亳芍生物碱提取及含量测定
作者周飞
指导教师陈乃东
摘要：用95%乙醇提取亳芍干粉，总提物回收乙醇后以盐酸酸化，继以二氯甲烷萃取，水相加氨水至pH ﹥8.0后以氯仿萃取，回收氯仿获粗提物。对该粗提物的TLC检测表明，亳芍中含有生物碱，且可能是乌头碱类生物碱。酸碱滴定法初步测定的生物碱含量，以乌头碱计，亳芍中总生物碱含量约为0.07%。
关键词：亳芍生物碱显色反应酸碱滴定
The primary research of the extracting and assaying of the alkaloids
from Baishao Paeoniae Radix Alba
Bachelor candidator Fei Zhou
Adviser Nai-Dong Cheng
Abstract：Total extract was extracted from Root of herbaceous peony's dry powder by using95%alcohol.We recover alcohol from the total extract,then join hydrochloric acid,then using
methylene chloride to extract.We join ammonia to pH﹥8.0in aqueous phase,then using chloroform to extract. We recover chloroform to get rough extract.TLC testing indicated that Baishao Radix Paeoniae Alba contains alkaloids,and the alkaloids may be aconitine class.Acid-base titration rough determination showed that Baishao Paeoniae Radix Alba content about0.07%total alkaloid with the aconitine represented.
Key words：Baishao Paeoniae Radix Alba Alkaloids Color reaction Acid-base titration
亳芍(Radix Paeoniae Alba)，即亳白芍，主产安徽省亳州地区，为安徽道地药材之一，是芍药科植物芍药(Paeonia lactiflora)或其变种毛果芍药(Paeonia trichocarpa)栽培品的根。芍药为多年生草本植物，夏秋季采挖其根部，去净泥土和支根，沸水浸或略煮至受热均匀，再经晒干等处理后即炮制成中药亳芍，加工后的亳芍呈粉白色或白色。亳芍具有抗炎、免疫调节、抗病毒、抗氧化、抗惊厥、护肝等作用，对胃肠道疾病和心血管疾病也有一定的疗效[1]。
已有的研究表明，亳芍主要含有单萜[2-7]、倍半萜及三萜[7,8]、单宁[9]、挥发油[10]、黄酮[8,11]、多酚类[13,14]、多糖[15,16]等活性成分，其中，芍药苷（一种单萜类化合物）是亳芍的主要活性成分[5,17-19]。为了进一步揭示亳芍的药效物质基础，为开发利用亳芍资源、繁荣当地经济提供参考依据，我们对亳芍的化学成分进行了一次深入研究。初步的定性鉴定研究结果表明，亳芍中含有生物碱。到目前为止尚未有亳芍中含有生物碱的研究报道，为此，本文对亳芍生物碱的提取、定性鉴定以及亳芍生物碱含量的初步测定等进行了研究，为后续的亳芍生物碱的分离鉴定奠定基础。
1材料仪器试剂
1.1材料
实验材料亳芍购于安徽省亳州市，品种经安徽中医学院黄和平博士鉴定。
1.2仪器
GJ14-DGF3006型电热恒温干燥箱（金坛市荣华仪器制造有限公司），HH-4型数显恒温水浴锅（金坛市国华电器有限公司），LX-02型利祥100g手提式粉粹机（上海江信科技有限公司），RE-52D型旋转蒸发器(上海浦沪仪器厂)，FA-1004型电子天平（上海精科天平厂），WD-9402E型紫外检测器（北京市六一仪器厂），TDL-5Z台式多管架自动平衡离心机（湖南星科科学仪器有限公司），冷凝管，漏斗，分液漏斗，碱式滴定管，250mL锥形瓶2个，150mL 锥形瓶5个，25mL量筒1个，50mL量筒1个，1mL移液管1个，5mL移液管1个，10mL移液管1个，250mL烧杯1个，50mL烧杯3个，100mL容量瓶1个
1.3试剂
无水乙醇(扬州沪宝化学试剂有限公司），氨水(扬州沪宝化学试剂有限公司），无水乙醚（扬州沪宝化学试剂有限公司），氯仿(西陇化工股份有限公司），二氯甲烷(西陇化工股份有限公司），乙酸乙酯(西陇化工股份有限公司），甲醇（河北四友卓越科技有限公司），冰醋酸（国药集团化学试剂有限公司），甲醛（无锡市展望化工试剂有限公司），浓硫酸(汕头市西陇化工厂有限公司），次硝酸铋，碘化钾（蚌埠化学试剂厂），浓盐酸(汕头市西陇化工厂有限公司），茚三酮，甲基红，溴甲酚绿，硫酸，氢氧化钠以上试剂药品均为国产分析纯。
2方法
2.1工艺流程图
本实验中亳芍总生物碱的提取工艺流程如下：
2.2亳芍总生物碱的提取
2.2.1干燥
亳芍先剪成薄片状，然后粉粹，干燥箱中干燥至恒重。
2.2.2提取
称取25g干燥至恒重的亳芍粉末，以95%乙醇、料液比1:4(g:mL)、85℃冷凝回流提取三次，每次提取4小时。过滤，合并滤液，减压浓缩回收乙醇至提取液无醇味，浓缩液备用。
2.2.3纯化
将在2.2.2中所获生物碱浓缩液加水适当稀释、定容，缓缓加入浓盐酸，使溶液中浓盐酸含量达5%（V/V），摇匀，待充分反应后4000转/min离心5分钟，弃去沉淀，上清液加等体积二氯甲烷萃取萃三次取除杂，水相备用。
2.2.4萃取
向2.2.3所获水相中缓慢滴加氨水至溶液显碱性p H≧8.5（精密pH试纸测定），加入等体积氯仿萃取三次，合并氯仿相，减压回收氯仿，得亳芍总生物碱，加氯仿定容至100mL，平均分成2份，备用。
2.3亳芍生物碱的鉴定
2.3.1薄层层析
取一份总生物碱适当浓缩，在五块G254硅胶薄层板上分别点样，以乙酸乙酯：氯仿：
甲醇：氨水=8:2:3:2系统为展开剂薄层层析。
2.3.2显色剂的配制
(1)碘化铋钾显色剂的配制：0.85g次硝酸铋溶于10ml冰醋酸，加水40ml，8g碘化钾溶于20ml水，混匀后使用。
(2)甲醛浓硫酸显色剂的配制：30%甲醛溶液0.2mL与10mL浓硫酸混合均匀后使用。
(3)浓硫酸显色剂的配制：直接使用浓硫酸即可。
(4)浓硝酸显色剂的配制：直接使用浓硝酸即可。
(5)茚三酮显色剂的配制：1.5g茚三酮+100mL正丁醇+3.0mL醋酸，溶解混匀即可。
2.3.3紫外检测
取出薄层板，吹干薄层板上的展开剂，分别在254nm和365nm紫外灯下照射，记录现象。
2.4亳芍生物碱的含量测定
亳芍生物碱的测定，主要参照杨云[20]的方法改进而来。取另一份亳芍总生物碱，用于测定含量。
亳芍总生物碱的含量测定的计算公式为：
－V NaOH）×M×100%÷1000W
生物碱总含量=C×(V
空白
在公式中：
C是滴定用NaOH浓度，在本实验中C=0.02mol/L；
V NaOH是滴定加入过量硫酸的生物碱所用NaOH体积；
V空白是滴定相同浓度相同体积硫酸所用NaOH体积；
M是代表生物碱的相对生物分子量，在本实验中选择乌头碱的分子量。M=654.74为代表计算亳芍总生物碱的含量。
W是样品的质量，在本实验中W=25.8545g
2.4.1指示剂的配制
取0.1%甲基红的乙醇溶液20mL，加入0.2%溴甲酚绿的乙醇溶液30mL，摇匀，备用。
2.4.2有机试剂溶解
精确吸取配制的亳芍总生物碱溶液液10mL，置水浴锅上蒸干，残渣加无水乙醇3mL，再加乙醚5mL，使之溶解.
2.4.3滴定
精密加入0.01mol/L硫酸10mL，摇匀，置水浴锅上加热，使之充分反应，放置冷却，加蒸馏水15mL和甲基红-溴甲酚绿指示剂2滴，用0.02mol/LNaOH溶液滴定至淡绿色即得，记录数据。
2.4.4空白对照
在锥形瓶中精密加入相同浓度相同体积的硫酸溶液（0.01mol/L硫酸10mL），加蒸馏水15mL和甲基红-溴甲酚绿指示剂2滴，用0.02mol/LNaOH溶液滴定至淡绿色即得，记录数据。
3.结果
3.1亳芍生物碱的显色鉴定结果
亳芍生物碱的显色鉴定结果见表1及图1~7。
表.1亳芍生物碱总提物TLC检测结果[21]
Table.1The identifications of alkaloids in Baishao Paeoniae Radix Alba by TLC
显色剂检测依据检测结果结论
碘化铋钾遇生物碱显橙红色4个橙红色斑点含有生物碱
浓硫酸遇乌头碱显紫色2个紫红色斑点可能含有乌头碱类
甲醛浓硫酸遇吗啡显橙色至紫色4个紫黑色斑点可能含有生物碱
浓硝酸遇秋水碱显蓝色，遇咖啡碱不
显色
未见显色斑不含秋水仙碱
茚三酮遇所有氨基酸及具有游离α-
氨基的肽都会产生显色反应
产生蓝紫色或（亮）黄色物质
未见显色斑不含氨基酸、短肽等
254nm紫外可观测到显色斑2个暗斑可能含有生物碱
365nm紫外可观测到显色斑2个蓝色荧斑
可能含有生物碱
图1碘化铋钾显色图2浓硫酸显色图3甲醛浓硫酸显色图4浓硝酸显色Fig.1Colored by Fig.2Colored by Fig.2Colored by Fig.4Colored by Potassium DOVAP formaldehyde/DOVAP nitric acid Heptaiodobismuthate
图5茚三酮显色图6254nm紫外下检测图7365nm紫外下检测
Fig.5Colored by Fig.6Colored by UV254nm Fig.7Colored by UV365nm
ninhydrin
3.2含量测定结果
滴定样品消耗的NaOH的体积V NaOH=9.40mL，滴定空白对照消耗NaOH的体积V空白=9.55mL。
将相关数据代入公式计算
亳芍总生物碱总含量=0.02mol/L×(9.55mL?9.40mL)×654.74g/mol÷(1000×25.8545g)×
100%×10
=7.5972×10-4
4讨论
4.1亳芍生物碱的鉴定
碘化铋钾是鉴定生物碱最常用的显色剂，如遇生物碱显橙红色。在我们的实验条件下，采用碘化铋钾显色，亳芍总生物碱检测到四个明显的橙红色显色斑（图1），说明亳芍中含有生物碱。但是一些含氮非生物碱物质如氨基酸等遇到碘化铋钾也会显色。为此，我们选择了浓硫酸、甲醛浓硫酸、浓硝酸和茚三酮等常用显色剂及紫外检测对亳芍总生物碱进一步TLC 显色鉴定以验证我们的结论。
TLC结果表明，采用浓硫酸显色，亳芍总生物碱提取物中可检测到两个明显的紫色显色斑（图2)，提示亳芍中可能含有乌头碱类生物碱；用甲醛浓硫酸显色检测到四个明显的紫黑色显色斑（图3)；浓硝酸显色，未见明显的显色斑（如4)；253nm和365nm下分别观察到相应的显色斑（图6、7)；用茚三酮显色未见明显的显色斑（图5）。
上述显色原理和显色结果表明，在亳芍氯仿提取物中，没有三帖、氨基酸、甾体、叔胺等小分子物质，可能含有乌头碱类生物碱。
4.2亳芍生物碱含量测定
酸碱滴定法是测定生物碱含量的经典方法，虽然此法的灵敏度较低，但是操作简便，成本低廉，且准确性、稳定性均较好[22]。在本实验条件下，测得生物碱的含量约为万分之七，远低于芍药苷的3.5%[6]，因此，从含量角度考虑，生物碱可能不是亳芍的主要活性成分，这也可能是长期以来未能为人们发现报道的原因之一。
生物碱是人们最早研究的天然药物成分，也是最重要的中药有效成分之一。生物碱绝大多数分布在植物界，且在豆科、毛莨科等双子叶植物中含量较为丰富[23]。生物碱具有多种药物活性，如苦参碱、喜树碱等生物碱具有较强的抗肿瘤作用[24]，四氢鸭木碱具有舒张血管平滑肌的作用[25]，附子生物碱有较强的镇痛作用[26]，贝母碱对卡他球菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、克雷佰氏肺炎杆菌有抑制作用[27]等等，生物碱是天然药物活性成分中成药性较大的一类化合物。而在以前的研究中未见有亳芍生物碱的研究报道，因此，我们的实验结果对于研究中药亳芍及其复方的药效物质基础、探讨亳芍药理活性提供了新的研究方向，也为获得天然来源的生物碱提供了新的基源植物。
5.结论
（1）亳芍中含有生物碱，采用酸碱滴定法、以乌头碱计，亳芍中生物碱的含量约为0.075%；（2）初步显色鉴定显示，亳芍中可能含有乌头碱类生物碱。但对亳芍生物碱确切的类型及分子结构，尚待后续的定向分离研究加以确定。
致谢：
在此感谢我的毕业论文指导老师陈乃东老师，陈老师的细心指教使我的实验能够顺利完成，陈老师严谨的实验态度，让我明白实验得认认真真做，不能捏造数据，必需得追求真实，让我学到了很多知识。感谢在A503一起做实验的同学们，金亮和胡小玉同学在实验细节上的指导让我少走了很多弯路，严丽和陈洋同学借的实验仪器使我实验能够顺利完成，侯小龙和杜兆松同学的实验帮忙让我实验能够提前完成，一起做实验的时光开心而短暂，我们相处的很愉快，也学到了很多知识。在做实验这段期间，辅导员夏艳老师在班级工作上的即时通知，使我不必担心班级的事，解除了我的后顾之忧，在此感谢夏艳老师。
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