GBT肥料中粪大肠菌群的测定

NY 884-2012《生物有机肥》原《生物有机肥》（NY 884-2004）经修订后，2012年6月6日中华人民共和国农业部公告第1783号颁布新的版本：NY 884-2012《生物有机肥》，并从2012年9月1日起实施，敬请各有关生产企业及时更换产品登记证，以及更新产品标签、包装等事宜。

为了便于各有关生产企业了解、掌握和按照新版本《生物有机肥》（NY 884-2012）的有关内容，现将修订后的《生物有机肥》（NY 884-2012）文本上传，谨供参考。

有关《生物有机肥》（NY884-2012）的具体条文内容请参见标准的正式文本。

前言本标准按照GB/T 1.1的要求起草。

本标准代替NY 884—2004《生物有机肥》，与NY 884—2004相比修改主要内容：——修改了有机质的质量分数；——修改了颗粒产品的水分质量分数；——修改了产品中砷（As）、镉（Cd）、铅（Pb）、铬（Cr）、汞（Hg）限量指标。

本标准由中华人民共和国农业部种植业管理司提出并归口。

本标准起草单位：农业部微生物肥料和食用菌菌种质量监督检验测试中心、中国农业科学院农业资源与农业区划研究所。

本标准所代替标准的历次版本发布情况为：NY 884—2004。

生物有机肥1 范围本标准规定了生物有机肥的要求、检验方法、检验规则、包装、标识、运输和贮存。

本标准适用于生物有机肥。

2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。

凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。

凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T 8170—2008 数值修约规则与极限数值的表示和判定GB/T 19524.1—2004 肥料中粪大肠菌群的测定GB/T 19524.2—2004 肥料中蛔虫卵死亡率的测定NY/T 1978—2010 肥料汞、砷、镉、铅、铬含量的测定7.1 检验分类7.1.1 出厂检验（交收检验）产品出厂时，应由生产厂的质量检验部门按表1进行检验，检验合格并签发质量合格证的产品方可出厂。

粪大肠菌群的检测标准根据不同的国家和地区以及不同的应用场景可能会有所不同。

一般来说，粪大肠菌群的检测标准通常是以每克或每毫升样品中的大肠菌群数量来表示的，常用的单位有CFU/g或CFU/mL。

在某些国家或地区，对于饮用水、食品等相关行业的检测标准可能会更加严格。

例如，某些国家可能规定饮用水中不得检出大肠菌群，而在某些食品中则可能规定每克样品中大肠菌群的数量不得超过一定数值。

需要注意的是，粪大肠菌群并非单一菌种，而是一组菌群的统称。

因此，在检测过程中需要针对这一组菌群进行检测，而非单一菌种。

同时，为了确保检测结果的准确性，检测过程需要严格遵守相关操作规范，避免交叉污染等因素的影响。

粪大肠菌群数测量方法-概述说明以及解释1.引言1.1 概述概述部分的内容可以描述该篇文章的研究背景以及粪大肠菌群数测量方法的重要性。

可以参考以下内容进行撰写：概述粪大肠菌群数（Fecal coliform count）是评估水体、食品和环境卫生安全的重要指标之一。

粪大肠菌群数测量方法的准确性和可靠性对于保障公众健康和环境质量至关重要。

随着生活水平的提高和环境污染问题的日益严重，对粪大肠菌群数测量方法的研究与探索变得尤为重要。

本文旨在详细介绍目前常用的三种粪大肠菌群数测量方法，即第一种测量方法、第二种测量方法和第三种测量方法。

通过比较这三种方法的原理、步骤以及各自的优缺点，可以帮助读者更全面地了解和选择合适的测量方法。

本文结构本文分为引言、正文和结论三个部分。

引言部分对粪大肠菌群数测量方法的研究背景和意义进行了概述。

正文部分详细介绍了三种测量方法的原理、步骤以及优缺点。

结论部分对本文的主要观点进行总结，并对未来相关研究进行展望。

通过本文的阅读，读者可以对粪大肠菌群数测量方法有一个全面的了解，并对选择适合自己研究对象的测量方法具备一定的指导意义。

希望本文能够为相关领域的研究工作者提供有价值的信息和启示，推动粪大肠菌群数测量方法的改进和发展。

1.2 文章结构文章结构部分的内容可以包括对整篇文章的大致框架进行介绍，即各个章节及其内容的概览。

在文章结构部分中，可以简要介绍文章的组成和布局，以帮助读者更好地理解整篇文章的结构和内容安排。

此外，可以提及各个章节的主要目标和内容，以及各个章节之间的逻辑关系。

具体编写文章结构部分的内容如下：文章结构：本文共分为引言、正文和结论三个部分。

引言部分主要概述了本文的研究背景和目的，同时简要介绍了大纲中各个章节的内容安排。

正文部分详细介绍了三种粪大肠菌群数测量方法：第一种测量方法、第二种测量方法和第三种测量方法。

每种测量方法都包括了原理、步骤和优缺点的详细介绍。

通过对这三种测量方法的讨论和比较，读者可以全面了解不同测量方法的特点和应用情况。

滤膜法-粪大肠菌群的测定1、适用范围本标准适用于地表水、地下水、及水中粪大肠菌群的测定。

用于检验加氯消毒的水样时，在滤膜法之前，先做试验，证实它所得的数据资料与多管发酵试验所得的数据资料具有可比性。

2、原理滤膜是一种微孔性薄膜。

将水样注入已灭菌的放有滤膜（孔径0.45微米）的滤器中，经过抽滤，细菌即被截留在膜上，然后将滤膜贴于M-FC培养基上，44.5℃温度下进行培养，计数滤膜上生长的此特性的菌落数，计算出每1L水样中含有粪大肠菌群数。

3仪器：滤膜（孔径0.45微米）、滤器、接液瓶、垫圈、无菌镊子夹3、培养基和试剂本标准所用试剂除另有注明外，均为符合国家标准的分析纯化学试剂，实验室用水为新制备的去离子水。

M-FC培养基：胰胨10g蛋白胨5g酵母浸膏 3.0g氯化钠 5.0g乳糖12.5g胆盐三号 1.5g1%苯胺蓝水溶10ml1%玫瑰色酸溶液（溶于0.2mol/L氢氧化钠液中）10ml蒸馏水1000ml制法：将上述培养基中的成分（除苯胺蓝和玫瑰色酸外），置于蒸馏水中加热溶解，调节PH为7.4，分装于小烧瓶内，每瓶100ml，于115℃灭菌20min。

储存于冰箱中备用，临用前，按上述配比，用灭菌吸管分别加入已煮沸灭菌的1%苯胺蓝溶液1ml及新配制的1%玫瑰色酸溶液（溶于氢氧化钠溶液）1ml，混合均匀。

加热溶解前，加入1.2%～1.5%琼脂制成固体培养基。

如培养物中杂菌不多，则培养基中不加玫瑰色酸亦可。

4、步骤水样的选择：水样量的选择根据细菌受检验的特征和水样中预测的细菌密度而定。

理想的水样体积是一片滤膜上生长20～60个粪大肠群菌落，总菌落数不超过200个。

滤膜及滤膜灭菌：将滤膜放入高压蒸汽灭菌锅里在121℃灭菌10min，滤器、接液瓶、垫圈分别用纸包好，在使用前经121℃灭菌20min，滤器也可用点燃的酒精棉球火焰灭菌。

过滤：用无菌镊子夹取灭菌滤膜边缘，将粗糙面向上，贴放在已灭菌的滤床上，稳妥的固定好滤器。

/asphtml/GB071.htm/粪大肠菌群计数步骤GB/T 4789.39-2008一、设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：1 恒温培养箱：36 ℃±1 ℃ 。

2 冰箱：2℃~ 5 ℃ ．3 恒温水浴箱：44.5 ℃±0.2 ℃ 。

4 天平：感量0.1g 。

5 均质器。

6 振荡器。

7 无菌吸管：1 mL （具0.01 mL 刻度）、10 mL （具0.1 mL 刻度）或微量移液器及吸头。

8 无菌锥形瓶：容量500 mL 。

9 无菌培养皿：直径90 mm 。

10 pH 计或pH 比色管或精密pH 试纸。

二、培养基及试剂1月桂基硫酸盐胰蛋白胨（lauryl sulfate tryptose , LST ）肉汤2 EC 肉汤（E.coli broth )3 无菌生理盐水：称取8.5g 氯化钠溶于1 000 mL 蒸馏水中，121 ℃ 高压灭菌15 min。

4 4mol/L 氢氧化钠（NaOH ) ：称取40g 氢氧化钠溶于1 000 mL 蒸馏水中5 1 mol/L 盐酸（HCl ）：移取浓盐酸90 mL ，用蒸馏水稀释至1 000 mL操作步骤6.1 样品的稀释6.1.1 固体和半固体样品：称取25g 样品，置盛有225 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内，8000r/min ~10000r/min 均质1 min ~2 min ，制成1：10 样品匀液，或置225 mL 稀释液的无菌均质袋中，用拍打式均质器拍打1 min ~2 min ，制成1 : 10 的样品匀液。

6.1.2 液体样品：以无菌吸管吸取样品25 mL 置盛有225 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成1 : 10 的样品匀液。

6.1.3 样品匀液的pH 值应在6.5 ~7.5 之间，必要时分别用1 mol/L 氢氧化钠（NaOH ）或1 mol/L 盐酸（HCI ）调节。

粪大肠菌群的测定1、半个月前配好初、复发酵所需培养液2、采样时用500ml 广口玻璃瓶分开采样，牛皮纸封口3、操作（1） 培养液初发酵 单倍乳糖蛋白胨培养液：蛋白胨 10 g牛肉浸膏 3 g乳糖 5 g氯化钠 5 g蒸馏水 1000ml调节PH 为7.2—7.4（NaOH ）6%溴甲基紫乙醇溶液 1 ml 充分混匀后 10ml （三倍是5ml ）分装于试管中，盖紧塞于蒸气锅中灭菌20min （0.1—0.5kpa ），冷却后于药品储存箱保存。

单月13个地表水（每个水样需10个单倍，5个三倍），2个创业（每个水样需15个单倍）。

共190个（1900ml ）单倍，65个三倍（325ml ）。

双月10个地表水，2个创业。

共130个（1600ml ）单倍，50个三倍（250ml ）。

创业的水一个月采两次水样复发酵 EC 培养液胰胨 20 g乳糖 5 g胆盐三号 1.5 g磷酸氢二钾 4 g磷酸二氢钾 1.5 g氯化钠 5 g蒸馏水 1000ml充分混匀后 10ml 分装于试管中，盖紧塞于蒸气锅中灭菌20min （0.1—0.5kpa ），冷却后于药品储存箱保存。

三倍乳糖蛋白胨培养液： 蛋白胨 30 g 牛肉浸膏 9 g 乳糖 15 g 氯化钠 15 g 蒸馏水 1000ml 溴甲基紫乙醇溶液 3 ml（2）做样初发酵：地表水15根管为一个水样。

5根为一组。

第一排为5ml三倍培养液，加10ml水样；第二排为10ml单倍培养液，加1ml水样；第三排为10ml单倍培养液，取1ml水样稀释至10ml后再从中取1ml至装有培养液的试管。

（10、1、0.1的取样量）创业，每个水样15根单倍。

同上逐级稀释，取样量为0.1、0.01、0.001ml。

将初发酵管放入培养箱中培养，温度为37℃±0.5℃，时间为24h±2h。

观察：产酸产气为阳性，即变色且有气泡产生，可轻击试管查气泡。

复发酵：呈阳性的试管进行接种后，做复发酵。

粪大肠菌群的测定1、半个月前配好初、复发酵所需培养液2、采样时用500ml 广口玻璃瓶分开采样，牛皮纸封口3、操作（1） 培养液初发酵 单倍乳糖蛋白胨培养液：蛋白胨 10 g牛肉浸膏 3 g乳糖 5 g氯化钠 5 g蒸馏水 1000ml调节PH 为7.2—7.4（NaOH ）6%溴甲基紫乙醇溶液 1 ml 充分混匀后 10ml （三倍是5ml ）分装于试管中，盖紧塞于蒸气锅中灭菌20min （0.1—0.5kpa ），冷却后于药品储存箱保存。

单月13个地表水（每个水样需10个单倍，5个三倍），2个创业（每个水样需15个单倍）。

共190个（1900ml ）单倍，65个三倍（325ml ）。

双月10个地表水，2个创业。

共130个（1600ml ）单倍，50个三倍（250ml ）。

创业的水一个月采两次水样复发酵 EC 培养液胰胨 20 g乳糖 5 g胆盐三号 1.5 g磷酸氢二钾 4 g磷酸二氢钾 1.5 g氯化钠 5 g蒸馏水 1000ml充分混匀后 10ml 分装于试管中，盖紧塞于蒸气锅中灭菌20min （0.1—0.5kpa ），冷却后于药品储存箱保存。

三倍乳糖蛋白胨培养液： 蛋白胨 30 g 牛肉浸膏 9 g 乳糖 15 g 氯化钠 15 g 蒸馏水 1000ml 溴甲基紫乙醇溶液 3 ml（2）做样初发酵：地表水15根管为一个水样。

5根为一组。

第一排为5ml三倍培养液，加10ml水样；第二排为10ml单倍培养液，加1ml水样；第三排为10ml单倍培养液，取1ml水样稀释至10ml后再从中取1ml至装有培养液的试管。

（10、1、0.1的取样量）创业，每个水样15根单倍。

同上逐级稀释，取样量为0.1、0.01、0.001ml。

将初发酵管放入培养箱中培养，温度为37℃±0.5℃，时间为24h±2h。

观察：产酸产气为阳性，即变色且有气泡产生，可轻击试管查气泡。

复发酵：呈阳性的试管进行接种后，做复发酵。

一、微生物分析的总体要求（一）、采样瓶及玻璃器皿的清洗1、新购置的玻璃器皿，因含游离碱，2%的盐酸浸泡数小时，自来水冲洗，蒸馏水冲洗干净，沥干。

2、培养细菌后的玻璃器皿，应先经高压蒸汽灭菌，趁热倒出培养基，用洗涤剂刷洗干净，自来水冲洗，蒸馏水冲洗干净，沥干。

3、洗涤吸管时可高压蒸汽灭菌30min，用洗涤剂刷洗干净，自来水冲洗，蒸馏水冲洗干净，沥干。

用牛皮纸包好，可干热灭菌（于烘箱中160℃烘150min）和高压蒸汽灭菌（121℃灭菌20min）。

备用。

所有的吸管上端要用少量普通棉花填塞，注意松紧度，取液时使其准确快速的流出）4、洗涤采样瓶时，用刷子刷洗干净，自来水冲洗，蒸馏水冲洗干净，再烘箱烘干，用牛皮纸包好（鸡肠带捆好），可干热灭菌（于烘箱中160℃烘150min）和高压蒸汽灭菌（121℃灭菌20min）5、培养皿：洗净后，用烘箱烘干，用牛皮纸包好进行灭菌，待冷后放入冰箱中备用。

（二）、培养基的制备1、单倍乳糖蛋白胨培养液-液体培养基用量筒量取1000mlUP水，加23g营养物质，沿烧饼边沿搅拌，使其完全溶解。

用移液管移取9ml培养液分装于试管中，用针管将小导管从底部注满营养液，斜扣入试管中，用胶塞塞紧，用牛皮纸每十个进行包扎。

2、三倍乳糖蛋白胨培养液：营养物质加入69g，用移液管移取5ml培养液分装于试管中，用针管将小导管从底部注满营养液，斜扣入试管中，用胶塞塞紧，用牛皮纸每十个进行包扎。

3、EC培养液（配制过程同乳糖蛋白胨培养液）(称取37g)-液体培养基4、无菌水，吸取9ml新鲜UP水于试管中，其余包扎过程同乳糖蛋白胨培养液。

5、上述培养基及无菌水准备好后高压蒸汽灭菌（121℃灭菌20min）。

灭菌后等室温再放入冰箱。

6、伊红美蓝培养基（EMB培养基）(固体培养基-平板)①称取42g营养物质，加入到1000mlUP水中，加热溶解，用三角瓶分装，盖上绵塞，至于高压蒸汽灭菌锅内，121℃灭菌20min。

方法验证报告项目名称：粪大肠菌群的测定方法名称：GB 18466-2005粪大肠菌群的检测方法报告编写人：参加人员：审核人员：报告日期：1 实验室基本情况1.1人员情况表1参加验证的人员情况登记表1.2 检测仪器/设备情况表2使用仪器情况登记表1.3 检测用试剂情况表3使用试剂登记表1.4 环境设施和条件情况实验室具有检定合格的温湿度计，环境可以控制在温度18⁓26℃，湿度45%⁓65%的要求范围内，满足检测环境条件，实验室人员每天对环境条件进行监控。

另外实验室配备了洗眼器、喷淋设施、护目镜、灭火器等的安全防护措施，符合实验室安全内务的要求。

2 实验室检测技术能力2.1样品采集与保存按照HJ 91.1的相关规定进行水样的采集。

采集样品时，采样瓶不得用样品洗涤，采集样品于灭菌的采样瓶中。

水体采样量不低于200 ml。

样品采集完毕后，迅速扎上无菌包装纸。

采集废水样品及一定深度的样品时，也可使用灭菌过的专用采样装置采样。

如果采集的是含有活性氯的样品，需在采样瓶灭菌前加入硫代硫酸钠溶液，以除去活性氯对细菌的抑制作用（每125mL容积加入0.1g/ml的硫代硫酸钠0.1mL）。

采样后应在2 h内检测，否则，应10⁓以下冷藏但不得超过6 h。

实验室接样后，不能立即开展检测的，将样品于4⁓以下冷藏并在2 h内检测。

2.2 检测步骤2.2.1样品准备污水样品至少取200ml，使用前应充分混匀。

根据预计的污水样品中粪大肠菌群数确认污水样品接种量。

粪大肠菌群数量相对较少的接种量一般为10、1、0.1ml。

粪大肠菌群较多时接种量为1、0.1、0.01ml或0.1、0.01、0.001ml等。

接种量少于1ml时，水样应制成稀释样品后供发酵实验使用。

接种量为0.1、0.01ml时，取稀释比分别为1:10、1:100.其他接种量的稀释比依此类推。

1:10稀释样品的制作方法为：吸取1ml水样，注入盛有9ml灭菌水的试管中，混匀，制成1:10稀释样品。