免疫分析法ppt

酶联免疫分析法——应用2
2、放射免疫分析法(RIA)
• 简介
1959 年美国的 Yalow 和 Berson 首先使用放射性核 素标记胰岛素从而创立了放射免疫分析法 (radioimmunoassay，RIA)。
• 定义:把放射性核素测定与抗原、抗体间的免疫
化学反应两种方法巧妙地结合起来所形成的一种 超微量物质的测定方法。
兴奋剂检测的主要方法有气相色谱、高
效液相色谱、气相色谱－质谱联用、液相 色谱－质谱联用、免疫分析法、流动注射 电化学发光、高效毛细管电泳、毛细管电 泳－离子阱质谱等方法。
二、免疫分析法
免疫分析法是利用抗原与抗体的特异 性免疫反应来实现对禁用药物的检测的 方法。
特点：快速、高灵敏度、高特异性。 应用：主要被应用于类固醇类兴奋剂 和激素类兴奋剂的检测。
免疫分析法ppt
兴奋剂的检测方法
之免疫分析法
一、兴奋剂的概念 二、免疫分析法
（1）酶联免疫分析法 （2）放射64年，国际运动医学会的国际兴奋剂 会议将兴奋剂的概念定义为: 参加竞赛的 运动员使用任何异体物质，或以不正常的 量和不正常的进入机体的途径使用生理物 质，试图人为地以不正当方式提高其竞赛 成绩的行为。
抽干。
4、结果
γ一记数 仪记数， 并自动计 算尿中MA
浓度 (ng·ml-1)
3、化学发光免疫分析法（CLIA）
1977年Halman将化学反应系统与免疫系统相 结合，创建了化学发光免疫测定法(CLIA )，以检 测抗原或抗体。CLIA是建立放射免疫分析技术 (RIA)基础上的免疫分析技术，既有免疫反应的 特异性，更兼有发光反应的高敏感。
1、酶联免疫分析法(ELISA)
酶联免疫分析法——原理
通过在合适的载体上酶标一定量的抗原与未知抗 原竞争固相抗体结合位点，形成抗体复合物。在 一定底物参与下，复合物上的酶催化底物使其水 解氧化或还原成另一种带色物质，由于酶的降解 产物与显色成正比，因此可通过酶标仪来测定， 从而确定是否存在未知抗原及其含量。
甲基苯丙胺(MA)及其代谢物自尿排出体外 ，可以通过检测尿液中的苯丙胺类兴奋剂及 其代谢物来认定吸毒者。通过建立甲基苯丙 胺放射免疫分析法 ，采用碳化二亚胺法制备 甲基苯丙胺半抗原，免疫兔使其产生相应的 抗体与Na125I标记抗原组成试剂盒，检测人体 体液中的甲基苯丙胺(MA)。
放射免疫分析法——应用
1、采样
1天分8个时 间段，上、 下午各采四 次，每组间 隔45min； 收集的尿液 在-20℃保存
待检验
2、样品前处理
取尿液于小 离心管中，
离心，取 上清液供 RIA分析
3、检测
取50μL样品、 100μL 1:600抗 血清和100μL 125I-MA;37℃孵 育45min，加 分离剂500μL， 放置15min， 以3000r·min1离心15min，
注：T=B+F
标准曲线
放射免疫分析法——特点
• 优点： 1.灵敏度高，其最小检测值可达ng至pg水平; 2.特异性强:由于抗原抗体反应的高度特异性，
该方法具有很强的特异性不需要对样品进行提纯 即可直接测定;
3.重复性好、准确性佳、快速简便，免除了烦 琐的化学提纯步骤；
4. 药盒种类多、标本和试剂用量少，测定方法 易于规范化和自动化等。
酶联免疫分析法——应用1
酶联免疫分析法——应用2
• Eva M 等将牛血清白蛋白多克隆抗体与孕三烯酮3 - 羧甲基羟胺耦合，创建了两种高灵敏度、特异 的检测孕三烯酮的酶联免疫分析法。实验A，半抗 原蛋白涂层条件下的检测限为0.09±0.03ng.L-1 。实验B，在共轭蛋白涂层的条件下，检测限可达 到0.14±0.05 ng.L-1。两个免疫测试都具有高特 异性，与其他合成代谢类固醇没有任何交叉反应 。一般条件下的可运用于未预处理的尿液样本中 类固醇的检测，回收率可达到76~122%。
3、化学发光免疫分析法（CLIA）
2、放射免疫分析法(RIA)
放射免疫分析法——原理
• 建立在标记抗原(*Ag)和非标记抗原(Ag)对限量的特异性抗体 （Ab）的竞争性结合反应。
• *Ag与 Ag 具有等同的与Ab结合能力。 • 竞争结合反应可用下式表示：
*Ag + Ab↔*Ag-Ab + Ag ↕
Ag-Ab
放射免疫分析法——原理
酶联免疫分析法——原理
酶联免疫分析法——特点
优点：快速 特异性强 分析容量大 安全可靠
应用：适用在现场筛选和大量样本的快速检测
酶联免疫分析法——应用1
• Daniel 等用酶联免疫分析法多项检测，定性、定 量检测了蛋白同化激素。这个方案结合不同的交 叉反应性与分布多元数据分析技术的多元竞争 ELISA实验。用新型k-最近邻分类法分析了主成分 。这个方案可以同时检测四种浓度范围为0.1 316.2nmol/L不同的类固醇，甚至在交叉反应的前 提下总的检测正确率也可达90.6%。
放射免疫分析法——特点
• 缺点： 1.检测中有放射性污染，对操作人员有一定的
辐射损害； 2.放射性废物处理上的困难和对环境有一定的
污染；
放射免疫分析法——应用
（尿液中苯丙胺类兴奋剂的检测）
甲基苯丙胺(MA)属于苯丙胺类兴奋剂，作 用于中枢神经系统，具有药物依赖性及毒理 学特性，是我国最为严重的滥用毒品之一。
用已知不同浓度 的标准物Ag和一 定量的*Ag及限 量的Ab反应，随 着Ag增加， *Ag 与Ab结合的少，
二者变化如右图
所示。游离的 *Ag为F, *Ag-Ab为 B。
RIA反应示意图
放射免疫分析法——原理
B／(B+F)与Ag的量存在 着函数关系，绘制得标 准曲线。将未知浓度 样品按同样条件操作， 所得结合率(％)与标准 曲线相比，即可得出样 品中待测抗原的浓度。
二、免疫分析法
分类： （1）酶联免疫分析( enzyme－ linkedimmunosorbent assay，ELISA) （2）化学发光免疫分析( chemiluminescence immunoassay，CIA) （3）放射免疫分析( radioimmunoassay， RIA)
1、酶联免疫分析法(ELISA)