GBT 肥料中粪大肠菌群的测定

粪大肠菌群的测定1 卫生学意义粪大肠菌群测定的卫生学意义：一、与大肠菌群相比，粪大肠菌群在人和动物粪便中所占的比例较大，而且在自然界容易死亡。

因此，粪大肠菌群的存在表明食品近期内可能直接或间接的受到了粪便的污染；二、作为粪便污染指标评价食品的卫生状况，推断食品中肠道致病菌污染的可能性；三、常用做贝类和贝类养殖用水的卫生指标。

2 检验方法2.1 术语与定义一群在44.5 °C培养24h-48h能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧革兰氏阴性无芽胞杆菌。

卫生学概念，又称为耐热大肠菌群，主要是大肠杆菌，但也包括克雷伯氏菌属等。

2.2 设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：(1)恒温培养箱：36C±1C。

(2)冰箱：2C〜5C。

( 3)恒温水浴箱：46C±1C。

( 4)天平：感量0.1g 。

(5)无菌吸管：1mL(具0.01m该U度)、10mL(具0.1m该U度)或微量移液器及吸头。

( 6)无菌锥形瓶：容量500mL。

( 7)无菌培养皿：直径90mm。

(8) pH计或pH比色管或精密pH试纸。

2.3 培养基和试剂(1)月桂基硫酸盐胰蛋白胨(Lauryl Sulfate Tryptose , LST)肉汤：1) 成分：胰蛋白胨或胰酪胨：20.0g ;氯化钠：5.0g ;乳糖：5.0g ;磷酸氢二钾(KHPO): 2.75g ;磷酸二氢钾(KHPQ): 2.75g ;月桂基硫酸钠：0.1g ; 蒸馏水：1000mL; pH：6.8±0.22) 制法：将上述成分溶解于蒸馏水中，调节pH。

分装到有玻璃小倒管的试管中，每管10 mL。

121 C高压灭菌15 min。

(2)EC肉汤(E.coli , BGLB :1)成分：胰蛋白胨或胰酪胨：20.0 g; 3号胆盐或混合胆盐：1.5 g；乳糖:5.0g ;磷酸氢二钾(K2HPQ) : 4.0g ;磷酸二氢钾(KHPQ) : 1.5g ;氯化钠：5.0g ; 蒸馏水：1000mL pH:6.9 ± 0.1。

粪大肠菌群的测定1、半个月前配好初、复发酵所需培养液2、采样时用500ml 广口玻璃瓶分开采样，牛皮纸封口3、操作（1） 培养液初发酵 单倍乳糖蛋白胨培养液：蛋白胨 10 g牛肉浸膏 3 g乳糖 5 g氯化钠 5 g蒸馏水 1000ml调节PH 为7.2—7.4（NaOH ）6%溴甲基紫乙醇溶液 1 ml 充分混匀后 10ml （三倍是5ml ）分装于试管中，盖紧塞于蒸气锅中灭菌20min （0.1—0.5kpa ），冷却后于药品储存箱保存。

单月13个地表水（每个水样需10个单倍，5个三倍），2个创业（每个水样需15个单倍）。

共190个（1900ml ）单倍，65个三倍（325ml ）。

双月10个地表水，2个创业。

共130个（1600ml ）单倍，50个三倍（250ml ）。

创业的水一个月采两次水样复发酵 EC 培养液胰胨 20 g乳糖 5 g胆盐三号 1.5 g磷酸氢二钾 4 g磷酸二氢钾 1.5 g氯化钠 5 g蒸馏水 1000ml充分混匀后 10ml 分装于试管中，盖紧塞于蒸气锅中灭菌20min （0.1—0.5kpa ），冷却后于药品储存箱保存。

三倍乳糖蛋白胨培养液： 蛋白胨 30 g 牛肉浸膏 9 g 乳糖 15 g 氯化钠 15 g 蒸馏水 1000ml 溴甲基紫乙醇溶液 3 ml（2）做样初发酵：地表水15根管为一个水样。

5根为一组。

第一排为5ml三倍培养液，加10ml水样；第二排为10ml单倍培养液，加1ml水样；第三排为10ml单倍培养液，取1ml水样稀释至10ml后再从中取1ml至装有培养液的试管。

（10、1、0.1的取样量）创业，每个水样15根单倍。

同上逐级稀释，取样量为0.1、0.01、0.001ml。

将初发酵管放入培养箱中培养，温度为37℃±0.5℃，时间为24h±2h。

观察：产酸产气为阳性，即变色且有气泡产生，可轻击试管查气泡。

复发酵：呈阳性的试管进行接种后，做复发酵。

粪大肠菌群的测定1、半个月前配好初、复发酵所需培养液2、采样时用500ml 广口玻璃瓶分开采样，牛皮纸封口3、操作（1） 培养液初发酵 单倍乳糖蛋白胨培养液：蛋白胨 10 g牛肉浸膏 3 g乳糖 5 g氯化钠 5 g蒸馏水 1000ml调节PH 为7.2—7.4（NaOH ）6%溴甲基紫乙醇溶液 1 ml 充分混匀后 10ml （三倍是5ml ）分装于试管中，盖紧塞于蒸气锅中灭菌20min （0.1—0.5kpa ），冷却后于药品储存箱保存。

单月13个地表水（每个水样需10个单倍，5个三倍），2个创业（每个水样需15个单倍）。

共190个（1900ml ）单倍，65个三倍（325ml ）。

双月10个地表水，2个创业。

共130个（1600ml ）单倍，50个三倍（250ml ）。

创业的水一个月采两次水样复发酵 EC 培养液胰胨 20 g乳糖 5 g胆盐三号 1.5 g磷酸氢二钾 4 g磷酸二氢钾 1.5 g氯化钠 5 g蒸馏水 1000ml充分混匀后 10ml 分装于试管中，盖紧塞于蒸气锅中灭菌20min （0.1—0.5kpa ），冷却后于药品储存箱保存。

三倍乳糖蛋白胨培养液： 蛋白胨 30 g 牛肉浸膏 9 g 乳糖 15 g 氯化钠 15 g 蒸馏水 1000ml 溴甲基紫乙醇溶液 3 ml（2）做样初发酵：地表水15根管为一个水样。

5根为一组。

第一排为5ml三倍培养液，加10ml水样；第二排为10ml单倍培养液，加1ml水样；第三排为10ml单倍培养液，取1ml水样稀释至10ml后再从中取1ml至装有培养液的试管。

（10、1、0.1的取样量）创业，每个水样15根单倍。

同上逐级稀释，取样量为0.1、0.01、0.001ml。

将初发酵管放入培养箱中培养，温度为37℃±0.5℃，时间为24h±2h。

观察：产酸产气为阳性，即变色且有气泡产生，可轻击试管查气泡。

复发酵：呈阳性的试管进行接种后，做复发酵。

方法验证报告项目名称：粪大肠菌群的测定方法名称：GB 18466-2005粪大肠菌群的检测方法报告编写人：参加人员：审核人员：报告日期：1 实验室基本情况1.1人员情况表1参加验证的人员情况登记表1.2 检测仪器/设备情况表2使用仪器情况登记表1.3 检测用试剂情况表3使用试剂登记表1.4 环境设施和条件情况实验室具有检定合格的温湿度计，环境可以控制在温度18⁓26℃，湿度45%⁓65%的要求范围内，满足检测环境条件，实验室人员每天对环境条件进行监控。

另外实验室配备了洗眼器、喷淋设施、护目镜、灭火器等的安全防护措施，符合实验室安全内务的要求。

2 实验室检测技术能力2.1样品采集与保存按照HJ 91.1的相关规定进行水样的采集。

采集样品时，采样瓶不得用样品洗涤，采集样品于灭菌的采样瓶中。

水体采样量不低于200 ml。

样品采集完毕后，迅速扎上无菌包装纸。

采集废水样品及一定深度的样品时，也可使用灭菌过的专用采样装置采样。

如果采集的是含有活性氯的样品，需在采样瓶灭菌前加入硫代硫酸钠溶液，以除去活性氯对细菌的抑制作用（每125mL容积加入0.1g/ml的硫代硫酸钠0.1mL）。

采样后应在2 h内检测，否则，应10⁓以下冷藏但不得超过6 h。

实验室接样后，不能立即开展检测的，将样品于4⁓以下冷藏并在2 h内检测。

2.2 检测步骤2.2.1样品准备污水样品至少取200ml，使用前应充分混匀。

根据预计的污水样品中粪大肠菌群数确认污水样品接种量。

粪大肠菌群数量相对较少的接种量一般为10、1、0.1ml。

粪大肠菌群较多时接种量为1、0.1、0.01ml或0.1、0.01、0.001ml等。

接种量少于1ml时，水样应制成稀释样品后供发酵实验使用。

接种量为0.1、0.01ml时，取稀释比分别为1:10、1:100.其他接种量的稀释比依此类推。

1:10稀释样品的制作方法为：吸取1ml水样，注入盛有9ml灭菌水的试管中，混匀，制成1:10稀释样品。

粪大肠菌群国家标准粪大肠菌群是指存在于人和动物的胃肠道内的一类细菌群，其中包括了大肠杆菌等多种细菌。

这些细菌在人体内起着重要的生理功能，但同时也可能引发多种疾病。

因此，制定粪大肠菌群国家标准对于保障公共卫生安全、食品安全和环境卫生具有重要意义。

首先，粪大肠菌群国家标准应明确细菌的检测方法和标准。

目前，常用的检测方法包括培养法、PCR法等，国家标准应明确不同检测方法的适用范围和标准要求，确保检测结果的准确性和可比性。

同时，国家标准还应规定细菌的允许浓度范围，以便监管部门对食品、饮用水、环境卫生等方面进行监测和管理。

其次，国家标准应规定粪大肠菌群在不同环境中的允许浓度限值。

比如在饮用水中，粪大肠菌群的允许浓度应严格控制，以保障民众饮用水的安全。

在食品加工环节，也应规定粪大肠菌群的允许浓度限值，以确保食品的卫生安全。

此外，在环境卫生监测中，国家标准也应规定粪大肠菌群的允许浓度限值，以保障公共环境的卫生与安全。

再次，国家标准还应明确粪大肠菌群的防控措施和应急处置措施。

一旦发现粪大肠菌群超标，应该采取哪些措施来防止疫情扩散，保障公共卫生安全？国家标准应对此进行详细规定，以提供参考依据。

同时，应急处置措施也应该在国家标准中得到规范，以便相关部门在突发事件中能够迅速、有效地处置。

最后，国家标准的制定还需要考虑国际标准的趋势和发展。

粪大肠菌群国家标准应与国际标准保持一致，以便我国在国际贸易中能够顺利对接。

同时，国家标准也应不断更新和完善，以适应不断变化的国内外环境和需求。

综上所述，粪大肠菌群国家标准的制定对于保障公共卫生安全、食品安全和环境卫生具有重要意义。

国家标准的制定需要明确细菌的检测方法和标准、规定允许浓度限值、明确防控措施和应急处置措施，并与国际标准保持一致。

希望相关部门能够加强标准的制定和监管，确保粪大肠菌群在合理范围内，以保障公众的健康和安全。

粪大肠菌群的监测分析1.粪大肠菌群粪大肠菌群是总大肠菌群中的一部分，用来表明水质受污染的程度，主要来自粪便。

粪大肠菌群是一类能使乳糖发酵、产酸产气的需氧及兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌，在44.5 ℃培养24~48ｈ能发酵乳糖产酸产气。

通过对粪大肠菌群的监测，可了解水体受生活污水污染的状况。

粪大肠菌群适用于河流、湖泊等地表水、企业污水及医院废水的监测，是综合评价城镇污水，尤其是生活污水污染的一个必不可少的重要指标。

粪大肠菌群作为地表水环境质量标准唯一的一项微生物监测指标，我国多用多管发酵法进行检测，近几年也更新了好几个相关环境标准。

２样品的采集和保存2.1 采样瓶的准备和存放采集粪大肠菌群的采样瓶需要用牛皮纸封包好后，再经过高压灭菌器灭菌才能使用。

灭菌后的采样瓶里如果含有少量冷凝水，可以放在烘箱里烘干。

有条件的单位，也可以使用无菌采样瓶。

灭菌后的采样瓶也有其保存期，超过两周内未使用就必须重新灭菌。

绝大部分实验室都是在首次灭菌后不再管其使用期限。

采样瓶存放过久可能受到杂菌污染。

2.2 样品采集采样人员大多缺乏细菌学监测知识，出现很多采样不规范的现象。

如：微生物项目水样和理化水样混采；灭菌瓶开盖时间过早、水样在空气中暴露时间过长；水样采集量过满（既容易导致水样中细菌缺氧死亡，又不利于水样检测前振荡摇匀）；微生物样品和其他理化项目同时采样时，没有做到细菌样品优先采集；采样人员在采集样品时，没注意避免采样瓶受杂菌污染（手接触到瓶盖和瓶颈、采样设备不规范）。

2.3 样品运输保存在样品的运输和保存过程中，样品的冷藏是关键（温度过高过低都不利于样品的保存）。

由于仪器设备条件不够，运输过程不满足样品所需温度或者路途遥远，送检时间超过６ｈ，都会导致样品失效。

样品交接时间过长（在样品送入实验室之后，采样人员要将采样记录移交给业务室，然后由接样员对水样进行编号并将检测任务下发到监测室），导致样品没有及时分析而超过时限。

G B T肥料中粪大肠菌群的测定Document serial number【LGGKGB-LGG98YT-LGGT8CB-LGUT-GB/ 肥料中粪大肠菌群的测定1 范围本标准规定了肥料中粪大肠菌群的测定方法。

2 定义粪大肠菌群 fecal coliforms系指一群在℃±℃条件能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌。

粪大肠菌群数为每克（毫升）肥料样品中粪大肠菌群的最可能数（MPN）。

3 设备和材料（内容略）4 培养基和试剂培养基：遵照附录A的规定。

革兰氏染色液：遵照附录B的规定（略）。

5 检验步骤样品稀释在无菌操作下称取样品g或吸取样品10mL，加入到带玻璃珠的90 mL无菌水中，置于摇床上200r/min充分振荡30min，即成10-1稀释液。

用无菌移液管吸取 mL上述稀释液加入到45 mL无菌水中，混匀成10-2稀释液。

这样依次稀释，分别得到10-3，10-4等浓度稀释液（每个稀释度须更换无菌移液管）。

乳糖发酵试验选取三个连续适宜稀释液，分别吸取不同稀释液mL加入到乳糖胆盐发酵管内，每一稀释度接种3支发酵管，置℃±℃恒温水浴或隔水式培养箱内，培养24h±2h。

如果所有乳糖胆盐发酵管都不产酸不产气，则为粪大肠菌群阴性；如果有产酸产气或只产酸的发酵管，则按进行。

分离培养从产酸产气或只产酸的发酵管中分别挑取发酵液在伊红美蓝琼脂平板上划线，置36℃±1℃条件下培养18h～24h。

证实试验从分离平板上挑取可疑菌落，进行革兰氏染色。

染色反应阳性者为粪大肠菌群阴性；如果为革兰氏阴性无芽胞杆菌则挑取同样菌落接种在乳糖发酵管中，置℃±℃条件下培养24h ±2h。

观察产气情况，不产气为粪大肠菌群阴性；产气为粪大肠菌群阳性。

结果证实实验为粪大肠菌群阳性的，根据粪大肠菌群阳性发酵管数，查MPN检索表，得出每克（毫升）肥料样品中的粪大肠菌群数。

滤膜法-粪大肠菌群的测定1、适用范围本标准适用于地表水、地下水、及水中粪大肠菌群的测定。

用于检验加氯消毒的水样时，在滤膜法之前，先做试验，证实它所得的数据资料与多管发酵试验所得的数据资料具有可比性。

2、原理滤膜是一种微孔性薄膜。

将水样注入已灭菌的放有滤膜（孔径0.45微米）的滤器中，经过抽滤，细菌即被截留在膜上，然后将滤膜贴于M-FC培养基上，44.5℃温度下进行培养，计数滤膜上生长的此特性的菌落数，计算出每1L水样中含有粪大肠菌群数。

3仪器：滤膜（孔径0.45微米）、滤器、接液瓶、垫圈、无菌镊子夹3、培养基和试剂本标准所用试剂除另有注明外，均为符合国家标准的分析纯化学试剂，实验室用水为新制备的去离子水。

M-FC培养基：胰胨 10g蛋白胨 5g酵母浸膏 3.0g氯化钠 5.0g乳糖 12.5g胆盐三号 1.5g1%苯胺蓝水溶10ml1%玫瑰色酸溶液（溶于0.2mol/L氢氧化钠液中）10ml蒸馏水 1000ml制法：将上述培养基中的成分（除苯胺蓝和玫瑰色酸外），置于蒸馏水中加热溶解，调节PH为7.4，分装于小烧瓶内，每瓶100ml，于115℃灭菌20min。

储存于冰箱中备用，临用前，按上述配比，用灭菌吸管分别加入已煮沸灭菌的1%苯胺蓝溶液1ml及新配制的1%玫瑰色酸溶液（溶于氢氧化钠溶液）1ml，混合均匀。

加热溶解前，加入 1.2%～1.5%琼脂制成固体培养基。

如培养物中杂菌不多，则培养基中不加玫瑰色酸亦可。

4、步骤水样的选择：水样量的选择根据细菌受检验的特征和水样中预测的细菌密度而定。

理想的水样体积是一片滤膜上生长20～60个粪大肠群菌落，总菌落数不超过200个。

滤膜及滤膜灭菌：将滤膜放入高压蒸汽灭菌锅里在121℃灭菌10min，滤器、接液瓶、垫圈分别用纸包好，在使用前经121℃灭菌20min，滤器也可用点燃的酒精棉球火焰灭菌。

过滤：用无菌镊子夹取灭菌滤膜边缘，将粗糙面向上，贴放在已灭菌的滤床上，稳妥的固定好滤器。

粪大肠菌群检测标准
粪大肠菌群检测是评价消化道微生物菌群组成和功能的重要指标，常用于评估肠道健康和消化功能。

以下是一般粪大肠菌群检测的参考标准：
1. 总菌群量：正常情况下，粪便样本中的大肠菌群数量应该在10^7~10^9 CFU/g之间。

2. 菌群多样性指数：通常使用菌群多样性指数（如Shannon指数）评估菌群的多样性程度。

正常情况下，指数应该在较高水平。

3. 优势菌群和病原菌：粪大肠菌群检测还可以确定主要的优势菌群种类和比例，以及是否存在潜在的病原菌。

正常情况下，优势菌群应该是益生菌（如双歧杆菌、乳酸菌等），而病原菌应该是少量或不存在。

4. 菌群平衡和稳定性：正常的粪大肠菌群应该具有良好的平衡和稳定性。

如果菌群失调或不稳定，可能会导致肠道问题和消化不良等症状。

需要注意的是，粪大肠菌群检测的标准可能因不同的实验室和研究领域而有所差异。

因此，具体的标准应根据实验室或临床医生的建议进行参考。