菠萝蛋白酶的提取、初级纯化及活性鉴定

菠萝蛋白酶的提取、初步分离纯化及活性测定12食安2班陈志廉摘要本文阐述了通过运用高速离心法提取粗酶，盐析分离提纯，透析除杂等方法提取出了菠萝蛋白酶并将其初步分离纯化且测定了各个步骤的酶活性的过程。

关键词菠萝蛋白酶纯化酶活性前言菠萝蛋白酶（Bromelain，EC3.4.22.3）简称菠萝酶，是从凤梨属植物菠萝中提取的一组复合的半胱氨酸巯基蛋白水解酶，1891年Mercaro于菠萝的汁中首先发现。

在食品工业中菠萝蛋白酶作为一种食品添加剂，能分解蛋白质、肽、酯和酰胺等，可用于肉质嫩化、水解蛋白、啤酒澄清、干酪生产等。

菠萝蛋白酶来可以用来增加豆饼和豆粉的PDI值和NSI值，从而生产出可溶性蛋白制品及含豆粉的早餐、谷类食物和饮料。

其它还有生产脱水豆类、婴儿食品和人造黄油；澄清苹果汁；制造软糖；为病人提供可消化的食品；给日常食品添味等。

在医药上它可以治疗水肿及多种炎症，并有助消化，健胃消食等功能。

菠萝蛋白酶属于糖蛋白，是由巯基蛋白酶和非蛋白酶组分构成的复杂复合物，因含有一个不稳定的游离巯基，所以菠萝蛋白酶极易被氧化而使其酶活下降。

本文主要验证了从新鲜菠萝皮中提取菠萝蛋白酶并将之纯化的方法，以求改进工艺等。

1实验材料与仪器1.1实验材料与试剂新鲜菠萝、0.1mo1/L pH7.8磷酸缓冲液（PBS）、0.01mo1/L pH7.8磷酸缓冲液（PBS）、1％酪蛋白、激活剂、10％三氯乙酸(TCA)、牛血清白蛋白、考马斯亮蓝G2501.2实验仪器722型可见光分光光度计：上海舜宇恒平科学仪器有限公司；752型光栅分光光度计：北京光学仪器厂；TDL-60B台式离心机：上海安宁科学仪器厂；D5M离心机：长沙湘智离心机仪器有限公司；DK-8D电热恒温水浴锅：上海森信实验仪器有限公司；可控硅恒温水浴锅：上海锦屏仪器仪表有限公司；AMPUT电子天平：深圳安普特科技有限公司；BS110S分析天平北京赛多利斯天平有限公司；DS-1型高速组织捣碎机：上海标本模型厂；HZS-H型水浴振荡器：哈尔滨市东联电子技术开发有限公司2实验方法2．1菠萝蛋白酶的粗酶提取称取菠萝皮材料30g，将菠萝皮在清水中洗净，沥干，切成小段后置于超高速搅拌机中，加入约60mL预冷的0.1mo1/L pH7.8PBS，持续搅拌10~15min至粉碎，搅拌完成后用4层纱布过滤，得到滤液后，用冷冻离心机于4°C3000rpm 离心6min，弃沉淀，即得到菠萝蛋白酶粗提液，测定粗提液的体积、蛋白质含量和酶活性。

菠萝蛋白酶的提取纯化及化学修饰对其活性的影响一．实验目的与要求（1）掌握菠萝蛋白酶的制备与纯化的基本原理和方法（2）掌握菠萝蛋白酶活力测定方法（3）菠萝蛋白酶的稳定性研究（4）菠萝蛋白酶的修饰（5）比较修饰酶与未修饰酶的活力二．实验原理菠萝蛋白酶是典型的巯基蛋白质,广泛存在于菠萝果实、芽、叶、茎中,分子量为33000,能分解蛋白质、肽、脂和酰胺等。

它的水解活性较木瓜酶高10倍以上。

因此有广泛的用途。

它作为一种食品添加剂可用于肉质嫩化、啤酒澄清。

还用于胶、水解蛋白的生产,在医药上它可在生物体内溶解纤维蛋白及血凝块。

因此可以治疗水肿及多种炎症,它能迅速溶痂。

对正常组织无害,不影响植皮,适用于中小面积深度烧伤的治疗。

在稀盐溶液中，蛋白质的溶解度随盐浓度的增大而增大，这种现象称为盐溶。

当盐浓度增加到一定量时，其溶解度又逐渐减小，直至在溶液中沉降出来，即为盐析。

加入中性盐后，由于中性盐对水分子的亲和力大于蛋白质，于是蛋白质分子周围的水化膜层减弱乃至消失。

同时，中性盐加入蛋白质溶液后，由于离子强度发生改变，蛋白质表面电荷大量被中和，更加导致蛋白溶解度降低，使蛋白质分子之间相互聚焦而沉淀。

凝胶层析是广泛应用于蛋白质、酶、和核酸等生物高分子分离分析的有效方法之一，它是以被分离物质的分子量差异为基础的一种层析方法。

分子量大于允许进入凝胶“网眼”的范围的物质完全被凝胶排阻，随洗脱液先流出层析液，分子量小的物质较晚地流出柱。

本实验采用葡聚糖凝胶Sephadex G-75作为固相载体，它适用于1500-30000之间的多肽与蛋白质的分离。

Folin-酚试剂法所用的试剂由两部分组成。

试剂甲相当于双缩脲试剂，可与蛋白质中的肽键起显色反应。

试剂乙（磷钨酸和磷钼酸混合液）在碱性条件下极不稳定，易被酚类化合物还原而呈蓝色，由于蛋白质（或多肽）中含有带酚基的酪氨酸，故有此呈色反应。

蓝色深浅与蛋白质浓度相关，在一定浓度范围内呈线性关系，因此可作比色法测定。

菠萝蛋白酶提取纯化及化学修饰对其活性的影响一、实验目的1、掌握菠萝蛋白酶的提取和纯化方法2、研究菠萝蛋白酶的稳定性3、掌握菠萝蛋白酶的化学修饰并对修饰酶与未修饰酶的活性比较二、实验原理菠萝蛋白酶（Bromelain,EC 3.4.22.3）是从凤梨属植物菠萝中提取的一组复合的半胱氨酸巯基蛋白水解酶。

菠萝蛋白酶属于糖蛋白，分子量约为33000D，等电点为9.55，白色至浅棕黄色无定形粉末，溶于水。

水溶液无色至淡黄色，有时有乳白光，不溶于乙醇、氯仿和乙醚。

菠萝蛋白酶是典型的巯基蛋白酶，能分解蛋白质，肽，酯，酰胺。

它的水解蛋白的活性比木瓜蛋白酶的活性高十倍以上，因此有着广泛的用途。

它作为一种食品添加剂可用于肉质嫩化、啤酒澄清，还用于干酪、明胶、水解蛋白酶的生产。

在医药上它可用于生物体内溶解纤维蛋白及血凝块，因此可用于治疗水肿及多种炎症；它能迅速溶痂，对正常组织无害，不影响植皮，适用于中小面积深度烧伤的治疗。

菠萝蛋白酶的最适温度范围比较稳定，最稳定范围是55℃~65℃。

菠萝蛋白酶的最适 pH 在 7.1 左右，呈现中性。

金属盐离子中 NaCl、KCl 对酶活的影响不是很大，较高浓度的MgCl2、CaCl2对菠萝蛋白酶单宁复合物有一定程度的抑制作用，尤其在浓度较高的情况下对菠萝蛋白游离酶酶活的影响更大。

Zn2+的作用中以醋酸锌的作用更为显著，极低的浓度即能促使菠萝蛋白酶的酶活性明显提高。

较低浓度的 ZnCl2也能使酶的稳定性有所提高。

维生素 C、半胱氨酸、硫代硫酸钠、2-巯基乙醇是菠萝蛋白酶的稳定剂，都能使酶分子中巯基基团维持还原态，能够作为还原剂来提高酶活力。

0.05%的苯甲酸钠即能使氧化脱氢酶的活性得到抑制，对酶起到保护作用。

对酶活有影响的金属离子，EDTA 能通过螯合而保护菠萝蛋白酶，消除其对酶的失活作用。

其它试剂如 50%的甘油、葡萄糖、 40%的半乳糖都能使菠萝蛋白酶的半衰期延长，蔗糖、麦芽糖、棉籽糖、松三糖、乙二醇和甘露醇均对菠萝蛋白酶有一定的保护作用。

菠萝蛋白酶的提取、分离纯化及活性测定菠萝蛋白酶的提取、初步分离纯化及活性测定15食安（1）班张凯摘要：本研究运用硫酸铵沉淀法和透析法并结合考马斯亮蓝G520染色法测定菠萝皮中蛋白酶活性及蛋白质含量，得到同一品种及成熟度的菠萝皮经两种不同的纯化方法处理，菠萝皮中的蛋白酶都能被有效纯化，但是蛋白酶活性会损失一部分。

关键词：菠萝蛋白酶；透析法；分离纯化；酶活性；前言菠萝蛋白酶(bromelain)是从菠萝植株中提取的一类蛋白水解酶的总称,主要存在于菠萝茎和果实中,根据提取部位的不同,分为茎菠萝蛋白酶和果菠萝蛋白酶。

Marcano于1891年研究发现菠萝汁中含有蛋白酶。

随后,人们对菠萝蛋白酶展开了一系列研究,发现其在医药和化工领域有很好的利用价值。

1957年,Heineche等从菠萝茎中提取得到蛋白质水解酶,从而使菠萝蛋白酶实现商品化生产。

目前,菠萝蛋白酶的一些功能成分已得到成功分离,并应用于医药领域。

随着提取纯化技术的不断进步,高活性的菠萝蛋白酶将广泛应用于医药、化工和食品领域。

[1]利用菠萝皮分离纯化菠萝蛋白酶，不仅可充分利用资源，拓展菠萝蛋白酶的获取途径和应用空间，还可降低菠萝加工废料对环境的污染；随着市场对菠萝加工产品需求量的增大，对于菠萝皮的研究与利用就显得尤为重要，尤其对最主要的功能成分蛋白酶的分离、纯化与性质的研究更有意义。

[2]本文通过对菠萝皮蛋白酶的提取，初步分离纯化及活性测定进行了初步研究，探讨影响菠萝蛋白酶活性的影响因素，并解决实验存在的一些问题。

1实验材料与仪器1．1实验材料与试剂新鲜菠萝，透析袋（截留相对分子质量8 000~14 000），0.1mo1/L pH 7.8磷酸缓冲液配制（PBS），0.01mo1/L pH 7.8磷酸缓冲液配制（PBS），1％酪蛋白，激活剂[含20mmo1／L半胱氨酸-盐酸盐、1mmo1/L EDTA-Na2 (乙二胺四乙酸二钠)]，10％三氯乙酸(TCA)。

菠萝蛋白酶提取纯化及化学修饰对其活性地影响一、实验目地、掌握菠萝蛋白酶地提取和纯化方法、研究菠萝蛋白酶地稳定性、掌握菠萝蛋白酶地化学修饰并对修饰酶与未修饰酶地活性比较二、实验原理菠萝蛋白酶（）是从凤梨属植物菠萝中提取地一组复合地半胱氨酸巯基蛋白水解酶.菠萝蛋白酶属于糖蛋白，分子量约为，等电点为，白色至浅棕黄色无定形粉末，溶于水.水溶液无色至淡黄色，有时有乳白光，不溶于乙醇、氯仿和乙醚.菠萝蛋白酶是典型地巯基蛋白酶，能分解蛋白质，肽，酯，酰胺.它地水解蛋白地活性比木瓜蛋白酶地活性高十倍以上，因此有着广泛地用途.它作为一种食品添加剂可用于肉质嫩化、啤酒澄清，还用于干酪、明胶、水解蛋白酶地生产.在医药上它可用于生物体内溶解纤维蛋白及血凝块，因此可用于治疗水肿及多种炎症；它能迅速溶痂，对正常组织无害，不影响植皮，适用于中小面积深度烧伤地治疗.菠萝蛋白酶地最适温度范围比较稳定，最稳定范围是℃℃.菠萝蛋白酶地最适在左右，呈现中性.金属盐离子中、对酶活地影响不是很大，较高浓度地、对菠萝蛋白酶单宁复合物有一定程度地抑制作用，尤其在浓度较高地情况下对菠萝蛋白游离酶酶活地影响更大.地作用中以醋酸锌地作用更为显著，极低地浓度即能促使菠萝蛋白酶地酶活性明显提高.较低浓度地也能使酶地稳定性有所提高.维生素、半胱氨酸、硫代硫酸钠、巯基乙醇是菠萝蛋白酶地稳定剂，都能使酶分子中巯基基团维持还原态，能够作为还原剂来提高酶活力.地苯甲酸钠即能使氧化脱氢酶地活性得到抑制，对酶起到保护作用.对酶活有影响地金属离子，能通过螯合而保护菠萝蛋白酶，消除其对酶地失活作用.其它试剂如地甘油、葡萄糖、地半乳糖都能使菠萝蛋白酶地半衰期延长，蔗糖、麦芽糖、棉籽糖、松三糖、乙二醇和甘露醇均对菠萝蛋白酶有一定地保护作用.菠萝蛋白酶含有个巯基和个内肽二硫键.在蛋白质中 , —部分是与酶活性有关地最具有反应性地官能团，巯基能够和取代马来酰亚胺反生加成反应，可以对巯基进行修饰，验证巯基对酶催化活性地影响三、试剂材料、材料：新鲜地成熟菠萝、仪器：榨汁机、离心机、紫外分光光度计、恒温水浴锅、氯化钙地干燥器、琼脂糖凝胶柱（×）、研钵、滴管（大、小）、烧杯（大、中、小）、试管、具塞试管、白瓷板、温度计、计、搅拌棒.、试剂：单宁、苯甲酸钠溶液、溶液、氯化钠溶液、地醋酸缓冲液、醋酸缓冲液（含）、三氯乙酸溶液、盐酸、氢氧化钠、乙二醇溶液、甘露醇溶液、葡萄糖溶液、甘油溶液、柠檬酸盐缓冲液( )、乙酸顺丁烯二酰亚胺（）（.）xHAQX缓冲液：称取及，加水溶解后，定容至即得.酪氨酸溶液：精确称取℃下干燥至恒重地酪氨酸，用磷酸缓冲液定容至.酪蛋白溶液：精确称取酪蛋白，用磷酸缓冲液定容至.酶激活剂：半胱氨酸盐酸盐，, 用磷酸缓冲液定容至.蛋白酶液：精确称取菠萝蛋白酶，用磷酸缓冲液定容至.四、实验步骤.菠萝蛋白酶提取纯化. 澄清菠萝汁地制备将菠萝在清水中洗净，沥干，用压榨机压出汁液.用四层纱布挤压进行渣汁分离，获得地粗汁液再经四层纱布过滤去除纤维状物质.得到地粗滤液在℃下离心，留上清液备用.. 硫酸铵沉淀取澄清地菠萝皮汁在℃磁力搅拌作用下缓慢加入经过研磨地固体硫酸铵至饱和.当硫酸铵全部加入后要不断搅动，以使溶解地蛋白和聚集地蛋白达到平衡.将此富含酶蛋白地溶液于离心，收集沉淀并分离出上清液..透析除硫酸铵透析袋预处理：将透析袋剪成适当长度，置于含地溶液中，煮沸.用去离子水彻底清洗透析袋后，再用溶液煮沸 .冷却后，于℃保存备用.操作步骤：将商品化地透析袋适当处理后，封住一端，用纯水检查其完整性，然后将上述沉淀用少量缓冲液溶解后，装入透析袋，赶出袋中地空气，封住透析袋地另一端，放进烧杯中，下置电磁力搅拌器缓慢搅拌，℃透析过夜，对该缓冲液透析，换液次后，用溶液检测是否已被除尽.收集透析内液，离心，用于进一步上柱纯化.凝胶柱纯化离子交换介质处理与转型用初始缓冲液替换倾倒澄清掉乙醇，并用初始缓冲液配成凝胶匀浆（凝胶占，缓冲液占），作真空脱气处理备用..装柱与平衡打开层析柱顶部，关闭出口，用地醋酸缓冲液润湿层析柱柱内及柱子底端并保持一小段液位，略高出滤膜，仔细驱除底端气泡.将凝胶匀浆用玻璃棒引导边搅拌边沿着柱内壁按同一方向连续倾倒入柱内，防止空气泡地产生，同时用缓冲液填充柱子地剩余部分.打开柱下口出水口夹子，使凝胶在柱内自由沉降，装上层析柱顶端柱头，连接好洗脱液.打开蠕动泵，调节流速，让缓冲液按一定地流速通过，稳定柱子.用倍柱体积地缓冲液平衡柱子，直至流出地平衡液和初始平衡液相等时表示已达到平衡..加样略微增大层析柱出口地流速，排除凝胶床表面缓冲液.打开层析柱顶塞，用移液管将透析至无地酶蛋白溶液沿管壁从凝胶床表面上数毫米处缓慢流下.打开层析柱出口，让蛋白质样品溶液进入凝胶柱床内，待液面重合时，可用少许起始缓冲液洗柱内壁和床表面，关上层析柱出口..洗脱加样后用足够量地起始缓冲液淋洗，使未吸附地物质被洗出，并达到充分平衡，在凝胶表面缓慢滴加洗脱液，加至洗脱液表面与柱口形成凸面，加入醋酸缓冲液（含）以流速，开始洗脱，.收集将洗脱液按一定地体积分别收集于试管中，收集各吸收峰洗脱液，然后逐管进行分析，合并活性洗脱峰透析冷冻干燥保存备用..酶活性地测定标准曲线地测定于离心，取上清液，在型分光光度计上以波长下测其吸光度值，记录数据.然后以标准溶液地浓度为横坐标，紫外吸收值为纵坐标绘制标准曲线待用.样品酶活性测定于离心，取上清液，在型分光光度计上以波长下测其吸光度值，记录数据.酶活力单位定义为：在一定温度和值条件下，每分钟水解酪蛋白释放μ酪氨酸地酶量定义为个蛋白酶单位，以表示.酶稳定性研究在测定所用地酶试剂中分别加入滴缓冲液、甘油溶液、乙二醇溶液、甘露醇溶液、葡萄糖溶液，℃水浴，按地实验条件及方法测定酶活性.记录吸光度值，计算得到酶活性变化情况.溶液缓冲液甘油溶液乙二醇溶液甘露醇溶液葡萄糖溶液吸光度.酶修饰前后活性比较修饰酶地制备溶于干燥吡啶，加入琥珀酸酐，度保温，在度减压蒸馏除去溶剂.加入苯至残余物溶解，再加冷己烷，度振荡.过滤，残渣溶于蒸馏水后透析，冻干.将其与菠萝蛋白酶按配比投料，加入柠檬酸缓冲液（），度反应.产物在柠檬酸缓冲液中透析，冻干后得菠萝蛋白酶（修饰酶）.修饰与未修饰酶地活性比较按地实验条件及方法测定酶活性.记录吸光度值，计算得到酶活性变化情况.酶溶液修饰酶未修饰酶吸光度参考文献：董瑞兰. 菠萝蛋白酶地分离纯化及部分应用性质地研究[]. 福建农林大学, .李淑喜, 黎新明. 菠萝蛋白酶地提取及其在医药中地应用[]. 广州化工, , ().田国贺, 郭佳宓, 吕团伟,等. 聚乙二醇对菠萝蛋白酶地化学修饰[]. 生物技术, , ().。

菠萝蛋白酶‎的制备及活‎性测定背景菠萝蛋白酶‎(Brome‎l ain)，别名菠萝酶‎，是存在于菠‎萝(Anana‎COmOS‎l2S)植株中的蛋‎白质水解酶‎，为浅黄色无‎定形粉末，微有异臭。

菠萝的果、茎、柄和叶片中‎都含有菠萝‎蛋白酶。

一般从菠萝‎果中提取的‎称为果菠萝‎蛋白酶，从菠萝皮、茎中提取的‎为茎菠萝蛋‎白酶。

八成熟的菠‎萝果汁含有‎约0．4％的菠萝蛋白‎酶，成熟的菠萝‎果汁含有O‎．3％左右的菠萝‎蛋白酶，茎汁含8．7％的菠萝蛋白‎酶(Murac‎h i，et a1．，1964)。

1981年‎，Marca‎n o首先发‎现菠萝汁中含‎有蛋白水解‎酶，随后Wil‎l stat‎t er，Bergm‎a nn和M‎a rtin‎相继指出，菠萝蛋白酶‎存在于果、皮和茎部中‎，存在于茎部‎的称为茎酶‎(Stemb‎r omel‎a in E．C．3．4．22．4)，存在于果汁‎中的酶称为‎果酶(Fruit‎brome‎l ainE‎．C．3．4．22．5)。

Murac‎h i和Ne‎u rath‎、E1．G harba‎w i和Wh‎i take‎r采取层析‎法分离提取‎了菠萝蛋白‎酶并研究了‎它的活性成‎分。

结构特性研‎究表明，果菠萝蛋白‎酶是酸性酶‎，等电点为p‎H4．6，茎菠，约为33，000，等电点为p‎H9．5，其活性中心‎的氨基酸顺‎序和催化机‎理与木瓜蛋‎白酶相似，并确定茎菠‎萝蛋白酶为‎糖蛋白。

Ota S et aL研究指‎出，茎菠萝酶分‎子量为36‎000，末端氨基酸‎残基是丙氨‎酸，果酶分子量‎为3000‎0，末端氨基酸‎残基也为丙‎氨酸，碳水化合物‎分析与Mu‎r acll‎i 的分析结‎果相似。

1988年‎，T．L．迈诺特等由‎十二烷基硫‎酸钠．聚丙烯胺凝‎胶电泳(SDS．PAGE)测定果菠萝‎蛋白酶分子‎量2220‎0．25080‎，等电点3．8~4．8。

菠萝蛋白酶‎是各种酶的‎混合物，已知菠萝蛋‎白酶粗品中‎包含至少五‎种蛋白水解‎酶，也包含非蛋‎白水解酶，包括酸性磷‎酸酶和过氧‎化物酶，并含有淀粉‎酶和纤维素‎酶活性，还存在其他‎成分。

菠萝蛋白酶的提取纯化及化学修饰对其活性的影响实验目的学习菠萝蛋白酶的提取纯化方法，学习酶活力的测定原理及方法，了解影响菠萝蛋白酶活性的因素。

实验原理菠萝蛋白酶是一种典型的巯基蛋白酶，相对分子质量为3.3*107，等电点为9.55，能分解蛋白质、肽、脂质和酰胺。

蛋白质在水溶液中的溶解度由蛋白质周围亲水基团与水形成水化膜的程度及蛋白质分子所带电荷的情况决定的，当加入硫酸铵后，由于盐离子对水的亲和力大于蛋白质，于是蛋白质分子周围的水化膜被破坏，同时其表面的电荷被盐离子中和，导致蛋白质溶解度下降，从而从溶液中沉淀析出。

粗品中的硫酸根离子可由透析的方法除去，铵根离子可由CM琼脂糖FF 层析柱除去。

菠萝蛋白酶活力定义为在特定条件下（pH7.0，37℃），每分钟水解酪蛋白生成1 μg酪氨酸所需的菠萝蛋白酶的量规定为1个酶活力单位，以U/g表示。

根据紫外吸光度（275nm处）建立标准曲线，确定水解产生的酪氨酸含量，从而计算出酶活力。

菠萝蛋白酶活性依靠巯基维持，文献资料显示，含多羟基化合物对巯基具有保护作用，因此通过向菠萝蛋白酶中加入甘油、乙二醇、甘露醇以及葡萄糖，探究验证这类有机物的保护作用。

而N-乙酸马酰亚胺（NEM）是巯基修饰剂，因此可以利用NEM 验证菠萝蛋白酶中的半胱氨酸残基为其酶活性所必需。

实验仪器和试剂材料：菠萝汁（菠萝榨汁后用纱布过滤得澄清溶液）仪器：烧杯、玻璃棒、离心机、离心管、滴管、透析袋、恒温水浴锅、冰箱、电炉、磁力搅拌器、凝胶柱、试管、白瓷板试剂：纯化水，硫酸铵，1mmol/L EDTA的2% NaHCO3溶液，1mmol/L EDTA溶液，1%BaCl2溶液，磷酸缓冲溶液（称取KH2PO4 2.69g以及K2HPO4 13.97g，加水溶解后定容至1000mL，pH7.4 实验中需要大量该溶液），CM琼脂糖FF凝胶，20%乙醇溶液，洗脱液：1M NaC-20mM pH4.0 含0.01% EDTA醋酸缓冲液（取2M醋酸钠溶液13ml与2M醋酸溶液87mL，加入含铜1mg/mL的硫酸铜溶液0.5mL，加入0.1g EDTA，再加水稀释至1000ml），双缩脲试剂（取1.50g CuSO4·5H2O，6.0g酒石酸钠，加水约500ml溶解后加入300ml 10% NaOH，用水配成1L），酪氨酸标准液（精确称取105℃下干燥至恒重的酪氨酸5mg，用pH7.4磷酸缓冲溶液定容至100ml ），酶激活剂（20mmol/L L-半胱氨酸盐酸盐，1mmol/L EDTA-Na，用磷酸溶液定容至100ml），酪蛋白溶液（精确称取酪蛋白5mg，用磷酸缓冲液定容至100ml），三氯醋酸溶液（取三氯乙酸1.8 g，无水醋酸钠2.99 g，冰醋酸液1.9 mL，加水溶液并稀释至100 mL），50%甘油溶液，50%乙二醇溶液，50%甘露醇溶液，50%葡萄糖溶液，NEM，吡啶，苯，己烷，0.1M pH4.6 柠檬酸缓冲溶液（0.1M柠檬酸溶液10.3ml，0.1M柠檬酸钠溶液9.7ml）实验方法1 菠萝蛋白酶的提取在5~8℃下硫酸铵少量多次加入菠萝汁形成饱和溶液，搅拌30min，离心（11000g，20min，4℃），弃去上清液，得粗酶固体。

菠萝蛋白酶的提取纯化及化学修饰对其活性的影响一、实验目的1、掌握从原料物中提取活化分离菠萝蛋白酶的方法。

2、学习酶活力测定的方法。

3、了解某些因素对菠萝中菠萝蛋白酶热稳定性的影响。

4、掌握用聚乙二醇对菠萝蛋白酶进行化学修饰的原理。

5、比较修饰酶与未修饰酶的活力。

二、实验原理菠萝蛋白酶(Bromelain，简称菠萝酶，亦称为凤梨酶或凤梨酵素)是从菠萝果茎、叶、皮提取出来，经精制、提纯、浓缩、酶固定化、冷冻干燥而得到的一种纯天然植物蛋白酶。

分子量为33 000 , 等电点为，白色至浅棕黄色无定形粉末，溶于水。

水溶液无色至淡黄色，有时有乳白光，不溶于乙醇、氯仿和乙醚。

属糖蛋白，能分解蛋白质、脂类和酰胺等。

品质最佳的菠萝蛋白酶是利用菠萝的中茎加工,采用超滤方法进行过滤浓缩,低温冷冻干燥而得的。

它作为一种食品添加剂可用于肉质嫩化、啤酒澄清. 还用于明胶、水解蛋白的生产,在医药上它可在生物体内溶解纤维蛋白及血凝块。

因此可以治疗水肿及多种炎症,它能迅速溶痂。

对正常组织无害,不影响植皮,适用于中小面积深度烧伤的治疗。

1、本实验先从新鲜的菠萝汁中使用单宁沉淀法提取出菠萝蛋白酶，菠萝蛋白酶将酪蛋白水解产生酪氨酸，通过测定吸光度的变化，可以测得菠萝蛋白酶的活力。

2、本实验采用离子交换技术纯化菠萝蛋白酶。

与化学方法相比，它分离条件温和，不引起分子结构的变化。

它用于纯化菠萝蛋白酶的关键问题是选择合适的交换树脂及相应的交换条件。

3、菠萝蛋白酶活性单位的定义：一个酶活力单位（U）定义为特定条件下[，(37±1℃)]酶作用于干酪素底物1min产生1μg酪氨酸所需的酶量。

菠萝蛋白酶将酪蛋白分解，生成在三氯乙酸溶液中不沉淀的多肽，并在275 nm处有吸收峰，除去未被消化的酪蛋白，用分光光度计(275 nm)测定溶液中所含肽的数量。

菠萝蛋白酶酶活计算公式参照何铁剑的方法 [91]。

每毫升酶液活性单位（U/ml）=A-A0/Aw×M 标×V/t×样品稀释倍数/供测体积式中：( A - A0) 为275nm 波长下待测酶液与对照的光密度差值；Aw 指以水为对照，275nm 波长下50μg/mL 标准酪氨酸光密度值；M 标为标准酪氨酸溶液浓度；V 为反应体系总体积（mL）；t 为反应时间10min。

菠萝蛋白酶提取纯化及化学修饰对其活性的影响中国药科大学药学院 09级药化一、实验目的1、了解菠萝蛋白酶的提取方法2、研究菠萝蛋白酶的稳定性3、了解菠萝蛋白酶的纯化4、了解菠萝蛋白酶的化学修饰5、修饰酶与未修饰酶的活性比较二、实验原理菠萝蛋白酶是典型的巯基蛋白质,广泛存在于菠萝果实、芽、叶、茎中,分子量为33 000 , 等电点为9.55，白色至浅棕黄色无定形粉末，溶于水。

水溶液无色至淡黄色，有时有乳白光，不溶于乙醇、氯仿和乙醚。

属糖蛋白，能分解蛋白质、脂类和酰胺等。

它作为一种食品添加剂可用于肉质嫩化、啤酒澄清. 还用于明胶、水解蛋白的生产,在医药上它可在生物体内溶解纤维蛋白及血凝块。

因此可以治疗水肿及多种炎症,它能迅速溶痂。

对正常组织无害,不影响植皮,适用于中小面积深度烧伤的治疗。

本实验先从新鲜的菠萝汁中使用有机酸（单宁）沉淀法提取菠萝蛋白酶，糖类、多元醇使得酶的稳定性得到增强。

三、实验材料1、材料：新鲜的成熟菠萝2、仪器：榨汁机、离心机、紫外分光光度计、恒温水浴锅、氯化钙的干燥器、CM Sepharose FF 凝胶（1.1cm×30.0cm）、研钵、滴管（大、小）、烧杯（大、中、小）、试管、具塞试管、白瓷板、温度计、PH计、搅拌棒3、试剂：0.2%单宁、5 %苯甲酸钠溶液、0. 1 %/0.5%EDTA 溶液、1. 5%氯化钠溶液、0. 5%乙酸锌溶液、0.06 %抗坏血酸溶液、0. 5%硫代硫酸钠、1 %L - 半胱氨酸溶液、20mM pH4.0 的醋酸缓冲液、1MNaCl~20mM pH4.0 醋酸缓冲液（含0.01%EDTA）、双缩脲试剂、pH7.0 的干酪素溶液、酶液激活液（pH4.5 ，L-cys 和EDTA-2Na 配制）、三氯乙酸溶液、标准酪蛋白试剂、0.1M盐酸、0.1M氢氧化钠、50%乙二醇、50%甘露醇、50%葡萄糖、50%甘油、O．1mol/L 柠檬酸盐缓冲液(pH 3．0)、NEM四、实验过程1、提取：菠萝洗净榨汁。

菠萝蛋白酶的提取、初步分离纯化及活性测定14食安（5）班马俊宇201430520516摘要：本次实验通过对菠萝皮中存在的菠萝蛋白酶进行粗提取、盐析和透析从而纯化和分离；并采用考马斯亮蓝法测定提取液中蛋白质的含量，利用菠萝蛋白酶水解酪蛋白后的水解产物酪氨酸，在280nm处吸光值的高低，判断酶活性的大小。

从实验结果看出，纯化程度越高，提取液中蛋白质的含量先降低，后升高。

同时，实验测得菠萝蛋白酶的比活力、回收率随纯化程度的提高而先升高后降低。

关键词：菠萝蛋白酶纯化酶活性蛋白质含量前言菠萝蛋白酶主要分布于菠萝的茎和果实中，能分解蛋白质、肽、脂和酰胺，具有较高的生物活性，在各个生产领域中得到广泛的应用[1]。

在食品工业中菠萝蛋白酶作为一种食品添加剂，能分解蛋白质、肽、酯和酰胺等，可用于肉质嫩化、水解蛋白、啤酒澄清、干酪生产等。

菠萝蛋白酶来可以用来增加豆饼和豆粉的PDI值和NSI值，从而生产出可溶性蛋白制品及含豆粉的早餐、谷类食物和饮料。

其它还有生产脱水豆类、婴儿食品和人造黄油；澄清苹果汁；制造软糖；为病人提供可消化的食品；给日常食品添味等。

在医药上它可以治疗水肿及多种炎症，并有助消化，健胃消食等功能[2]。

菠萝萝蛋白酶 p H 在 4.0~5.5处于较稳定的状态，在中性环境中酶活保持最高，在偏酸环境下酶活下降较快，碱性环境能延缓失活[3]。

本实验研究粗提取、盐析和透析所得到的菠萝蛋白酶提取液中的蛋白质含量、酶活性高低、回收率和纯化倍数等，对酶的纯化情况进行研究。

1 实验材料与仪器1．1 实验材料与试剂新鲜菠萝（3个），盐析粗提液（PBS），酪蛋白试剂，激活剂，三氯乙酸(TCA)，透析袋，牛血清蛋白，考马斯亮蓝，乙醇1．2 实验仪器电子天平，台式天平，恒温水浴锅，冰箱，高速离心机，分光光度计，研钵，烧杯，量筒，容量瓶，移液管，漏斗，漏斗架，滤纸，试管，试管架，滴管，玻璃棒，纱布，洗耳球，标签纸，橡皮筋DS-1型高速组织捣碎机：上海标本模型厂HZS-H型水浴振荡器：哈尔滨市东联电子技术开发有限公司2 实验方法2．1 菠萝蛋白酶的粗酶提取称取菠萝皮材料20g，将菠萝皮在清水中洗净，沥干，切成小段后置于超高速搅拌机中，加入约60mL预冷的0.1mo1/L pH 7.8 PBS，持续搅拌10~15min 至粉碎，搅拌完成后用4层纱布过滤，得到滤液后，用冷冻离心机于4°C 3000rpm离心6min，弃沉淀，即得到菠萝蛋白酶粗提液，测定粗提液的体积、蛋白质含量和酶活性。

菠萝蛋白酶的提取纯化工艺研究梁 雪，方欢乐，刘建利（西安培华学院 医学院，陕西西安 710199）摘 要：为降低环境污染，提高菠萝蛋白酶的附加值以及延长菠萝的产业链，以菠萝废弃物为原料，采用盐析浓缩-透析提纯-乙醇有机溶剂沉淀相结合的方法提取菠萝蛋白酶。

实验考察料液比、缓冲液温度、搅拌时间、缓冲液pH值、盐析浓度以及透析时间对菠萝蛋白酶酶活性和酶活回收率的影响。

结果表明，菠萝蛋白酶的最佳工艺条件为料液比1.0∶1.5（m∶v）、缓冲液温度30 ℃、搅拌时间40 min、缓冲液pH值7、盐析浓度30%和透析时间28 h，该条件下菠萝蛋白酶酶活回收率为68.45%。

关键词：菠萝蛋白酶；盐析法；透析提纯；有机溶剂沉淀Study on Extraction and Purification of BromelainLIANG Xue, FANG Huanle, LIU Jianli(Medical College, Xi’an Peihua University, Xi’an 710199, China)Abstract: In order to reduce environmental pollution, increase the added value of bromelain, and extend the industrial chain of pineapple, a method combining salt precipitation concentration dialysis purification ethanol organic solvent precipitation was used to extract bromelain from pineapple waste as raw material. The experiment investigated the effects of material liquid ratio, buffer temperature, stirring time, buffer pH value, salting out concentration, and dialysis time on bromelain enzyme activity and enzyme recovery rate. The results showed that the optimal process conditions for bromelain were material to liquid ratio of 1.0∶1.5（m∶v）, buffer temperature of 30 ℃, stirring time of 40 minutes, buffer pH of 7.0, salt out concentration of 30%, and dialysis time of 28 hours. Under these conditions, the recovery rate of bromelain enzyme activity was 68.45%.Keywords: bromelain; salting out; dialysis purification; organic solvent precipitation菠萝蛋白酶为白色至淡棕黄色无定形粉末，是我国目前大规模生产的植物蛋白酶之一[1]。

实验一菠萝蛋白酶的初级纯化及鉴定一、目的：系统地学习和掌握蛋白质分离纯化技术的原理及实验技术。

熟练掌握饱和硫酸铵沉淀法、透析法、测定蛋白质含量、蛋白酶活性检测等实验技术。

二、原理：要研究某种蛋白质的结构和功能，生产高生物活性的蛋白类激素、酶等，第一步工作就是从复杂的混合体系中分离（ Separation ）出蛋白质并且进行纯化（ Purification ）分析。

1 蛋白质分离纯化的一般程序：•选择一种目的蛋白质含量丰富、稳定性好的样品材料。

•将蛋白质从样品中抽提出来。

•确定分离纯化的方法，使粗品的纯度达到预定要求。

•建立灵敏、特异、精确的检测手段，分步测定蛋白质的含量，检验蛋白质的纯度。

•在操作、分析过程中注意保护蛋白质的稳定性，防止变性。

2 蛋白质的分离纯化方法：利用溶解度不同的分离纯化方法有：盐析法、等电点沉淀法、有机溶剂沉淀法、聚乙二醇沉淀法等。

盐析法是粗分离蛋白质的重要方法之一。

在稀盐溶液中，蛋白质的溶解度随盐浓度的增加而升高，这种现象称为盐溶（ Salting in ）。

但当盐浓度增加到一定量时，其溶解度又逐渐下降，直到某一浓度时便从溶液中沉出，即为盐析。

这是因为蛋白质分子吸附某种盐离子后，其带电表层使蛋白质分子彼此排斥，而蛋白质分子与水分子间的相互作用却加强，因而溶解度提高。

但当大量中性盐加入，使水的活度降低，进而导致蛋白质分子表面电荷逐渐被中和，水化膜逐渐被破坏，最终引起蛋白质分子间相互聚集并从溶液中析出。

用于盐析的中性盐通常有硫酸铵、硫酸钠和硫酸镁等，而以硫酸铵为最佳，它在水中溶解度大而温度系数小（在 25 ℃时，溶解度为 767g/L ；在 0 ℃时，溶解度为 697g/L ） , 分离效果好，能保持蛋白质的天然构象，且价廉可得。

不同蛋白质盐析时所需盐浓度不同，故调节盐浓度可适当地将蛋白质分开。

如鸡蛋清中的球蛋白在半饱和硫酸铵溶液中沉淀，清蛋白在饱和硫酸铵中沉淀。

对于含有多种蛋白质或酶的混合液，可采取分段盐析的方法进行纯化。

菠萝蛋⽩酶纯化⽅法总结菠萝蛋⽩酶的提取⽅法：（1）沉淀法沉淀法是粗提酶蛋⽩的⽅法之⼀，主要⽤于前期酶的初步分离和浓缩，常⽤的⽅法有盐析法，有机溶剂沉淀法，聚⼄⼆醇沉淀法，等电点沉淀法等。

⽤新型吸附洗涤沉淀法和单宁沉淀法也可以提取菠萝蛋⽩酶，操作简单，产率也较⾼，但酶的产量与单宁的⽤量密切相关，⽽且所含单宁有毒，导致这种⽅法逐渐被淘汰了。

以酒精为沉淀剂提取菠萝蛋⽩酶时，酒精的加⼊量会对菠萝蛋⽩酶产⽣较⼤的影响，酒精的浓度太低时，不能使菠萝蛋⽩酶沉淀下来，浓度太⾼容易使酶变性失活。

酒精的浓度为80%时，酶的收率最⾼。

从茶叶中提取的多酚类物质茶多酚也可⽤于菠萝蛋⽩酶的分离，⽤0.5%的茶多酚提取物对菠萝汁中菠萝蛋⽩酶进⾏沉淀最多可达78%，其最⼤沉淀率明显⽐单宁法⾼。

（2）离⼦交换⾊谱法离⼦交换⾊谱层析法是蛋⽩质研究领域内⽐较⾼效的纯化技术，⽬前国外⽤于分离菠萝蛋⽩酶常⽤的离⼦交换剂有Sephacryl S-200柱、Mono S阳离⼦交换剂、S-Sepharose、弱酸性阳离⼦交换树脂、CM-纤维素阳离⼦交换柱、Q阴离⼦交换柱。

国内常⽤的有羧甲基纤维素（CMC）、⼆⼄胺⼄基纤维素（DEAE），酶的纯化过程通常是将若⼲⾊谱纯化技术联合使⽤来实现的。

Ota最早⽤SephadexG-75结合CM-SephadexC-25柱层析分离得到5种茎酶的组分。

⽤DEAE-52离⼦交换柱层析结合Sephadex G-75分⼦筛柱层析⾊谱法纯化果酶，能获得⽐活⼒为12.5U/mg的单⼀电泳纯酶制剂。

（3）固定化⾦属离⼦亲和⾊谱法固定化⾦属离⼦亲和⾊谱法是以普通凝胶作为载体，连接上合适的螯合配体和⾜够暴露的⾦属离⼦，制成亲和吸附剂，进⾏分离纯化蛋⽩质的⽅法。

此法介于⾼特异性的⽣物亲和分离法和低特异性的离⼦交换⾊谱法之间，对组氨酸基团有特异性。

Huali Nie 等（2008）⾸次应⽤固定化⾦属亲和膜（IMAM）—肽-尼龙膜，这是⼀种将七肽共价固定到复合膜上作为配体的新型尼龙膜，⽤其从菠萝中分离和提纯菠萝蛋⽩酶，可使菠萝蛋⽩酶纯化15.4 倍，回收率达94.6%，⽽且不会造成任何变性。