过滤膜法测粪大肠菌群数-国标方法

现行两种水质粪大肠菌群测定方法的比较作者：马旭东赵锋来源：《绿色科技》2015年第10期摘要：指出了由国家环境保护总局主持修订的第三版地表水环境质量标准《地表水环境质量标准》（GB3838—2002）2002年4月发布，其中粪大肠菌群也被列为24项基本项目之一。

然而直到2007年3月才由国家环境保护总局发布了行业标准《水质粪大肠菌群的测定多管发酵发和滤膜法》（HJ/T347-2007）（以下简称“行业标准”）。

之前环境监测部门一直都是在使用卫生部发布的《生活饮用水标准检验方法微生物指标》（GB/T5750.12-2006）（以下简称“国家标准”）。

主要通过对这两个标准的异同点的比较，探究了将这两种方法的优点用在实际的环境监测工作中。

关键词：地表水环境质量标准；粪大肠菌群；环境监测中图分类号：X832文献标识码：A 文章编号：1674-9944（2015）10-0216-021 概述大肠菌群并非细菌学分类命名，它不代表某一个或某一属细菌，而指的是具有某些特性的一组与粪便污染有关的细菌，这些细菌在生化及血清学方面并非完全一致，其定义为：需氧及兼性厌氧、在37℃能分解乳糖产酸产气的革兰氏阴性无芽胞杆菌，粪大肠菌群则是大肠菌群的一部分主要来自于粪便，因此粪大肠菌群的存在表明可能受到了粪便污染，可能存在大肠杆菌。

国家标准和行业标准中都对粪大肠菌群的检测（多管发酵法）作出了比较详细的规定，现就其两个标准中的异同作出如下探讨。

2 相同点适用范围相同：行业标准和国家标准都适用于地表水、地下水和污水中的粪大肠菌群的检测。

原理相同：多管发酵法是以最可能数简称MPN来表示试验结果的。

实际上它是根据统计学理论，估计水体中的大肠菌群密度和卫生质量的一种方法。

如果从理论上考虑，并且进行大量的重复检定，可以发现这种估计有大于实际数字的倾向。

不过只要每一稀释度试管重复数目增加，这种差异便会减少，对于细菌含量的估计值，大部分取决于那些既显示阳性又显示阴性的稀释度。

GB/ 肥料中粪大肠菌群的测定1 范围本标准规定了肥料中粪大肠菌群的测定方法。

2 定义粪大肠菌群 fecal coliforms系指一群在℃±℃条件能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌。

粪大肠菌群数为每克（毫升）肥料样品中粪大肠菌群的最可能数（MPN）。

3 设备和材料（内容略）4 培养基和试剂培养基：遵照附录A的规定。

革兰氏染色液：遵照附录B的规定（略）。

5 检验步骤样品稀释在无菌操作下称取样品g或吸取样品10mL，加入到带玻璃珠的90 mL无菌水中，置于摇床上200 r/min 充分振荡30min，即成10-1稀释液。

用无菌移液管吸取 mL上述稀释液加入到45 mL无菌水中，混匀成10-2稀释液。

这样依次稀释，分别得到10-3，10-4等浓度稀释液（每个稀释度须更换无菌移液管）。

乳糖发酵试验选取三个连续适宜稀释液，分别吸取不同稀释液mL加入到乳糖胆盐发酵管内，每一稀释度接种3支发酵管，置℃±℃恒温水浴或隔水式培养箱内，培养24h±2h。

如果所有乳糖胆盐发酵管都不产酸不产气，则为粪大肠菌群阴性；如果有产酸产气或只产酸的发酵管，则按进行。

分离培养从产酸产气或只产酸的发酵管中分别挑取发酵液在伊红美蓝琼脂平板上划线，置36℃±1℃条件下培养18h～24h。

证实试验从分离平板上挑取可疑菌落，进行革兰氏染色。

染色反应阳性者为粪大肠菌群阴性；如果为革兰氏阴性无芽胞杆菌则挑取同样菌落接种在乳糖发酵管中，置℃±℃条件下培养24h ±2h。

观察产气情况，不产气为粪大肠菌群阴性；产气为粪大肠菌群阳性。

结果证实实验为粪大肠菌群阳性的，根据粪大肠菌群阳性发酵管数，查MPN检索表，得出每克（毫升）肥料样品中的粪大肠菌群数。

附录 A（规范性附录）培养基乳糖胆盐发酵培养基蛋白胨g猪胆盐g乳糖g%溴甲酚紫水溶液m L蒸馏水1000m LpH值～制法：将蛋白胨、猪胆盐及乳糖溶解于蒸馏水中，校正pH，加入溴甲酚紫水溶液，然后分装试管，每管9mL，并放入一支倒置的小套管，高压灭菌115℃15min。

粪大肠菌群的测定1、半个月前配好初、复发酵所需培养液2、采样时用500ml 广口玻璃瓶分开采样，牛皮纸封口3、操作（1） 培养液初发酵 单倍乳糖蛋白胨培养液：蛋白胨 10 g牛肉浸膏 3 g乳糖 5 g氯化钠 5 g蒸馏水 1000ml调节PH 为7.2—7.4（NaOH ）6%溴甲基紫乙醇溶液 1 ml 充分混匀后 10ml （三倍是5ml ）分装于试管中，盖紧塞于蒸气锅中灭菌20min （0.1—0.5kpa ），冷却后于药品储存箱保存。

单月13个地表水（每个水样需10个单倍，5个三倍），2个创业（每个水样需15个单倍）。

共190个（1900ml ）单倍，65个三倍（325ml ）。

双月10个地表水，2个创业。

共130个（1600ml ）单倍，50个三倍（250ml ）。

创业的水一个月采两次水样复发酵 EC 培养液胰胨 20 g乳糖 5 g胆盐三号 1.5 g磷酸氢二钾 4 g磷酸二氢钾 1.5 g氯化钠 5 g蒸馏水 1000ml充分混匀后 10ml 分装于试管中，盖紧塞于蒸气锅中灭菌20min （0.1—0.5kpa ），冷却后于药品储存箱保存。

三倍乳糖蛋白胨培养液： 蛋白胨 30 g 牛肉浸膏 9 g 乳糖 15 g 氯化钠 15 g 蒸馏水 1000ml 溴甲基紫乙醇溶液 3 ml（2）做样初发酵：地表水15根管为一个水样。

5根为一组。

第一排为5ml三倍培养液，加10ml水样；第二排为10ml单倍培养液，加1ml水样；第三排为10ml单倍培养液，取1ml水样稀释至10ml后再从中取1ml至装有培养液的试管。

（10、1、0.1的取样量）创业，每个水样15根单倍。

同上逐级稀释，取样量为0.1、0.01、0.001ml。

将初发酵管放入培养箱中培养，温度为37℃±0.5℃，时间为24h±2h。

观察：产酸产气为阳性，即变色且有气泡产生，可轻击试管查气泡。

复发酵：呈阳性的试管进行接种后，做复发酵。

滤膜法与酶底物法检测污水中粪大肠菌群的比较分析滤膜法与酶底物法检测污水中粪大肠菌群的比较分析一、引言随着城市化进程的加速和人口的不断增长，污水处理成为一项重要的环保任务。

污水中的粪大肠菌群是评估水质和卫生水平的重要指标之一。

为了准确快速地检测污水中的粪大肠菌群，科学家们发展了各种检测方法。

其中，滤膜法和酶底物法是常用的两种方法，本文将对这两种方法进行比较分析。

二、滤膜法滤膜法是通过将粪大肠菌群附着在滤膜上，再通过计数形状与颜色进行检测。

其操作包括取样、滤膜萃取、滤膜染色和计数四个步骤。

滤膜法具有简单、直观、操作便捷等优势，被广泛应用于实际工作中。

然而，滤膜法的检测结果容易受到环境因素的干扰，例如水质的浑浊度、背景物质的影响等，这可能导致结果的不准确。

三、酶底物法酶底物法是通过检测粪大肠菌群特有的酶活性来间接测定其存在。

常用的指示剂是3-indoxyl-β-D-glucuronide（X-Gluc），它能与酶β-D-葡萄糖苷酸酶反应产生可见的蓝色产物。

这种方法的优势在于结果的准确性较高，而且不受环境因素的影响。

但是，酶底物法需要较长的检测时间，操作较为复杂，并且对仪器设备要求较高。

四、比较分析（1）准确性方面：滤膜法和酶底物法在检测粪大肠菌群方面均有较高的准确性，但是酶底物法的结果更为精确。

滤膜法容易受到环境因素的影响，导致结果的偏差。

（2）操作方面：滤膜法操作简便，流程清晰，不需要特殊的仪器设备，适用于现场快速检测。

酶底物法的操作较为复杂，需要仪器设备支持，所需时间较长。

（3）受环境因素影响方面：滤膜法受环境因素影响较大，如水质浑浊度、背景物质等因素会干扰检测结果。

酶底物法不受环境因素的影响，结果更为稳定。

（4）适用范围方面：滤膜法适用于对大量样品进行快速筛查，特别是现场检测。

酶底物法适用于对粪大肠菌群的高灵敏度检测，尤其适合于研究或实验室内的检测。

五、结论综上所述，滤膜法和酶底物法是常用于检测污水中粪大肠菌群的两种方法。

G B T肥料中粪大肠菌群的测定Document serial number【LGGKGB-LGG98YT-LGGT8CB-LGUT-GB/ 肥料中粪大肠菌群的测定1 范围本标准规定了肥料中粪大肠菌群的测定方法。

2 定义粪大肠菌群 fecal coliforms系指一群在℃±℃条件能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌。

粪大肠菌群数为每克（毫升）肥料样品中粪大肠菌群的最可能数（MPN）。

3 设备和材料（内容略）4 培养基和试剂培养基：遵照附录A的规定。

革兰氏染色液：遵照附录B的规定（略）。

5 检验步骤样品稀释在无菌操作下称取样品g或吸取样品10mL，加入到带玻璃珠的90 mL无菌水中，置于摇床上200r/min充分振荡30min，即成10-1稀释液。

用无菌移液管吸取 mL上述稀释液加入到45 mL无菌水中，混匀成10-2稀释液。

这样依次稀释，分别得到10-3，10-4等浓度稀释液（每个稀释度须更换无菌移液管）。

乳糖发酵试验选取三个连续适宜稀释液，分别吸取不同稀释液mL加入到乳糖胆盐发酵管内，每一稀释度接种3支发酵管，置℃±℃恒温水浴或隔水式培养箱内，培养24h±2h。

如果所有乳糖胆盐发酵管都不产酸不产气，则为粪大肠菌群阴性；如果有产酸产气或只产酸的发酵管，则按进行。

分离培养从产酸产气或只产酸的发酵管中分别挑取发酵液在伊红美蓝琼脂平板上划线，置36℃±1℃条件下培养18h～24h。

证实试验从分离平板上挑取可疑菌落，进行革兰氏染色。

染色反应阳性者为粪大肠菌群阴性；如果为革兰氏阴性无芽胞杆菌则挑取同样菌落接种在乳糖发酵管中，置℃±℃条件下培养24h ±2h。

观察产气情况，不产气为粪大肠菌群阴性；产气为粪大肠菌群阳性。

结果证实实验为粪大肠菌群阳性的，根据粪大肠菌群阳性发酵管数，查MPN检索表，得出每克（毫升）肥料样品中的粪大肠菌群数。

滤膜法-粪大肠菌群的测定1、适用范围本标准适用于地表水、地下水、及水中粪大肠菌群的测定。

用于检验加氯消毒的水样时，在滤膜法之前，先做试验，证实它所得的数据资料与多管发酵试验所得的数据资料具有可比性。

2、原理滤膜是一种微孔性薄膜。

将水样注入已灭菌的放有滤膜（孔径0.45微米）的滤器中，经过抽滤，细菌即被截留在膜上，然后将滤膜贴于M-FC培养基上，44.5℃温度下进行培养，计数滤膜上生长的此特性的菌落数，计算出每1L水样中含有粪大肠菌群数。

3仪器：滤膜（孔径0.45微米）、滤器、接液瓶、垫圈、无菌镊子夹3、培养基和试剂本标准所用试剂除另有注明外，均为符合国家标准的分析纯化学试剂，实验室用水为新制备的去离子水。

M-FC培养基：胰胨 10g蛋白胨 5g酵母浸膏 3.0g氯化钠 5.0g乳糖 12.5g胆盐三号 1.5g1%苯胺蓝水溶10ml1%玫瑰色酸溶液（溶于0.2mol/L氢氧化钠液中）10ml蒸馏水 1000ml制法：将上述培养基中的成分（除苯胺蓝和玫瑰色酸外），置于蒸馏水中加热溶解，调节PH为7.4，分装于小烧瓶内，每瓶100ml，于115℃灭菌20min。

储存于冰箱中备用，临用前，按上述配比，用灭菌吸管分别加入已煮沸灭菌的1%苯胺蓝溶液1ml及新配制的1%玫瑰色酸溶液（溶于氢氧化钠溶液）1ml，混合均匀。

加热溶解前，加入 1.2%～1.5%琼脂制成固体培养基。

如培养物中杂菌不多，则培养基中不加玫瑰色酸亦可。

4、步骤水样的选择：水样量的选择根据细菌受检验的特征和水样中预测的细菌密度而定。

理想的水样体积是一片滤膜上生长20～60个粪大肠群菌落，总菌落数不超过200个。

滤膜及滤膜灭菌：将滤膜放入高压蒸汽灭菌锅里在121℃灭菌10min，滤器、接液瓶、垫圈分别用纸包好，在使用前经121℃灭菌20min，滤器也可用点燃的酒精棉球火焰灭菌。

过滤：用无菌镊子夹取灭菌滤膜边缘，将粗糙面向上，贴放在已灭菌的滤床上，稳妥的固定好滤器。

方法验证报告项目名称：粪大肠菌群的测定方法名称：水质粪大肠菌群的测定滤膜法报告编写人：参加人员：审核人员：报告日期：1 实验室基本情况1.1人员情况表1参加验证的人员情况登记表1.2 检测仪器/设备情况表2使用仪器情况登记表1.3 检测用试剂情况表3使用试剂登记表1.4 环境设施和条件情况实验室具有检定合格的温湿度计，环境可以控制在温度18⁓26℃，湿度45%⁓65%的要求范围内，满足检测环境条件，实验室人员每天对环境条件进行监控。

另外实验室配备了洗眼器、喷淋设施、护目镜、灭火器等的安全防护措施，符合实验室安全内务的要求。

2 实验室检测技术能力2.1适用范围本标准适用于地表水、地下水、生活污水和工业废水中粪大肠菌群的的测定。

本方法的检出限为:当接种量为100ml时，检出限为10CFU/L;当接种量为500ml时，检出限为2CFU/L。

2.2 样品保存采样后应在2h内检测，否则，应10℃以下冷藏但不得超过6h。

实验室接样后，不能立即开展检测的，将样品在4℃以下冷藏并在2h内检测。

2.3检测步骤2.3.1样品过滤根据样品的种类判断接种量，最小过滤体积为10ml ,如接种量小于10ml时应逐级稀释。

先估计出适合在滤膜上计数所使用的体积，然后再取这个体积的1/10和10倍，分别过滤。

理想的样品接种量是滤膜上生长的粪大肠菌群菌落数为20-60个，总菌落数不得超过200个。

当最小过滤体积为10ml 时，滤膜上菌落密度仍过大时，则应对样品进行稀释。

1：10稀释的方法为：吸取10ml样品，注入盛有90ml无菌水的三角瓶中，混匀，制成1：10稀释样品。

用灭菌镊子以无菌操作夹取无菌滤膜，贴放在已灭菌的过滤装置上，固定好过滤装置，将样品充分混匀后抽滤，以无菌水冲洗器壁2-3次。

样品过滤完成后，再抽气约5秒，关上开关。

2.3.2培养用灭菌镊子夹取滤膜移放在MFC培养基上，滤膜截留细菌面朝上，滤膜应与培养基完全贴紧，两者间不得留有气泡，然后将培养皿倒置，放入恒温培养箱内，（44.5±0.5）℃培养24h±2h。

滤膜法测定粪大肠菌群37.1.1 主题内容与适用范围本方法规定了生活饮用水中粪大肠菌群的滤膜测定方法。

本方法适用于生活饮用水和低浊度的水源水中粪大肠菌群数的测定。

37.1.2 方法提要用孔径为0.45μm的微孔滤膜过滤水样，细菌被截留在滤膜上，将滤膜贴在MFC培养基上，经44.5℃培养后，计数典型菌落。

37.1.3 培养基与试剂37.1.3.1 MFC培养基37.1.3.1.1 成份A 胰胨 10gB 多胨 5gC 酵母浸膏 3gD 氯化钠 5gE 乳糖 12.5gF 胆盐3号(Bile salt No.3)或混合胆盐 1.5gG 琼脂 15gH 苯胺蓝 0.2gI 蒸馏水 1000mL37.1.3.1.2 制法: 在1000mL蒸馏水中先加入玫红酸(10g/L)的氢氧化钠溶液[C(NaOH)＝0.2mol/L] 10mL，混合后，取500mL加入琼脂煮沸溶解，于另外500mL 蒸馏水中，加入除苯胺蓝以外的其他试剂，加热溶解，倒入已溶解的琼脂，混匀后调pH为7.4，加入苯胺蓝煮沸，迅速离开热源，待冷却至60℃左右，制成平板，不可高压灭菌。

制好的培养基应存放于2～10℃，不超过96h。

本培养基也可不加琼脂，制成液体培养基，使用时加2mL于灭菌吸收垫上，再将滤膜置于培养垫上培养。

37.1.3.2 EC培养基37.1.3.2.1 成份A 胰蛋白胨 20gB 乳糖 5g37.1.1 主题内容与适用范围本方法规定了生活饮用水中粪大肠菌群的滤膜测定方法。

本方法适用于生活饮用水和低浊度的水源水中粪大肠菌群数的测定。

37.1.2 方法提要用孔径为0.45μm的微孔滤膜过滤水样，细菌被截留在滤膜上，将滤膜贴在MFC培养基上，经44.5℃培养后，计数典型菌落。

37.1.3 培养基与试剂37.1.3.1 MFC培养基37.1.3.1.1 成份A 胰胨 10gB 多胨 5gC 酵母浸膏 3gD 氯化钠 5gE 乳糖 12.5gF 胆盐3号(Bile salt No.3)或混合胆盐 1.5gG 琼脂 15gH 苯胺蓝 0.2gI 蒸馏水 1000mL37.1.3.1.2 制法: 在1000mL蒸馏水中先加入玫红酸(10g/L)的氢氧化钠溶液[C(NaOH)＝0.2mol/L] 10mL，混合后，取500mL加入琼脂煮沸溶解，于另外500mL 蒸馏水中，加入除苯胺蓝以外的其他试剂，加热溶解，倒入已溶解的琼脂，混匀后调pH为7.4，加入苯胺蓝煮沸，迅速离开热源，待冷却至60℃左右，制成平板，不可高压灭菌。

GB/ 肥料中粪大肠菌群的测定1 范围本标准规定了肥料中粪大肠菌群的测定方法。

2 定义粪大肠菌群 fecal coliforms系指一群在℃±℃条件能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌。

粪大肠菌群数为每克（毫升）肥料样品中粪大肠菌群的最可能数（MPN）。

3 设备和材料（内容略）4 培养基和试剂培养基：遵照附录A的规定。

革兰氏染色液：遵照附录B的规定（略）。

5 检验步骤样品稀释在无菌操作下称取样品g或吸取样品10mL，加入到带玻璃珠的90 mL无菌水中，置于摇床上200 r/min 充分振荡30min，即成10-1稀释液。

用无菌移液管吸取 mL上述稀释液加入到45 mL无菌水中，混匀成10-2稀释液。

这样依次稀释，分别得到10-3，10-4等浓度稀释液（每个稀释度须更换无菌移液管）。

乳糖发酵试验选取三个连续适宜稀释液，分别吸取不同稀释液mL加入到乳糖胆盐发酵管内，每一稀释度接种3支发酵管，置℃±℃恒温水浴或隔水式培养箱内，培养24h±2h。

如果所有乳糖胆盐发酵管都不产酸不产气，则为粪大肠菌群阴性；如果有产酸产气或只产酸的发酵管，则按进行。

分离培养从产酸产气或只产酸的发酵管中分别挑取发酵液在伊红美蓝琼脂平板上划线，置36℃±1℃条件下培养18h～24h。

证实试验从分离平板上挑取可疑菌落，进行革兰氏染色。

染色反应阳性者为粪大肠菌群阴性；如果为革兰氏阴性无芽胞杆菌则挑取同样菌落接种在乳糖发酵管中，置℃±℃条件下培养24h ±2h。

观察产气情况，不产气为粪大肠菌群阴性；产气为粪大肠菌群阳性。

结果证实实验为粪大肠菌群阳性的，根据粪大肠菌群阳性发酵管数，查MPN检索表，得出每克（毫升）肥料样品中的粪大肠菌群数。

附录 A（规范性附录）培养基乳糖胆盐发酵培养基蛋白胨g猪胆盐g乳糖g%溴甲酚紫水溶液m L蒸馏水1000m LpH值～制法：将蛋白胨、猪胆盐及乳糖溶解于蒸馏水中，校正pH，加入溴甲酚紫水溶液，然后分装试管，每管9mL，并放入一支倒置的小套管，高压灭菌115℃15min。

滤膜法测定地表水中粪大肠菌群的测量不确定度评定方法2北京同仁堂健康药业股份有限公司摘要：通过对《水质粪大肠菌群的测定滤膜法》（HJ347.1-2018）的不确定度分析、评定，从结论中可分析该方法的实验误差，为该方法的提高该方法的数据准确的提供依据。

同时也可为其他水中微生物指标的不确定度评定提供参考。

关键词：粪大肠菌群；不确定度评定；地表水引言：粪大肠菌群即耐热大肠菌群，并非细菌学分类名称，而是卫生学用语，它们指的不是某一种或某一属细菌，而是一类细菌，是指在44.5℃培养24h，能够发酵乳糖产酸产气的需氧及兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。

主要包括大肠埃希氏菌属和耐热的克雷伯菌属细菌，是生长于人和温血动物肠道中的一类肠道细菌。

它主要来自粪便，在自然界中易死亡，若检出则说明检测对象近期受到了粪便污染，水体中存在着被粪便污染的可能性，暗藏着中毒和传染病的威胁，对人群健康具有一定的危险性。

不确定度评定是表示被测量数据分散性的非负数值，是判断测定结果有效性的重要依据。

【1】通过对检测结果测量不确定度的评定，可以分析出检测过程中哪些因素需要重点关注，从而提高检测能力，确保数据准确。

本文分析滤膜法测定地表水中粪大肠菌群过程中引入不确定度的来源，比较各不确定度分量所占的比重，计算地表水中粪大肠菌群测定结果的测量不确定度，从而定量描述地表水中粪大肠菌群测定结果的测量扩展不确定度。

为类似粪大肠菌群测定结果不确定度的评定提供参考。

1材料与方法1.1试验材料地表水：采自北京市丰台区马草河；MFC培养基：北京陆桥技术股份有限公司；无菌滤膜：直径50mm，孔径0.45μm，广东环凯微生物科技有限公司。

1.2仪器与设备BHC-1300A2型生物安全柜：苏州博莱尔净化设备有限公司；BXM-30R型立式压力蒸汽灭菌器：上海博迅实业有限公司；GHP-9050N隔水式培养箱：上海一恒科学仪器有限公司；AB135-S电子天平（±0.1g）：瑞士梅特勒-托利多公司；MFS-3A-250-K不锈钢多联过滤系统：广东环凯微生物科技有限公司；采样瓶：500mL带旋塞的广口采样瓶；培养皿：直径90mm，北京陆桥技术股份有限公司。

G B T肥料中粪大肠菌群的测定集团标准化工作小组 #Q8QGGQT-GX8G08Q8-GNQGJ8-MHHGN#GB/ 肥料中粪大肠菌群的测定1 范围本标准规定了肥料中粪大肠菌群的测定方法。

2 定义粪大肠菌群 fecal coliforms系指一群在℃±℃条件能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌。

粪大肠菌群数为每克（毫升）肥料样品中粪大肠菌群的最可能数（MPN）。

3 设备和材料（内容略）4 培养基和试剂培养基：遵照附录A的规定。

革兰氏染色液：遵照附录B的规定（略）。

5 检验步骤样品稀释在无菌操作下称取样品g或吸取样品10mL，加入到带玻璃珠的90 mL无菌水中，置于摇床上200r/min充分振荡30min，即成10-1稀释液。

用无菌移液管吸取 mL上述稀释液加入到45 mL无菌水中，混匀成10-2稀释液。

这样依次稀释，分别得到10-3，10-4等浓度稀释液（每个稀释度须更换无菌移液管）。

乳糖发酵试验选取三个连续适宜稀释液，分别吸取不同稀释液mL加入到乳糖胆盐发酵管内，每一稀释度接种3支发酵管，置℃±℃恒温水浴或隔水式培养箱内，培养24h±2h。

如果所有乳糖胆盐发酵管都不产酸不产气，则为粪大肠菌群阴性；如果有产酸产气或只产酸的发酵管，则按进行。

分离培养从产酸产气或只产酸的发酵管中分别挑取发酵液在伊红美蓝琼脂平板上划线，置36℃±1℃条件下培养18h～24h。

证实试验从分离平板上挑取可疑菌落，进行革兰氏染色。

染色反应阳性者为粪大肠菌群阴性；如果为革兰氏阴性无芽胞杆菌则挑取同样菌落接种在乳糖发酵管中，置℃±℃条件下培养24h ±2h。

观察产气情况，不产气为粪大肠菌群阴性；产气为粪大肠菌群阳性。

结果证实实验为粪大肠菌群阳性的，根据粪大肠菌群阳性发酵管数，查MPN检索表，得出每克（毫升）肥料样品中的粪大肠菌群数。

附录 A（规范性附录）培养基乳糖胆盐发酵培养基蛋白胨g猪胆盐g乳糖g%溴甲酚紫水溶液m L蒸馏水1000m LpH值～制法：将蛋白胨、猪胆盐及乳糖溶解于蒸馏水中，校正pH，加入溴甲酚紫水溶液，然后分装试管，每管9mL，并放入一支倒置的小套管，高压灭菌115℃15min。

多管发酵法与滤膜法测定粪大肠菌群对照实验引言；水中粪大肠菌群的测定是污水处理的重要指标之一，环境监测的重要意义指通过对影响环境质量因素的代表值的测定，确定环境质量（或污染程度）及其变化趋势，从而指导工艺。

然而面对每天繁重的监测工作，如何使实验更准确，方法更简便，是我们实验人员更加关注的问题。

本文主要讨论多管发酵法与滤膜法测定粪大肠菌群这两种方法，通过实验对照，确定一个最佳方法用于工艺指导。

粪大肠菌群是水质污染的重要指标之一。

目前，我国地表水及废水中粪大肠菌群的监测方法主要有传统的多管发酵法（MTF）及滤膜法（MF。

无论是哪一种方法，都是利用其可在高温生长并发酵乳糖产酸产气的特点，所以实验过程最终要的环节是严格地控制好温度。

本实验通过采用传统多管发酵法与滤膜法，对大量实际水样中的粪大肠菌群同步检测，进行比对实验，实验结果进行比较分析。

一、实验部分1、多管发酵法1.1 培养基的准备①乳糖蛋白胨培养液：称取23.3g 乳糖蛋白胨培养液于1L 超纯水中，分装于有倒立发酵管的试管中，120 度高温灭菌15 分钟。

单倍培养液取10ml，准备10支。

三倍培养液取5ml，准备5 支。

② EC 肉汤：称取3.7g EC 肉汤于1L 超纯水中，分装于有倒立发酵管的试管中，120度高温灭菌15分钟，每管8ml，准备10支。

1.2 实验方法①根据我厂的出水情况，接种量分别为10ml、1ml、0.1ml，接种体积10ml 的水样装入3倍乳糖蛋白胨培养液中，共5支。

接种体积1ml 和0.1ml 的水样各装入单倍乳糖蛋白胨培养液中，分别5 支。

共15 支。

②在37C± 0.5 C下培养24± 2h,产酸和产气的发酵管表明实验阳性。

③如在导管内产气不明显，可将实验结果为阳性的发酵管和产气不明显难以确认的发酵管，用灭菌的接种棒转接到EC培养液中，在45C± 0.5 C下培养24±2h,培养后观察结果，发酵管产气则证明为粪大肠菌群阳性。

粪大肠杆菌的测定（滤膜法）方法参照HJ/T 347—2007，方法步骤为两大步第一部分为准备阶段：一、M-FC固体培养基的配制配制方法参照HJ/T 347—2007，用精密PH试纸测PH,用10％HCl和10％NaOH调节PH二、玻璃器皿的洗涤和包装1.洗涤玻璃器皿在使用前必须洗涤干净。

培养皿、试管、锥形瓶等可用洗衣粉加去污粉洗刷并用自来水冲洗。

移液管先用洗液浸泡，再用水冲洗干净。

洗刷干净的玻璃器皿自然晾干或放入烘箱中烘干，备用。

2.包装⑴移液管的吸端用细铁丝将少许棉花塞入构成1-⒈5cm长的棉塞。

棉塞要塞得松紧适宜，吸时既能通气，又不致使棉花滑入管内。

将塞好棉花的移液管的尖端，放在4-5cm宽的长纸条的一端，移液管与纸条约成30°夹角，折叠包装纸包住移液管的尖端，用左手将移液管压紧，在桌面上向前搓转，字条螺旋式的包在移液管外面，余下纸头折叠打结，待灭菌。

⑵用棉塞将试管管口或锥形瓶瓶口塞住，用牛皮纸或报纸将瓶口或试管口捆扎好然后待灭菌。

⑶培养皿由一底一盖组成一套，用牛皮纸或报纸包好待灭菌。

三、无菌稀释水的配制1.去一个250ml的锥形瓶装90ml蒸馏水，放30颗玻璃珠于锥形瓶内，塞棉塞、包扎、待灭菌。

2.另取2支25mm×200mm的试管，分别装9ml蒸馏水，塞棉塞、包扎、待灭菌。

四、水样的稀释方法⑴将水样用力振摇，是可能存在的细菌凝团成分散状。

⑵以无菌操作方法吸取10ml充分混匀的水样，注入盛有90ml灭菌水的锥形瓶中混匀成1:10的稀释液⑶吸取1:10的稀释液1ml注入盛9ml灭菌水是试管中，混匀成1:100的稀释液。

同法依次稀释成1:1000的稀释液。

吸取不同浓度稀释液时，必须更换吸管。

第二部分为测定阶段此阶段完全参照HJ/T 347—2007滤膜法步骤，在紫外灭菌灯下操作，分3个培养皿，一个做空白对照，另外做两个平行样。

大肠杆菌的检测方法国标
大肠杆菌是一种常见的肠道细菌，可用于评价食品和水的卫生质量。

因此，大肠杆菌的检测方法在食品、水处理等领域被广泛采用。

本文将介绍国际上常见的大肠杆菌检测方法国标。

一、 ISO 9308-1：水质–检测和计数大肠杆菌–第1部分：膜过滤法
该标准适用于检测与供水、游泳池、浴缸等有关的水样中的大肠杆菌。

该标准使用膜过滤技术，将水样过滤通过0.45微米的滤膜上的杆菌层，然后将滤膜培养在培养基上，检测和计数大肠杆菌的数量。

该标准具有简便、快捷、准确等特点。

二、ISO 21150：食品和饲料–检测和计数大肠杆菌和厌氧菌–气相培养法
该标准适用于肉、肠衣、豆腐等食品样品，通过瓶内培养的方法检测大肠杆菌的数量。

该标准使用培养基使大肠杆菌产生二氧化碳，然后采用气相色谱技术检测二氧化碳的量，以计算大肠杆菌的数量。

该标准的优点是能在单一瓶中同时检测大肠杆菌和厌氧菌的数量。

三、ISO 9308-2：水质–检测和计数大肠杆菌和沙门氏菌–第2部分：多管发酵管技术
该标准适用于检测污染水样和废水样品中的大肠杆菌和沙门氏菌。

该标准使用多管发酵管技术，将水样转移到多个管子中，这些管子中的培养基不断地搅拌，检测管子中产生的气体，以检测大肠杆菌和沙门氏菌的数量。

该标准较为耗时，但能同时检测两种菌群。

以上三种标准是国际上常见的用于大肠杆菌检测的方法。

在具体应用中可以选择适宜的方法，选择合适的培养基，并按照标准操作规范执行测试，以得到准确可靠的检测结果。

检测分析方法验证报告报告编号:xxxxxxx方法名称：水质粪大肠菌群测定滤膜法验证人员：xxx xxx审核人员：xxx验证日期：xxxx年xx月xx日xxxxxx有限公司水质粪大肠菌群测定滤膜法一、方法依据本方法依据《水质粪大肠菌群的测定滤膜法》（HJ 347.1-2018）用滤膜法测定水中粪大肠菌群，适用于地表水、地下水、生活污水以及工业废水的粪大肠菌群测定。

本方法的检出限为，当接种量为100mL时，检出限为10CFU/L；当接种量为500mL时，检出限为2CFU/L。

二、方法原理将待测样品通过孔径为0.45μm的滤膜过滤，然后将滤膜置于MFC选择性培养基上，在44.5℃条件下培养24h，粪大肠菌群生长并发酵乳糖使指示剂变色，通过颜色判断是否产酸，并通过呈蓝色或蓝绿色菌落计数，测定样品中粪大肠菌群浓度。

样品采集时可加入硫代硫酸钠溶液消除活性氯对样品的干扰，或加入乙二胺四乙酸二钠溶液消除重金属离子对样品的干扰。

参加验证的人员情况登记表使用仪器情况登记表使用试剂及溶剂登记表三、分析步骤3.1样品过滤3.1.1待检样品组本次选用的待检样品为xx水源水，其接种量为100mL、10mL,最小过滤体积为10mL，接种量小于10mL时，应逐级稀释。

在无菌操作下用灭菌镊子夹取无菌滤膜贴放在已灭菌的过滤装置上，固定好过滤装置，将样品充分混匀后抽滤，以无菌水冲洗器壁2次。

样品过滤完后在抽气3s。

3.1.2阳性对照：取一粒大肠埃希氏菌（ATCC 25922）磁珠置于BHI液体培养液中，24h培养，使之菌悬液浓度在109CFU/mL，用无菌生理盐水按照10倍系列稀释法，稀释至10-7至10-8。

取10-7大肠埃希氏菌菌悬液进行接种，其接种量为100mL、10mL，最小过滤体积为10mL，接种量小于10mL时，应逐级稀释。

在无菌操作下用灭菌镊子夹取无菌滤膜贴放在已灭菌的过滤装置上，固定好过滤装置，将样品充分混匀后抽滤，以无菌水冲洗器壁2次。

中华人民共和国国家环境保护标准HJ 347.1-2018部分代替HJ/T 347-2007水质粪大肠菌群的测定滤膜法Water quality—Determination of fecal coliform—Membrane filtration（发布稿）本电子版为发布稿。

请以中国环境出版集团出版的正式标准文本为准。

2018-12-26 发布2019-06-01 实施生态环境部发布目次前言 (ii)1适用范围 (1)2规范性引用文件 (1)3术语和定义 (1)4方法原理 (1)5干扰和消除 (1)6试剂和材料 (2)7仪器和设备 (2)8样品 (3)9分析步骤 (3)10结果计算与表示 (5)11精密度和准确度 (6)12质量保证和质量控制 (6)13废物处理 (7)14注意事项 (7)附录A（资料性附录）粪大肠菌群检验记录及报告格式 (8)i前言为贯彻《中华人民共和国环境保护法》和《中华人民共和国水污染防治法》，保护生态环境，保障人体健康，规范水中粪大肠菌群的测定方法，制定本标准。

本标准规定了测定地表水、地下水、生活污水和工业废水中粪大肠菌群的滤膜法。

本标准是对《水质粪大肠菌群的测定多管发酵法和滤膜法（试行）》（HJ/T 347-2007）滤膜法部分的修订。

本标准首次发布于2007年，原起草单位为中国环境监测总站。

本次为第一次修订。

本次修订的主要内容如下：——完善了方法原理的表述；——增加了检出限；——增加了规范性引用文件、术语和定义、干扰和消除、仪器和设备、样品采集、样品保存、精密度和准确度、质量保证和质量控制、废物处理等章节；自本标准实施之日起，《水质粪大肠菌群的测定多管发酵法和滤膜法（试行）》（HJ/T347-2007）废止。

本标准的附录A为资料性附录。

本标准由生态环境部生态环境监测司、法规与标准司组织制订。

本标准起草单位：辽宁省环境监测实验中心。

本标准验证单位：大连市环境监测中心、丹东市环境监测中心站、锦州市环境监测中心站、辽阳市环境监测站、铁岭市环境保护监测站和沈阳市疾病预防控制中心。

滤膜法检测粪大肠菌群方法摘要：在水质分析中，采用粪大肠菌群滤膜法所需的仪器简单，操作简便快捷，适用于地表水、地下水等杂质较少水样。

对此实验方法易产生的问题及影响测定值的因素进行分析，提出了几个关键的问题及改进措施，以提高粪大肠菌群测定的效率及精度。

关键词：粪大肠菌群滤膜法注意事项C35 A大肠菌群是卫生防疫和环境保护监督执法的重要评价指标。

多年来大肠菌群作为卫生环境评价的指标，在传染病防治、食品卫生质量监测、污水综合排放控制评价、水资源生态环境变化等方面发挥了巨大作用。

目前国内的粪大肠菌群检测方法有多管发酵法、滤膜法、酶法、LTSE法和纸片法等。

其中，滤膜法检测粪大肠菌群，是利用微孔滤膜过滤一定量水样，将水样中含有的细菌截留在滤膜上，然后将滤膜贴在选择性培养基上，经培养和证实试验后，直接计数滤膜上生长的典型粪大肠菌群菌落，并计算出每升水样中含有的粪大肠菌群数。

本研究主要是针对滤膜法再实际监测工作中的可行性，利用实际水样对滤膜法与发酵法监测结果进行对比，并对滤膜法的重复性和准确性进行统计与评价。

一、概述粪大肠菌群是总大肠菌群的一个亚种，直接来自粪便，它除了耐热，在44~44.5℃的高温条件仍可生长繁殖并将色氨基酸代写成吲哚处，其他特性均与总大肠菌群相同。

总大肠菌群中的细菌除了生活在肠道中，在自然环境中的水与土壤也经常存在，但在这些自然环境中生活的大肠菌群培养的最适合温度为25℃，如在37℃培养则仍可生长，但如果将培养温度上升至44℃则不可生长，而直接来自粪便的大肠菌群，习惯于37℃左右生长，如将培养温度升高至44.5℃仍可继续生长。

因此，可用提高培养温度的方法将自然环境中的大肠菌群与粪便中的大肠菌群区分开。

在37℃培养生长的大肠菌群，包括粪便内生长的大肠菌群成为总大肠菌群 Total colifrom，在44.5℃仍能生长的大肠菌群称为粪大肠菌群 Fecal colifrom，粪大肠菌群细菌在卫生学上具有重要的意义。