菠萝蛋白酶的提取、初级纯化及活性鉴定
- 格式：ppt
- 大小：339.00 KB
- 文档页数：16
下载文档原格式
合集下载
菠萝蛋白酶的提取实验报告
菠萝蛋白酶的提取、初步分离纯化及活性测定12食安2班陈志廉摘要本文阐述了通过运用高速离心法提取粗酶，盐析分离提纯，透析除杂等方法提取出了菠萝蛋白酶并将其初步分离纯化且测定了各个步骤的酶活性的过程。
关键词菠萝蛋白酶纯化酶活性前言菠萝蛋白酶（Bromelain，EC3.4.22.3）简称菠萝酶，是从凤梨属植物菠萝中提取的一组复合的半胱氨酸巯基蛋白水解酶，1891年Mercaro于菠萝的汁中首先发现。
在食品工业中菠萝蛋白酶作为一种食品添加剂，能分解蛋白质、肽、酯和酰胺等，可用于肉质嫩化、水解蛋白、啤酒澄清、干酪生产等。
菠萝蛋白酶来可以用来增加豆饼和豆粉的PDI值和NSI值，从而生产出可溶性蛋白制品及含豆粉的早餐、谷类食物和饮料。
其它还有生产脱水豆类、婴儿食品和人造黄油；澄清苹果汁；制造软糖；为病人提供可消化的食品；给日常食品添味等。
在医药上它可以治疗水肿及多种炎症，并有助消化，健胃消食等功能。
菠萝蛋白酶属于糖蛋白，是由巯基蛋白酶和非蛋白酶组分构成的复杂复合物，因含有一个不稳定的游离巯基，所以菠萝蛋白酶极易被氧化而使其酶活下降。
本文主要验证了从新鲜菠萝皮中提取菠萝蛋白酶并将之纯化的方法，以求改进工艺等。
1实验材料与仪器1.1实验材料与试剂新鲜菠萝、0.1mo1/L pH7.8磷酸缓冲液（PBS）、0.01mo1/L pH7.8磷酸缓冲液（PBS）、1％酪蛋白、激活剂、10％三氯乙酸(TCA)、牛血清白蛋白、考马斯亮蓝G2501.2实验仪器722型可见光分光光度计：上海舜宇恒平科学仪器有限公司；752型光栅分光光度计：北京光学仪器厂；TDL-60B台式离心机：上海安宁科学仪器厂；D5M离心机：长沙湘智离心机仪器有限公司；DK-8D电热恒温水浴锅：上海森信实验仪器有限公司；可控硅恒温水浴锅：上海锦屏仪器仪表有限公司；AMPUT电子天平：深圳安普特科技有限公司；BS110S分析天平北京赛多利斯天平有限公司；DS-1型高速组织捣碎机：上海标本模型厂；HZS-H型水浴振荡器：哈尔滨市东联电子技术开发有限公司2实验方法2．1菠萝蛋白酶的粗酶提取称取菠萝皮材料30g，将菠萝皮在清水中洗净，沥干，切成小段后置于超高速搅拌机中，加入约60mL预冷的0.1mo1/L pH7.8PBS，持续搅拌10~15min至粉碎，搅拌完成后用4层纱布过滤，得到滤液后，用冷冻离心机于4°C3000rpm 离心6min，弃沉淀，即得到菠萝蛋白酶粗提液，测定粗提液的体积、蛋白质含量和酶活性。
菠萝蛋白酶的提取、初级纯化及活性鉴定
2、测酶活试剂 （1）1%酪蛋白（pI4.8）：200ml。
用0.1 mol/L PBS pH7.8配，50-55℃水浴溶解，不停搅 拌，需1h才能溶解。 2g酪蛋白+200ml PBS（0.1 mol/L pH7.8）。
（2）激活剂 100ml（现配现用）
20 mmol/L半胱氨酸-盐酸盐，1 mmol/L EDTA-Na，用 0.1 mol/L pH7.8 PBS配制至100ml。
2、蛋白质的分离纯化方法：
(一)沉淀法 • 盐析法、等电点沉淀法、有机溶剂沉淀法、聚 乙二醇（PEG）沉淀法等。
• 在稀盐溶液中，蛋白质的溶解度随盐浓度的增加而升 高，这种现象称为盐溶。 • 但当盐浓度增加到一定量时，其溶解度又逐渐下降， 直到某一浓度时便从溶液中沉出，即为盐析。
•一般进行蛋白质沉淀时，选用的盐是硫酸铵。 优点： ①溶解度大，对温度不敏感； ②分级效果好； ③有稳定蛋白质结构的作用； ④价格低廉。 缺点：盐浓度含量高。
（3）5%TCA（三氯乙酸）：200ml。
3、透析袋处理 • 将10 cm长的透析袋置于1000ml含1mmol/L EDTA-Na2的2%碳酸氢钠溶液中煮沸10min后，用 干净镊子取出，经蒸馏水煮沸、漂洗，即可使用。
四.实验步骤
1、粗酶提取 生菠萝皮（每一组） 30g+50ml PBS 0.1 mol/L pH7.8 ↓ 电动搅拌 ↓ 2～4层纱布过滤于烧杯中 ↓ 分装于离心管（10ml/管） ↓
2、酶活测定方法（每组）
试剂 TCA(ml) 酪蛋白（ml） 酶液（ml） 激活剂（ml） TCA(ml) A275石英比色杯 酶活（U） 酶活（U）平均 值 0 0 对照(调零) 3 1 0.1 0.9 实验1 — 1 0.1 0.9 3 静置 5min 滤纸过滤 实验2 — 1 0.1 0.9 3 实验3 — 1 0.1 0.9 3
菠萝蛋白酶的提取纯化及化学修饰对其活性的影响
菠萝蛋白酶的提取纯化及化学修饰对其活性的影响一．实验目的与要求（1）掌握菠萝蛋白酶的制备与纯化的基本原理和方法（2）掌握菠萝蛋白酶活力测定方法（3）菠萝蛋白酶的稳定性研究（4）菠萝蛋白酶的修饰（5）比较修饰酶与未修饰酶的活力二．实验原理菠萝蛋白酶是典型的巯基蛋白质,广泛存在于菠萝果实、芽、叶、茎中,分子量为33000,能分解蛋白质、肽、脂和酰胺等。
它的水解活性较木瓜酶高10倍以上。
因此有广泛的用途。
它作为一种食品添加剂可用于肉质嫩化、啤酒澄清。
还用于胶、水解蛋白的生产,在医药上它可在生物体内溶解纤维蛋白及血凝块。
因此可以治疗水肿及多种炎症,它能迅速溶痂。
对正常组织无害,不影响植皮,适用于中小面积深度烧伤的治疗。
在稀盐溶液中，蛋白质的溶解度随盐浓度的增大而增大，这种现象称为盐溶。
当盐浓度增加到一定量时，其溶解度又逐渐减小，直至在溶液中沉降出来，即为盐析。
加入中性盐后，由于中性盐对水分子的亲和力大于蛋白质，于是蛋白质分子周围的水化膜层减弱乃至消失。
同时，中性盐加入蛋白质溶液后，由于离子强度发生改变，蛋白质表面电荷大量被中和，更加导致蛋白溶解度降低，使蛋白质分子之间相互聚焦而沉淀。
凝胶层析是广泛应用于蛋白质、酶、和核酸等生物高分子分离分析的有效方法之一，它是以被分离物质的分子量差异为基础的一种层析方法。
分子量大于允许进入凝胶“网眼”的范围的物质完全被凝胶排阻，随洗脱液先流出层析液，分子量小的物质较晚地流出柱。
本实验采用葡聚糖凝胶Sephadex G-75作为固相载体，它适用于1500-30000之间的多肽与蛋白质的分离。
Folin-酚试剂法所用的试剂由两部分组成。
试剂甲相当于双缩脲试剂，可与蛋白质中的肽键起显色反应。
试剂乙（磷钨酸和磷钼酸混合液）在碱性条件下极不稳定，易被酚类化合物还原而呈蓝色，由于蛋白质（或多肽）中含有带酚基的酪氨酸，故有此呈色反应。
蓝色深浅与蛋白质浓度相关，在一定浓度范围内呈线性关系，因此可作比色法测定。
菠萝蛋白酶提取纯化及化学修饰对其活性的影响
菠萝蛋白酶提取纯化及化学修饰对其活性的影响一、实验目的1、掌握菠萝蛋白酶的提取和纯化方法2、研究菠萝蛋白酶的稳定性3、掌握菠萝蛋白酶的化学修饰并对修饰酶与未修饰酶的活性比较二、实验原理菠萝蛋白酶（Bromelain,EC 3.4.22.3）是从凤梨属植物菠萝中提取的一组复合的半胱氨酸巯基蛋白水解酶。
菠萝蛋白酶属于糖蛋白，分子量约为33000D，等电点为9.55，白色至浅棕黄色无定形粉末，溶于水。
水溶液无色至淡黄色，有时有乳白光，不溶于乙醇、氯仿和乙醚。
菠萝蛋白酶是典型的巯基蛋白酶，能分解蛋白质，肽，酯，酰胺。
它的水解蛋白的活性比木瓜蛋白酶的活性高十倍以上，因此有着广泛的用途。
它作为一种食品添加剂可用于肉质嫩化、啤酒澄清，还用于干酪、明胶、水解蛋白酶的生产。
在医药上它可用于生物体内溶解纤维蛋白及血凝块，因此可用于治疗水肿及多种炎症；它能迅速溶痂，对正常组织无害，不影响植皮，适用于中小面积深度烧伤的治疗。
菠萝蛋白酶的最适温度范围比较稳定，最稳定范围是55℃~65℃。
菠萝蛋白酶的最适 pH 在 7.1 左右，呈现中性。
金属盐离子中 NaCl、KCl 对酶活的影响不是很大，较高浓度的MgCl2、CaCl2对菠萝蛋白酶单宁复合物有一定程度的抑制作用，尤其在浓度较高的情况下对菠萝蛋白游离酶酶活的影响更大。
Zn2+的作用中以醋酸锌的作用更为显著，极低的浓度即能促使菠萝蛋白酶的酶活性明显提高。
较低浓度的 ZnCl2也能使酶的稳定性有所提高。
维生素 C、半胱氨酸、硫代硫酸钠、2-巯基乙醇是菠萝蛋白酶的稳定剂，都能使酶分子中巯基基团维持还原态，能够作为还原剂来提高酶活力。
0.05%的苯甲酸钠即能使氧化脱氢酶的活性得到抑制，对酶起到保护作用。
对酶活有影响的金属离子，EDTA 能通过螯合而保护菠萝蛋白酶，消除其对酶的失活作用。
其它试剂如 50%的甘油、葡萄糖、 40%的半乳糖都能使菠萝蛋白酶的半衰期延长，蔗糖、麦芽糖、棉籽糖、松三糖、乙二醇和甘露醇均对菠萝蛋白酶有一定的保护作用。
菠萝蛋白酶的提取与活力测定
11
底物溶液（35℃） 酶溶液（35℃）
菠萝蛋白酶活力的测定
主值 2.5ml 2.5ml
混合，在35℃精确保温10min，加
空白值
2.5ml ——
蛋白质凝固剂 酶溶液
5.0ml —在水浴中继续静置30min，然后过滤；用分光光度计（275nm）以空白值为参比测定吸光 度
4
二、菠萝蛋白酶在医药、保健品
• 1、抑制肿瘤细胞的生长 • 2、对心血管疾病的防治 • 3、用于烧伤脱痂 • 4、消炎作用
业的应用
5
菠萝蛋白酶的作用条件
• 最佳温度： 53±1℃
•
失活温度： ≥65℃
•
最佳PH值： 5.0～8.0
•
失活PH值： 小于3.0和大与9.5
•
推荐用量: 0.05～0.1%对蛋白质计
（一）从菠萝中提取菠萝蛋白酶 操作步骤：
超滤浓缩
加Vc,0.2%单宁溶液 搅拌15min,静置40min 4200r/min,5min离心
将下脚料切碎
加柠檬酸钠，榨汁 菠萝汁
冻存备用
纱布过滤 澄清液
2000r/min，7min离心
酶复合物沉淀（蛋 白糊酶）
离液加 心，适
量
1.5% 4000r/min,7min
上清液 沉淀物
加100ml0.1%EDTA溶液， 200ml1.5%氯化钠液
4200r/min,5min离心
氯 化 钠 溶
酶复合物 10
在提取菠萝蛋白酶时,添加单宁溶液的浓度为0. 2 %沉淀蛋白的效果最好,同时 果汁的总酸度不大,糖酸比合适,菠萝汁中菠萝蛋白酶的沉淀率达到72%。菠萝蛋 白酶提取时,pH值为6. 5～8.5左右,温度为6 0℃,菠萝蛋白酶的活性最强 ,可作为最 佳提取条件。
底物溶液（35℃） 酶溶液（35℃）
菠萝蛋白酶活力的测定
主值 2.5ml 2.5ml
混合，在35℃精确保温10min，加
空白值
2.5ml ——
蛋白质凝固剂 酶溶液
5.0ml —在水浴中继续静置30min，然后过滤；用分光光度计（275nm）以空白值为参比测定吸光 度
4
二、菠萝蛋白酶在医药、保健品
• 1、抑制肿瘤细胞的生长 • 2、对心血管疾病的防治 • 3、用于烧伤脱痂 • 4、消炎作用
业的应用
5
菠萝蛋白酶的作用条件
• 最佳温度： 53±1℃
•
失活温度： ≥65℃
•
最佳PH值： 5.0～8.0
•
失活PH值： 小于3.0和大与9.5
•
推荐用量: 0.05～0.1%对蛋白质计
（一）从菠萝中提取菠萝蛋白酶 操作步骤：
超滤浓缩
加Vc,0.2%单宁溶液 搅拌15min,静置40min 4200r/min,5min离心
将下脚料切碎
加柠檬酸钠，榨汁 菠萝汁
冻存备用
纱布过滤 澄清液
2000r/min，7min离心
酶复合物沉淀（蛋 白糊酶）
离液加 心，适
量
1.5% 4000r/min,7min
上清液 沉淀物
加100ml0.1%EDTA溶液， 200ml1.5%氯化钠液
4200r/min,5min离心
氯 化 钠 溶
酶复合物 10
在提取菠萝蛋白酶时,添加单宁溶液的浓度为0. 2 %沉淀蛋白的效果最好,同时 果汁的总酸度不大,糖酸比合适,菠萝汁中菠萝蛋白酶的沉淀率达到72%。菠萝蛋 白酶提取时,pH值为6. 5～8.5左右,温度为6 0℃,菠萝蛋白酶的活性最强 ,可作为最 佳提取条件。
菠萝蛋白酶的提取、分离纯化及活性测定
菠萝蛋白酶的提取、分离纯化及活性测定菠萝蛋白酶的提取、初步分离纯化及活性测定15食安（1）班张凯摘要：本研究运用硫酸铵沉淀法和透析法并结合考马斯亮蓝G520染色法测定菠萝皮中蛋白酶活性及蛋白质含量，得到同一品种及成熟度的菠萝皮经两种不同的纯化方法处理，菠萝皮中的蛋白酶都能被有效纯化，但是蛋白酶活性会损失一部分。
关键词：菠萝蛋白酶；透析法；分离纯化；酶活性；前言菠萝蛋白酶(bromelain)是从菠萝植株中提取的一类蛋白水解酶的总称,主要存在于菠萝茎和果实中,根据提取部位的不同,分为茎菠萝蛋白酶和果菠萝蛋白酶。
Marcano于1891年研究发现菠萝汁中含有蛋白酶。
随后,人们对菠萝蛋白酶展开了一系列研究,发现其在医药和化工领域有很好的利用价值。
1957年,Heineche等从菠萝茎中提取得到蛋白质水解酶,从而使菠萝蛋白酶实现商品化生产。
目前,菠萝蛋白酶的一些功能成分已得到成功分离,并应用于医药领域。
随着提取纯化技术的不断进步,高活性的菠萝蛋白酶将广泛应用于医药、化工和食品领域。
[1]利用菠萝皮分离纯化菠萝蛋白酶，不仅可充分利用资源，拓展菠萝蛋白酶的获取途径和应用空间，还可降低菠萝加工废料对环境的污染；随着市场对菠萝加工产品需求量的增大，对于菠萝皮的研究与利用就显得尤为重要，尤其对最主要的功能成分蛋白酶的分离、纯化与性质的研究更有意义。
[2]本文通过对菠萝皮蛋白酶的提取，初步分离纯化及活性测定进行了初步研究，探讨影响菠萝蛋白酶活性的影响因素，并解决实验存在的一些问题。
1实验材料与仪器1．1实验材料与试剂新鲜菠萝，透析袋（截留相对分子质量8 000~14 000），0.1mo1/L pH 7.8磷酸缓冲液配制（PBS），0.01mo1/L pH 7.8磷酸缓冲液配制（PBS），1％酪蛋白，激活剂[含20mmo1／L半胱氨酸-盐酸盐、1mmo1/L EDTA-Na2 (乙二胺四乙酸二钠)]，10％三氯乙酸(TCA)。
菠萝蛋白酶提取纯化及化学修饰对其活性的影响
菠萝蛋白酶提取纯化及化学修饰对其活性地影响一、实验目地、掌握菠萝蛋白酶地提取和纯化方法、研究菠萝蛋白酶地稳定性、掌握菠萝蛋白酶地化学修饰并对修饰酶与未修饰酶地活性比较二、实验原理菠萝蛋白酶（）是从凤梨属植物菠萝中提取地一组复合地半胱氨酸巯基蛋白水解酶.菠萝蛋白酶属于糖蛋白，分子量约为，等电点为，白色至浅棕黄色无定形粉末，溶于水.水溶液无色至淡黄色，有时有乳白光，不溶于乙醇、氯仿和乙醚.菠萝蛋白酶是典型地巯基蛋白酶，能分解蛋白质，肽，酯，酰胺.它地水解蛋白地活性比木瓜蛋白酶地活性高十倍以上，因此有着广泛地用途.它作为一种食品添加剂可用于肉质嫩化、啤酒澄清，还用于干酪、明胶、水解蛋白酶地生产.在医药上它可用于生物体内溶解纤维蛋白及血凝块，因此可用于治疗水肿及多种炎症；它能迅速溶痂，对正常组织无害，不影响植皮，适用于中小面积深度烧伤地治疗.菠萝蛋白酶地最适温度范围比较稳定，最稳定范围是℃℃.菠萝蛋白酶地最适在左右，呈现中性.金属盐离子中、对酶活地影响不是很大，较高浓度地、对菠萝蛋白酶单宁复合物有一定程度地抑制作用，尤其在浓度较高地情况下对菠萝蛋白游离酶酶活地影响更大.地作用中以醋酸锌地作用更为显著，极低地浓度即能促使菠萝蛋白酶地酶活性明显提高.较低浓度地也能使酶地稳定性有所提高.维生素、半胱氨酸、硫代硫酸钠、巯基乙醇是菠萝蛋白酶地稳定剂，都能使酶分子中巯基基团维持还原态，能够作为还原剂来提高酶活力.地苯甲酸钠即能使氧化脱氢酶地活性得到抑制，对酶起到保护作用.对酶活有影响地金属离子，能通过螯合而保护菠萝蛋白酶，消除其对酶地失活作用.其它试剂如地甘油、葡萄糖、地半乳糖都能使菠萝蛋白酶地半衰期延长，蔗糖、麦芽糖、棉籽糖、松三糖、乙二醇和甘露醇均对菠萝蛋白酶有一定地保护作用.菠萝蛋白酶含有个巯基和个内肽二硫键.在蛋白质中 , —部分是与酶活性有关地最具有反应性地官能团，巯基能够和取代马来酰亚胺反生加成反应，可以对巯基进行修饰，验证巯基对酶催化活性地影响三、试剂材料、材料：新鲜地成熟菠萝、仪器：榨汁机、离心机、紫外分光光度计、恒温水浴锅、氯化钙地干燥器、琼脂糖凝胶柱（×）、研钵、滴管（大、小）、烧杯（大、中、小）、试管、具塞试管、白瓷板、温度计、计、搅拌棒.、试剂：单宁、苯甲酸钠溶液、溶液、氯化钠溶液、地醋酸缓冲液、醋酸缓冲液（含）、三氯乙酸溶液、盐酸、氢氧化钠、乙二醇溶液、甘露醇溶液、葡萄糖溶液、甘油溶液、柠檬酸盐缓冲液( )、乙酸顺丁烯二酰亚胺（）（.）xHAQX缓冲液：称取及，加水溶解后，定容至即得.酪氨酸溶液：精确称取℃下干燥至恒重地酪氨酸，用磷酸缓冲液定容至.酪蛋白溶液：精确称取酪蛋白，用磷酸缓冲液定容至.酶激活剂：半胱氨酸盐酸盐，, 用磷酸缓冲液定容至.蛋白酶液：精确称取菠萝蛋白酶，用磷酸缓冲液定容至.四、实验步骤.菠萝蛋白酶提取纯化. 澄清菠萝汁地制备将菠萝在清水中洗净，沥干，用压榨机压出汁液.用四层纱布挤压进行渣汁分离，获得地粗汁液再经四层纱布过滤去除纤维状物质.得到地粗滤液在℃下离心，留上清液备用.. 硫酸铵沉淀取澄清地菠萝皮汁在℃磁力搅拌作用下缓慢加入经过研磨地固体硫酸铵至饱和.当硫酸铵全部加入后要不断搅动，以使溶解地蛋白和聚集地蛋白达到平衡.将此富含酶蛋白地溶液于离心，收集沉淀并分离出上清液..透析除硫酸铵透析袋预处理：将透析袋剪成适当长度，置于含地溶液中，煮沸.用去离子水彻底清洗透析袋后，再用溶液煮沸 .冷却后，于℃保存备用.操作步骤：将商品化地透析袋适当处理后，封住一端，用纯水检查其完整性，然后将上述沉淀用少量缓冲液溶解后，装入透析袋，赶出袋中地空气，封住透析袋地另一端，放进烧杯中，下置电磁力搅拌器缓慢搅拌，℃透析过夜，对该缓冲液透析，换液次后，用溶液检测是否已被除尽.收集透析内液，离心，用于进一步上柱纯化.凝胶柱纯化离子交换介质处理与转型用初始缓冲液替换倾倒澄清掉乙醇，并用初始缓冲液配成凝胶匀浆（凝胶占，缓冲液占），作真空脱气处理备用..装柱与平衡打开层析柱顶部，关闭出口，用地醋酸缓冲液润湿层析柱柱内及柱子底端并保持一小段液位，略高出滤膜，仔细驱除底端气泡.将凝胶匀浆用玻璃棒引导边搅拌边沿着柱内壁按同一方向连续倾倒入柱内，防止空气泡地产生，同时用缓冲液填充柱子地剩余部分.打开柱下口出水口夹子，使凝胶在柱内自由沉降，装上层析柱顶端柱头，连接好洗脱液.打开蠕动泵，调节流速，让缓冲液按一定地流速通过，稳定柱子.用倍柱体积地缓冲液平衡柱子，直至流出地平衡液和初始平衡液相等时表示已达到平衡..加样略微增大层析柱出口地流速，排除凝胶床表面缓冲液.打开层析柱顶塞，用移液管将透析至无地酶蛋白溶液沿管壁从凝胶床表面上数毫米处缓慢流下.打开层析柱出口，让蛋白质样品溶液进入凝胶柱床内，待液面重合时，可用少许起始缓冲液洗柱内壁和床表面，关上层析柱出口..洗脱加样后用足够量地起始缓冲液淋洗，使未吸附地物质被洗出，并达到充分平衡，在凝胶表面缓慢滴加洗脱液，加至洗脱液表面与柱口形成凸面，加入醋酸缓冲液（含）以流速，开始洗脱，.收集将洗脱液按一定地体积分别收集于试管中，收集各吸收峰洗脱液，然后逐管进行分析，合并活性洗脱峰透析冷冻干燥保存备用..酶活性地测定标准曲线地测定于离心，取上清液，在型分光光度计上以波长下测其吸光度值，记录数据.然后以标准溶液地浓度为横坐标，紫外吸收值为纵坐标绘制标准曲线待用.样品酶活性测定于离心，取上清液，在型分光光度计上以波长下测其吸光度值，记录数据.酶活力单位定义为：在一定温度和值条件下，每分钟水解酪蛋白释放μ酪氨酸地酶量定义为个蛋白酶单位，以表示.酶稳定性研究在测定所用地酶试剂中分别加入滴缓冲液、甘油溶液、乙二醇溶液、甘露醇溶液、葡萄糖溶液，℃水浴，按地实验条件及方法测定酶活性.记录吸光度值，计算得到酶活性变化情况.溶液缓冲液甘油溶液乙二醇溶液甘露醇溶液葡萄糖溶液吸光度.酶修饰前后活性比较修饰酶地制备溶于干燥吡啶，加入琥珀酸酐，度保温，在度减压蒸馏除去溶剂.加入苯至残余物溶解，再加冷己烷，度振荡.过滤，残渣溶于蒸馏水后透析，冻干.将其与菠萝蛋白酶按配比投料，加入柠檬酸缓冲液（），度反应.产物在柠檬酸缓冲液中透析，冻干后得菠萝蛋白酶（修饰酶）.修饰与未修饰酶地活性比较按地实验条件及方法测定酶活性.记录吸光度值，计算得到酶活性变化情况.酶溶液修饰酶未修饰酶吸光度参考文献：董瑞兰. 菠萝蛋白酶地分离纯化及部分应用性质地研究[]. 福建农林大学, .李淑喜, 黎新明. 菠萝蛋白酶地提取及其在医药中地应用[]. 广州化工, , ().田国贺, 郭佳宓, 吕团伟,等. 聚乙二醇对菠萝蛋白酶地化学修饰[]. 生物技术, , ().。
菠萝蛋白酶的制备及其活力的测定
二、菠萝蛋白酶在医药保健品业的应用
1、抑制肿瘤细胞的生长 2、对心血管疾病的防治：能抑制血小 板聚集引起的心脏病发作和中风, 缓解 心绞痛症状,缓和动脉收缩, 加速纤维蛋 白原的分解。 3、用于烧伤脱痂 ：菠萝蛋白酶能选择 性地除皮使新皮移植得以尽早行
4、消炎作用 ：菠萝蛋白酶在各种组织中能 有效地治疗炎症和水肿，菠萝蛋白酶还可治疗 腹泻。 5、增进药物吸收：将菠萝蛋白酶与各种抗 生素(如四环素, 阿莫西林等)联用, 能提高其疗 效。相关研究表明, 它能促进抗生素在感染部 位的传输, 从而减少抗生素的用药量。据推断, 对于抗癌药物, 也有类似的作用。此外，菠萝 蛋白酶能促进营养物质的吸收。
（三）菠萝蛋白酶活力的测定 1、取酶制品溶解于0.05mol/L磷酸缓冲液（PH7.0)至 10ml,离心得上清液； 2、取5支试管，分别标号1、2、3、4、5，各加1ml溶液 酶和0.9m激活剂； 3、另取5支试管，分别对应标号、、、、，各 加1ml缓冲液和0.9ml激活剂； 4、将10支试管置于37℃水浴； 5、然后按下表操作
试管号 1 1%酪蛋白 （ml) 0.2 2 0.4 3 0.6 4 0.7 5 0.8
6、按步骤5混匀，在37℃水浴下反应10 min; 7、向10支试管中各加入8ml1mol/L的氢氧化钠溶液， 摇匀，于室温放置30min; 8、取各自对应的试管在275nm波长下测定吸光度 9、测定结果如下
试管号
吸光度A
1
2
3
4
5
实验过后对结果进行分析和计算
数据的处理
1、由线性关系y=6.2357x，可以计算酶制品中 蛋白酶的总质量m 2、菠萝蛋白酶活力=A/10 3、比活力=菠萝蛋白酶活力/m 4、提取率=m/菠萝的质量
菠萝蛋白酶的制备及活性测定
菠萝蛋白酶的制备及活性测定背景菠萝蛋白酶(Bromel ain)，别名菠萝酶，是存在于菠萝(AnanaCOmOSl2S)植株中的蛋白质水解酶，为浅黄色无定形粉末，微有异臭。
菠萝的果、茎、柄和叶片中都含有菠萝蛋白酶。
一般从菠萝果中提取的称为果菠萝蛋白酶，从菠萝皮、茎中提取的为茎菠萝蛋白酶。
八成熟的菠萝果汁含有约0．4％的菠萝蛋白酶，成熟的菠萝果汁含有O．3％左右的菠萝蛋白酶，茎汁含8．7％的菠萝蛋白酶(Murach i，et a1．，1964)。
1981年，Marcan o首先发现菠萝汁中含有蛋白水解酶，随后Will statt er，Bergma nn和Ma rtin相继指出，菠萝蛋白酶存在于果、皮和茎部中，存在于茎部的称为茎酶(Stembr omela in E．C．3．4．22．4)，存在于果汁中的酶称为果酶(Fruitbromel ainE．C．3．4．22．5)。
Murach i和Neu rath、E1．G harbaw i和Whi taker采取层析法分离提取了菠萝蛋白酶并研究了它的活性成分。
结构特性研究表明，果菠萝蛋白酶是酸性酶，等电点为pH4．6，茎菠，约为33，000，等电点为pH9．5，其活性中心的氨基酸顺序和催化机理与木瓜蛋白酶相似，并确定茎菠萝蛋白酶为糖蛋白。
Ota S et aL研究指出，茎菠萝酶分子量为36000，末端氨基酸残基是丙氨酸，果酶分子量为30000，末端氨基酸残基也为丙氨酸，碳水化合物分析与Mur aclli 的分析结果相似。
1988年，T．L．迈诺特等由十二烷基硫酸钠．聚丙烯胺凝胶电泳(SDS．PAGE)测定果菠萝蛋白酶分子量22200．25080，等电点3．8~4．8。
菠萝蛋白酶是各种酶的混合物，已知菠萝蛋白酶粗品中包含至少五种蛋白水解酶，也包含非蛋白水解酶，包括酸性磷酸酶和过氧化物酶，并含有淀粉酶和纤维素酶活性，还存在其他成分。
菠萝蛋白酶的提取纯化及化学修饰对其活性的影响
菠萝蛋白酶的提取纯化及化学修饰对其活性的影响实验目的学习菠萝蛋白酶的提取纯化方法，学习酶活力的测定原理及方法，了解影响菠萝蛋白酶活性的因素。
实验原理菠萝蛋白酶是一种典型的巯基蛋白酶，相对分子质量为3.3*107，等电点为9.55，能分解蛋白质、肽、脂质和酰胺。
蛋白质在水溶液中的溶解度由蛋白质周围亲水基团与水形成水化膜的程度及蛋白质分子所带电荷的情况决定的，当加入硫酸铵后，由于盐离子对水的亲和力大于蛋白质，于是蛋白质分子周围的水化膜被破坏，同时其表面的电荷被盐离子中和，导致蛋白质溶解度下降，从而从溶液中沉淀析出。
粗品中的硫酸根离子可由透析的方法除去，铵根离子可由CM琼脂糖FF 层析柱除去。
菠萝蛋白酶活力定义为在特定条件下（pH7.0，37℃），每分钟水解酪蛋白生成1 μg酪氨酸所需的菠萝蛋白酶的量规定为1个酶活力单位，以U/g表示。
根据紫外吸光度（275nm处）建立标准曲线，确定水解产生的酪氨酸含量，从而计算出酶活力。
菠萝蛋白酶活性依靠巯基维持，文献资料显示，含多羟基化合物对巯基具有保护作用，因此通过向菠萝蛋白酶中加入甘油、乙二醇、甘露醇以及葡萄糖，探究验证这类有机物的保护作用。
而N-乙酸马酰亚胺（NEM）是巯基修饰剂，因此可以利用NEM 验证菠萝蛋白酶中的半胱氨酸残基为其酶活性所必需。
实验仪器和试剂材料：菠萝汁（菠萝榨汁后用纱布过滤得澄清溶液）仪器：烧杯、玻璃棒、离心机、离心管、滴管、透析袋、恒温水浴锅、冰箱、电炉、磁力搅拌器、凝胶柱、试管、白瓷板试剂：纯化水，硫酸铵，1mmol/L EDTA的2% NaHCO3溶液，1mmol/L EDTA溶液，1%BaCl2溶液，磷酸缓冲溶液（称取KH2PO4 2.69g以及K2HPO4 13.97g，加水溶解后定容至1000mL，pH7.4 实验中需要大量该溶液），CM琼脂糖FF凝胶，20%乙醇溶液，洗脱液：1M NaC-20mM pH4.0 含0.01% EDTA醋酸缓冲液（取2M醋酸钠溶液13ml与2M醋酸溶液87mL，加入含铜1mg/mL的硫酸铜溶液0.5mL，加入0.1g EDTA，再加水稀释至1000ml），双缩脲试剂（取1.50g CuSO4·5H2O，6.0g酒石酸钠，加水约500ml溶解后加入300ml 10% NaOH，用水配成1L），酪氨酸标准液（精确称取105℃下干燥至恒重的酪氨酸5mg，用pH7.4磷酸缓冲溶液定容至100ml ），酶激活剂（20mmol/L L-半胱氨酸盐酸盐，1mmol/L EDTA-Na，用磷酸溶液定容至100ml），酪蛋白溶液（精确称取酪蛋白5mg，用磷酸缓冲液定容至100ml），三氯醋酸溶液（取三氯乙酸1.8 g，无水醋酸钠2.99 g，冰醋酸液1.9 mL，加水溶液并稀释至100 mL），50%甘油溶液，50%乙二醇溶液，50%甘露醇溶液，50%葡萄糖溶液，NEM，吡啶，苯，己烷，0.1M pH4.6 柠檬酸缓冲溶液（0.1M柠檬酸溶液10.3ml，0.1M柠檬酸钠溶液9.7ml）实验方法1 菠萝蛋白酶的提取在5~8℃下硫酸铵少量多次加入菠萝汁形成饱和溶液，搅拌30min，离心（11000g，20min，4℃），弃去上清液，得粗酶固体。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
实验一
菠萝蛋白酶的提取、初级纯化 及活性鉴定
一、实验目的
• 系统地学习和掌握生命大分子物质分离纯化技 术的原理及基本实验技术。 • 熟练掌握饱和硫酸铵沉淀法、透析法、测定蛋 白质含量、蛋白酶活性检测等实验技术。
二、实验原理
1、生命大分子物质分离纯化的一般程序：
（1）选择有效成分含量丰富、稳定性好的样品材料。 （2）材料处理。 （3）确定分离纯化的方法，使粗品的纯度达到预定要求。 （4）建立灵敏、特异、精确的检测手段。
2、酶活测定方法（每组）
试剂 TCA(ml) 酪蛋白（ml） 酶液（ml） 激活剂（ml） TCA(ml) A275石英比色杯 酶活（U） 酶活（U）平均 值 0 0 对照(调零) 3 1 0.1 0.9 实验1 — 1 0.1 0.9 3 静置 5min 滤纸过滤 实验2 — 1 0.1 0.9 3 实验3 — 1 0.1 0.9 3
37℃ 10min 水浴
酶活单位：在上述条件下(37℃,酶促反应10min)，每 10min增加0.01个光吸收值的酶量为一个酶活力单位 （U）。
3、透析去盐
•把测酶活后所剩的酶蛋白吸到透析袋中,系紧,置于PBS 0.01 mol/L pH7.8的3000ml的烧杯中,置于磁力搅拌机上, 进行透析；或静止透析1～2天，间中要换缓冲液3次。
五．实验结果分析
– 各实验组进行分析，讨论实验结果，再由老 师进行归纳总结。 – 做好实验数据的原始记录。 – 交实验报告，对实验结果进行综合分析，并 对该实验提出一些可行性意见。
2、测酶活试剂 （1）1%酪蛋白（pI4.8）：200ml。
用0.1 mol/L PBS pH7.8配，50-55℃水浴溶解，不停搅 拌，需1h才能溶解。 2g酪蛋白+200ml PBS（0.1 mol/L pH7.8）。
（2）激活剂 100ml（现配现用）
20 mmol/L半胱氨酸-盐酸盐，1 mmol/L EDTA-Na，用 0.1 mol/L pH7.8 PBS配制至100ml。
平衡离心 10000r/10min ↓ 弃沉淀，取上清液，量体积倒入小烧杯 ↓ 加固体（NH4）2SO4盐析，0～30%饱和度，缓慢加入， 边加边搅拌至完全溶解，倒入离心管 ↓ 4℃，1～2h ↓ 平衡离心，10000r/10min ↓ 取沉淀，再加5～8ml PBS 0.1 mol/L pH7.8溶解，如果不 能完全溶解，平衡后离心10000r/5min ，弃沉淀，留上 清，进行酶活测定和透析。
（3）5%TCA（三氯乙酸）：200ml。
3、透析袋处理 • 将10 cm长的透析袋置于1000ml含1mmol/L EDTA-Na2的2%碳酸氢钠溶液中煮沸10min后，用 干净镊子取出，经蒸馏水煮沸、漂洗，即可使用。
四.实验步骤
1、粗酶提取 生菠萝皮（每一组） 30g+50ml PBS 0.1 mol/L pH7.8 ↓ 电动搅拌 ↓ 2～4层纱布过滤于烧杯中 ↓ 分装于离心管（10ml/管） ↓
(二)层析 主要有：离子交换层析，凝胶过滤，亲和层析
透Байду номын сангаас和超滤
• 透析是将待提纯的蛋白质溶液装在半透膜的透析袋里， 扎紧袋口放在缓冲液中进行的。 •超滤是利用压力和离心力，借助于超滤膜将不同分子量 的物质分离的技术。
3、菠萝蛋白酶活性测定
酪蛋白
菠萝蛋白酶
酪氨酸 （275nm）
三．实验试剂
1、缓冲液 （1） PBS 0.1moL/L 3000ml pH7.8 （2） PBS 0.01 mol/L 4000ml pH7.8
2、蛋白质的分离纯化方法：
(一)沉淀法 • 盐析法、等电点沉淀法、有机溶剂沉淀法、聚 乙二醇（PEG）沉淀法等。
• 在稀盐溶液中，蛋白质的溶解度随盐浓度的增加而升 高，这种现象称为盐溶。 • 但当盐浓度增加到一定量时，其溶解度又逐渐下降， 直到某一浓度时便从溶液中沉出，即为盐析。
•一般进行蛋白质沉淀时，选用的盐是硫酸铵。 优点： ①溶解度大，对温度不敏感； ②分级效果好； ③有稳定蛋白质结构的作用； ④价格低廉。 缺点：盐浓度含量高。
菠萝蛋白酶的提取、初级纯化 及活性鉴定
一、实验目的
• 系统地学习和掌握生命大分子物质分离纯化技 术的原理及基本实验技术。 • 熟练掌握饱和硫酸铵沉淀法、透析法、测定蛋 白质含量、蛋白酶活性检测等实验技术。
二、实验原理
1、生命大分子物质分离纯化的一般程序：
（1）选择有效成分含量丰富、稳定性好的样品材料。 （2）材料处理。 （3）确定分离纯化的方法，使粗品的纯度达到预定要求。 （4）建立灵敏、特异、精确的检测手段。
2、酶活测定方法（每组）
试剂 TCA(ml) 酪蛋白（ml） 酶液（ml） 激活剂（ml） TCA(ml) A275石英比色杯 酶活（U） 酶活（U）平均 值 0 0 对照(调零) 3 1 0.1 0.9 实验1 — 1 0.1 0.9 3 静置 5min 滤纸过滤 实验2 — 1 0.1 0.9 3 实验3 — 1 0.1 0.9 3
37℃ 10min 水浴
酶活单位：在上述条件下(37℃,酶促反应10min)，每 10min增加0.01个光吸收值的酶量为一个酶活力单位 （U）。
3、透析去盐
•把测酶活后所剩的酶蛋白吸到透析袋中,系紧,置于PBS 0.01 mol/L pH7.8的3000ml的烧杯中,置于磁力搅拌机上, 进行透析；或静止透析1～2天，间中要换缓冲液3次。
五．实验结果分析
– 各实验组进行分析，讨论实验结果，再由老 师进行归纳总结。 – 做好实验数据的原始记录。 – 交实验报告，对实验结果进行综合分析，并 对该实验提出一些可行性意见。
2、测酶活试剂 （1）1%酪蛋白（pI4.8）：200ml。
用0.1 mol/L PBS pH7.8配，50-55℃水浴溶解，不停搅 拌，需1h才能溶解。 2g酪蛋白+200ml PBS（0.1 mol/L pH7.8）。
（2）激活剂 100ml（现配现用）
20 mmol/L半胱氨酸-盐酸盐，1 mmol/L EDTA-Na，用 0.1 mol/L pH7.8 PBS配制至100ml。
平衡离心 10000r/10min ↓ 弃沉淀，取上清液，量体积倒入小烧杯 ↓ 加固体（NH4）2SO4盐析，0～30%饱和度，缓慢加入， 边加边搅拌至完全溶解，倒入离心管 ↓ 4℃，1～2h ↓ 平衡离心，10000r/10min ↓ 取沉淀，再加5～8ml PBS 0.1 mol/L pH7.8溶解，如果不 能完全溶解，平衡后离心10000r/5min ，弃沉淀，留上 清，进行酶活测定和透析。
（3）5%TCA（三氯乙酸）：200ml。
3、透析袋处理 • 将10 cm长的透析袋置于1000ml含1mmol/L EDTA-Na2的2%碳酸氢钠溶液中煮沸10min后，用 干净镊子取出，经蒸馏水煮沸、漂洗，即可使用。
四.实验步骤
1、粗酶提取 生菠萝皮（每一组） 30g+50ml PBS 0.1 mol/L pH7.8 ↓ 电动搅拌 ↓ 2～4层纱布过滤于烧杯中 ↓ 分装于离心管（10ml/管） ↓
(二)层析 主要有：离子交换层析，凝胶过滤，亲和层析
透Байду номын сангаас和超滤
• 透析是将待提纯的蛋白质溶液装在半透膜的透析袋里， 扎紧袋口放在缓冲液中进行的。 •超滤是利用压力和离心力，借助于超滤膜将不同分子量 的物质分离的技术。
3、菠萝蛋白酶活性测定
酪蛋白
菠萝蛋白酶
酪氨酸 （275nm）
三．实验试剂
1、缓冲液 （1） PBS 0.1moL/L 3000ml pH7.8 （2） PBS 0.01 mol/L 4000ml pH7.8
2、蛋白质的分离纯化方法：
(一)沉淀法 • 盐析法、等电点沉淀法、有机溶剂沉淀法、聚 乙二醇（PEG）沉淀法等。
• 在稀盐溶液中，蛋白质的溶解度随盐浓度的增加而升 高，这种现象称为盐溶。 • 但当盐浓度增加到一定量时，其溶解度又逐渐下降， 直到某一浓度时便从溶液中沉出，即为盐析。
•一般进行蛋白质沉淀时，选用的盐是硫酸铵。 优点： ①溶解度大，对温度不敏感； ②分级效果好； ③有稳定蛋白质结构的作用； ④价格低廉。 缺点：盐浓度含量高。