血清很多都没有做支原体阴性检测，而支原体是牛血清中最常见的微生物之一。

而且它不能用过滤的办法除去。

支原体感染细胞以后，细胞病变不很明显，只是慢慢死去。

用泰乐菌素，兽用支原体病的药，但可用于细胞培养，无任何不良反应。

常见细胞污染及其处理方法麦~粒（2012级生物化学与分子生物学专业）摘要：细胞培养是生命科学实验及生物医药产业化中的一项关键技术，细胞污染问题一直是细胞培养中的大敌。

本文综述了细胞培养中污染的类型、处理方法和预防措施等，以期为实验室细胞培养中遇到的细胞污染的解决提供参考。

关键词：细胞培养，细胞污染，支原体污染细胞培养技术是现代生命科学研究中不可缺少的一项基本实验技术，同时也是细胞工程中的核心技术之一。

细胞培养的质量好坏直接关系到实验结果的可靠性与否以及产品质量的合格与否。

在细胞培养中，最基本的原则就是无菌操作，污染是细胞培养最致命的大敌，预防和避免污染是细胞培养成功的关键之一。

特别是对于一些珍贵的细胞株，一旦污染对实验可能就是毁灭性的。

1 污染的类型细胞污染的类型可分为物理、化学、生物三类。

其中化学、生物因素最为常见，物理因素最易被忽视。

1.1物理污染物理性污染通过影响细胞培养体系中的组分，从而影响了细胞的代谢。

最为常见的是温度和辐射（紫外线照射）。

过冷或过热的温度对细胞可引起细胞生理状态的改变，如从冰箱中取出的培养液直接加至37℃培养的细胞中可能会造成细胞应激，影响某些实验现象的观察。

在生物安全柜紫外灭菌时，应当遮蔽对紫外线敏感的试剂，同时普通操作中也要注意对见光易分解的物质进行避光处理。

对于需要使用同位素标记的某些实验，应当注意细胞、试剂周围不能放同位素。

除此之外，有时操作过程中偶尔有异物落入，极易造成污染。

一些小的颗粒状异物作为是微生物污染的载体进入培养液中造成细胞污染。

另外，实验过程中酒精棉球的棉絮、移液器枪头上的某些塑料碎屑等都有可能增加染菌的概率。

1.2化学污染细胞培养中的化学污染大多是由于实验准备或实验过程中造作不当造成的。

在实验准备阶段，细胞培养室中的器皿应做到专用，避免与常用器皿混用。

此外，细胞用器皿洗刷过程中要注意洗刷彻底，不可有洗涤剂等残留。

高压灭菌时应灭菌彻底，并在灭菌后的生物安全柜中打开使用。

细胞培养中常见的污染情况、可能原因、解决方法细胞培养中常见的污染情况总结如下:常见的污染如下：1、细菌：细菌在普通倒置显微镜下为黑色细沙状，根据感染细菌的不同，可有不同的外形，培养液一般会浑浊变黄，对细胞生长影响明显。

仔细检查一下器皿的灭菌情况，是否在高压灭菌时放气时间足够，压力足够！尤其是和储存培养液接触的移液管等物品，连续两次污染的话有可能造成储存液污染，一定要注意！下次使用前检查一下培养液是否存在浑浊的现象！可在培养液中加相应的抗生素处理2、霉菌：培养液是清亮的，倒置显微镜下无杂质，37度孵箱培养2-3天，仍清亮，但出现絮状杂质，镜下可见呈细丝状的团状漂浮物，可看到明显的菌丝，细胞仍可生长，但时间长之后，细胞的活力状态变差，用硫酸铜溶液擦拭CO2孵箱内，再把水盘里也加上饱和量的硫酸铜。

或者在培养箱的托盘加入饱和的消毒磷酸氢二钠高盐液体,可以防止霉菌污染。

CO2孵箱被霉菌污染后，可把所有细胞暂时转移，采用过氧乙酸擦洗孵箱（包括隔板，箱壁）。

并把过氧乙酸放置在孵箱内一个小时，使其蒸汽弥漫。

待过氧乙酸的气味消散后，再移入细胞。

孵箱应定期清洁（2月左右），尤其在多雨的季节。

其它培养箱清洗方法是：用84液擦洗－清水擦洗－75%酒精擦洗－紫外灯照。

预防霉菌污染，可在培养基里加3u/ml的两性霉素或制霉菌素或放线菌素D或双抗；但细胞一旦污染，很难挽救，制霉菌素或放线菌素D或双抗都于事无补，建议舍弃该污染细胞。

，将环境彻底消毒，如果所有细胞都污染，可能是系统污染，检查一下培养基和器材，如果只是个别污染，可能是操作问题，就要注意操作3、支原体：黑色的，好象多为多形，培养液一般培养液一般会浑浊，原体感染，国内血清很多都没有做支原体阴性检测，而支原体是牛血清中最常见的微生物之一。

而且它不能用过滤的办法除去。

支原体感染细胞以后，细胞病变不很明显，只是慢慢死去。

用泰乐菌素，兽用支原体病的药，但可用于细胞培养，无任何不良反应。

细胞的细菌、真菌污染及排除Edit By Waiting.D真菌污染是细胞培养过程中最常见的一种，尤其在梅雨季节进行细胞培养更易污染。

污染培养细胞的多为烟曲霉、黑曲霉、毛霉菌、孢子霉、白念珠菌、酵母菌等。

霉菌污染后多数在培养液中形成白色或浅黄色漂浮物。

一般肉眼可见，较易被发现，短期内培养液多不混浊，倒置显微镜下可见于细胞之间纵横交错穿行的丝状、管状、及树枝状菌丝，并悬浮飘荡在培养液中。

很多菌丝在高倍镜可见到有链状排列的菌珠；念珠菌或酵母菌形态呈卵形，散在细胞周边和细胞之间生长。

镜下看时，要将培养瓶用酒精棉球擦干净，以防止与瓶外尤其瓶底外面生长的菌丝相混淆。

真菌污染后，细胞生长变慢，但最后由于营养耗尽及毒性作用而使细胞脱落死亡。

真菌污染细菌是一种原核细胞微生物，其大小以微米（μm）计。

常见的污染细菌有革兰氏阴性菌和大肠杆菌、假单胞菌等，革兰氏阴性菌中白色葡萄球菌等比较常见。

一旦发生细菌污染较易发现，多数情况下培养液短期内颜色变黄，表明有大量酸性物质产生，出现明显混浊现象；有时静置的培养液液体初看不混浊，但稍加振荡，就有很多混浊物漂起。

倒置显微镜下观察，可见培养液中有大量圆球状颗粒漂浮。

必要时可取少量培养液涂片染色检查以证实细菌种类；有的培养液改变不明显而又疑有污染，可取出少量培养液用普通肉汤接种或用未加双抗药物的培养液接种，也可取10ml细胞悬液以100rpm离心5min，沉淀中加入无抗生素的培养液2ml，置于37℃培养，24h可得结果。

污染后细胞发生病理改变，胞内颗粒增多、增粗，最后变圆脱落死亡，造成试验失败和细胞株(系)丢失。

细菌污染细菌和真菌污染多在传代、换液、加样等开放性操作之后发生，而且由于增生迅速，多再发生污染48h以内就已明显。

在实验的最初两天密切观察实验样品是否有污染发生，有利于及时采取措施予以补救或排除。

培养细胞一经污染，多数较难处理。

如果污染细胞价值不大，宜弃之；有细胞株留存的或可购置的，可在寻找原因后彻底消毒操作室和二氧化碳培养箱(若发现真菌污染，可在污染孔内加入1mol/L氢氧化钠或硫酸铜溶液处理)（具体操作方法可参考细胞培养污染的预防），复苏或重新购置细胞，再培养。

细胞培养常见细菌污染原因细胞培养是生物学研究中常用的实验技术，用于研究细胞的生理、生化和分子生物学特性。

然而，细胞培养过程中常常会受到细菌污染的影响。

细菌污染会对细胞培养的可靠性和准确性产生不良影响，因此控制细菌污染是细胞培养实验中至关重要的一步。

细胞培养常见的细菌污染原因主要有以下几个方面：1. 操作不当：细胞培养的整个过程都需要严格的无菌操作，而操作不当是导致细菌污染的主要原因之一。

无菌操作包括更换培养基、移液操作、接种细胞等，如果在操作过程中没有严格遵守消毒和无菌操作规范，就会导致细菌的进入和繁殖。

2. 试剂和培养物污染：试剂和培养物是细胞培养中常用的重要物质，如果试剂和培养物本身存在细菌污染，那么在培养过程中就会引入细菌。

试剂如培养基、酶、胎牛血清等的批次变化或不良质量，都可能导致细菌污染。

此外，非无菌的操作也会导致试剂和培养物的污染。

3. 实验室环境污染：实验室环境中存在微生物的存在，如桌面、空气、实验器皿等都可能存在细菌。

如果实验室的环境清洁度不够高，容易造成细菌污染。

此外，实验器皿如培养皿、离心管等的洗涤和保存也需要保证无菌操作。

4. 人员因素：人员的操作能力和操作习惯也会影响到细菌污染的发生。

操作人员应该保持良好的个人卫生习惯，定期对手套、实验服等进行更换和清洗。

如果操作人员不注意操作细节，如不合理的移液操作、使用不干净的仪器等，都可能导致细菌的污染。

5. 培养器具污染：培养器具如试管、离心管、细胞培养板等在使用之前需要经过高温和化学消毒处理，以杀灭其中潜在存在的细菌。

然而，如果器具处理不彻底或者保存环境不好，就容易导致细菌的残留或再次感染。

细胞培养中细菌污染的危害是非常严重的。

首先，细菌污染会干扰细胞培养体系的稳定，导致无法准确观察和研究细胞的生理和生化特性。

其次，细菌代谢产物和细胞培养物中含有的抗生素等成分会干扰细胞培养的正常生长和发育，降低实验结果的可靠性和准确性。

此外，由于细菌的存在，还容易导致细胞死亡和污染的蔓延，对细胞培养的连续性和稳定性造成不可逆的伤害。

细胞污染概述凡混入细胞培养环境中对细胞生存有害的成分和造成细胞不纯的异物都应视为污染，细胞污染不能完全被消除，但能减少其发生的频率和后果的严重性。

细胞污染根据污染源主要可以分为物理性，化学性和生物性污染。

一、物理性污染的来源、危害及预防物理性污染常常被人们所忽视或被笼统地归为化学性污染。

物理性污染通过影响细胞培养体系中的生化成分，从而影响细胞的代谢。

培养环境中的物理因素，如温度、放射线、振动、辐射(紫外线或荧光)会对细胞产生影响。

细胞、培养液或其它培养试剂暴露于放射线、辐射或过冷过热的温度中，可以引起细胞代谢发生改变，如细胞同步化、细胞生长受抑制甚至细胞死亡。

通过实验室的合理设计及建立规范的操作规程，可以减少环境中物理因素对细胞的影响。

孵箱应放在温度较恒定的环境中，周围不能放置能引起机械振动的设备，如离心机。

培养液及培养试剂应放在固定的位置，为避免光照试剂不能放在玻璃门的冰箱中，试剂周围不能放同位素。

培养液从冰箱中取出后应在室温中放置一段时间后再进行实验，以避免过冷的温度对细胞的影响。

二、化学性污染的来源、危害及预防培养环境中许多化学物质都可以引起细胞的污染。

化学物质并不总是抑制细胞的生长，某些化学物质如激素就可促进细胞的生长。

不同细胞对化学物质污染的反应是不一样的。

未纯化的物质、试剂、水、血清、生长辅助因子及储存试剂的容器都可能成为化学性污染的来源。

细胞培养的必需养分，如氨基酸，若浓度超过了合适的范围，也会对细胞产生毒性。

同样，不同细胞系其最佳培养条件下对血清和缓冲液的要求是不一样的，在培养中应严格控制。

玻璃制品清洗过程中残留的变性剂或肥皂(通常残留在瓶盖的内表面)是最常见的化学性污染。

水是唯一一种在凝固时膨胀的化合物。

因此在选择冻存细胞的容器时应考虑到这个因素。

容器因水的膨胀而发生破裂是引起试剂污染的重要原因。

为了避免金属离子、有机分子、细胞内毒素等物质对水的污染，在配制液体，清洗容器时必须使用不含杂质的超纯水。

常用的细胞培养方法、污染及污染处理一、本文概述细胞培养是生物学和医学领域中一种重要的实验技术，广泛应用于基础研究和实际应用。

通过模拟细胞在体内生长的环境，细胞在体外得以繁殖、分化并维持其特定功能。

本文旨在概述常用的细胞培养方法，包括培养基的选择、细胞传代、细胞冻存与复苏等，同时探讨细胞培养过程中可能出现的污染问题，包括细菌、真菌和支原体等微生物污染，以及污染的检测和处理方法。

通过本文的阐述，读者可以对细胞培养的基本流程和污染防控有更为全面的了解，为实验操作提供指导和参考。

二、常用的细胞培养方法细胞培养是生物学和医学研究中的核心技术，用于模拟体内环境，研究细胞生长、分化和功能。

以下是几种常用的细胞培养方法：贴壁培养法：这是最常见的细胞培养方法。

细胞在培养瓶或培养板的表面上贴壁生长，形成单层细胞。

这种方法适用于大多数哺乳动物细胞系。

悬浮培养法：某些细胞，如血液细胞、肿瘤细胞和某些干细胞，可以在液体培养基中悬浮生长。

这种方法不需要细胞贴壁，可以方便地扩大细胞数量。

微载体培养法：微载体是一种微小的、可以悬浮在培养基中的颗粒，通常用于大规模细胞培养。

细胞可以在微载体的表面上贴壁生长，从而增加细胞与培养基的接触面积，提高细胞生长效率。

三维培养法：这种方法模拟体内组织的三维结构，使用支架或凝胶等基质支持细胞生长。

它有助于研究细胞间的相互作用和组织的形成。

共培养法：将不同类型的细胞放在同一个培养环境中进行培养，以模拟体内细胞间的相互作用。

例如，将内皮细胞和肿瘤细胞共培养，可以研究肿瘤血管生成的过程。

在进行细胞培养时，需要选择适合细胞类型和实验目的的培养方法，同时严格控制培养条件，包括温度、湿度、pH值、营养成分等，以确保细胞的正常生长和繁殖。

三、细胞培养污染及其影响在细胞培养过程中，污染是一个常见且严重的问题，可能对细胞生长、实验结果和细胞治疗产生负面影响。

污染主要来源于微生物，包括细菌、真菌、支原体和病毒等。

细胞培养中常见的污染情况总结如下:常见的污染如下：1、细菌：细菌在普通倒置显微镜下为黑色细沙状，根据感染细菌的不同，可有不同的外形，培养液一般会浑浊变黄，对细胞生长影响明显。

仔细检查一下器皿的灭菌情况，是否在高压灭菌时放气时间足够，压力足够！尤其是和储存培养液接触的移液管等物品，连续两次污染的话有可能造成储存液污染，一定要注意！下次使用前检查一下培养液是否存在浑浊的现象！可在培养液中加相应的抗生素处理你的培养液应该一两天内很快变混浊．刚开始小虫杆状成串，不怎么动，多了以后就不成串了，移动迅速，是这样吗？如果是，细菌培养液是被洋葱佰克霍尔德菌污染了。

洋葱佰克霍尔德菌（Burkholderiacepacia）原属假单胞菌属，是植物病原菌，因引起洋葱患病而得名，是医院感染病原菌之一。

洋葱伯克霍尔德菌是一种广泛存在于土壤及水中，与医院感染密切相关的革兰阴性杆菌，尤其为免疫缺陷及肺囊性纤维化患者易感染细菌之一。

它可以在无糖的培养基中生长。

在医院环境中常可污染自来水、体温表、喷雾器、静脉导管、导尿管、静脉输液管等，造成院内传播，导致多种医院感染，如败血症、心内膜炎、肺炎、伤口感染、深部脓肿和眼结膜炎等，尤其采用导管植入进行治疗者，更容易引起感染。

洋葱伯克霍尔德菌对多种抗菌药具有天然的耐药性。

耐药现象严重，治疗可选择复方磺胺甲懒唑、哌拉西林,三唑巴坦、哌拉西林和头孢他啶等抗菌药物。

参考文献：洋葱伯克霍尔德菌86株的分布与耐药性尤荣开，等中国抗感染化疗杂志2003年2月28日第3卷第1期2、霉菌：培养液是清亮的，倒置显微镜下无杂质，37度孵箱培养2-3天，仍清亮，但出现絮状杂质，镜下可见呈细丝状的团状漂浮物，可看到明显的菌丝，细胞仍可生长，但时间长之后，细胞的活力状态变差.用硫酸铜溶液擦拭CO2孵箱内，再把水盘里也加上饱和量的硫酸铜。

或者在培养箱的托盘加入饱和的消毒磷酸氢二钠高盐液体,可以防止霉菌污染。

CO2孵箱被霉菌污染后，可把所有细胞暂时转移，采用过氧乙酸擦洗孵箱（包括隔板，箱壁）。

检测你的细胞是否有支原体污染告诉你们这一桌年夜饭都是我做的哦（得意脸）。

一般实验做的好的人，做饭也不会太差。

今年跟大家分享的最后一个帖子就是怎么检测细胞支原体污染。

支原体感染的细胞样子在细胞培养过程中支原体污染经常出现且不易消除，95%以上是由口腔支原体造成（所以细胞培养戴口罩是很必要的，感觉你再怎么小心对待你的细胞都不为过）。

1.支原体污染初期, 在高倍显微镜下（400倍），虽然细胞无明显变化，但是在细胞膜周围或细胞间隙可以发现细小黑色颗粒。

2.细胞培养时间延长, 尽管培养液不浑浊（一般细菌污染培养液会变浑浊）, 但培养液pH值变化明显然后颜色变黄（虽然一般的细胞培养培养基也会变黄，但是速度要慢很多）。

3.在支原体感染较重的时候可以引起细胞变形。

4.如果你们实验室没有常规杀除支原体的操作，那么我相信只要你们在用细胞培养标本去送RNA-seq、LncRNA测序、CirRNA测序时，公司给出的结果都会有支原体污染。

下图是nature杂志给出的如果用细胞系做的实验，需要提供无支原体污染的证据（果子老师，重新ATCC购买细胞哦）Nature.jpg因此在细胞培养过程中进行支原体检测与防治十分必要。

今天先跟大家分享支原体怎么检测，也就是你怎么检测你的细胞有无支原体污染。

常见的支原体检测方法有直接培养法和间接法。

直接培养法这个方法其实对于不做支原体研究的人来说基本用不上，这里就不细讲。

如果需要可以留言交流。

间接法1. DNA荧光染色法在免疫荧光那一期没有具体介绍活细胞怎么做免疫荧光。

这里稍微讲讲活细胞怎么染核。

活细胞可以用Hoechst染色。

可将DNA标示，此种染色方式也可以用来辨识DNA，意思就是细胞内有DNA的都可以识别出来，在正常细胞中就是细胞核及线粒体可以被识别。

那支原体污染时的染色是什么样的呢？首先，支原体有自己的基因组，所以，如果有支原体污染的情况，会在细胞表面或者培养基中发现有小点或者碎片状的荧光，有时候会形成连续的一圈。

培育技术中如何识别和解决细胞毒性问题技术在现代科学研究和医疗应用中扮演着重要的角色。

然而，在培育技术中，我们常常面临一个重要的问题——细胞毒性。

本文将探讨如何识别和解决细胞毒性问题，以帮助科学家更好地利用技术进行研究和创新。

细胞毒性是指某种物质或条件对细胞产生的有害影响。

在培育技术中，细胞毒性可能来自培养基、培养条件以及添加的化学物质等因素。

当我们进行体外细胞培养时，我们应该首先识别细胞毒性，并采取适当的措施解决它。

第一步是识别细胞毒性。

识别细胞毒性的方法有很多，包括形态学观察、细胞增殖和存活率的测量、细胞代谢产物的检测等。

首先，通过观察细胞的形态学特征，比如细胞是否出现萎缩、变形、颜色变化等，可以初步判断是否存在细胞毒性。

然后，通过测量细胞的增殖和存活率，可以进一步确认细胞毒性的程度。

最后，通过检测细胞的代谢产物，比如ATP水平、乳酸产生率等，可以评估细胞的生理状态，更全面地了解细胞毒性的状况。

第二步是找出细胞毒性的原因。

细胞毒性可能来自培养基、培养条件以及添加的化学物质等多个方面。

如果我们发现培养基对细胞有毒性，我们可以尝试更换培养基，或者优化培养基的成分，比如调整pH、添加适当的营养物质等。

如果是培养条件导致的细胞毒性，我们可以调整温度、湿度、氧气浓度等条件，以使其更适合细胞生长。

对于添加的化学物质，比如药物、抗生素等，我们可以调整浓度，或者选择其他替代品，以减少对细胞的毒性。

第三步是解决细胞毒性问题。

一旦确定了细胞毒性的原因，我们可以采取一些措施来解决它。

比如，如果是培养基对细胞有毒性的问题，我们可以尝试添加一些细胞抗氧化物质或生长因子来保护细胞。

如果是培养条件导致的细胞毒性，我们可以优化培养条件，比如调整温度、湿度、氧气浓度等，以减少对细胞的影响。

对于化学物质导致的细胞毒性，我们可以调整其浓度或者选择其他替代品，以减少对细胞的伤害。

此外，我们还可以借助一些高级技术来识别和解决细胞毒性问题。