石斛中总生物碱和多糖的含量测定

霍山石斛标准成分
霍山石斛含有丰富的化学成分，包括生物碱类、多糖类、酚类、甾体类及挥发油等。

其中，多糖类成分是霍山石斛的重要活性成分，具有免疫调节、保肝、抗炎、抗氧化、抗肿瘤等多种药理作用。

在《中国药典》2020年版中，多糖被列为霍山石斛的含量测定项下的质控指标，标准中采用紫外-可见分
光光度法对霍山石斛多糖（D. huoshanensepolysaccharide，DHP）含量进行测定，要求按干燥品计，不得少于%。

此外，已有研究从霍山石斛中提取出多糖，提取率较高。

例如，2007年黄森、查学强、罗建平等从霍山石斛中提取出多糖，提取率达/g（约占18%）；2012年张伟玲、王新生、戴亚峰等从霍山石斛中提取出多糖，提
取率达%。

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铁皮石斛有效成分相关研究摘要：铁皮石斛是一味名贵中药材，具有很高的药用价值，广泛用于滋补和珍贵食品。

并且有着重要的研究意义。

本文主要围绕石斛的石斛多糖，石斛碱等有效成分及其药理作用进行论述。

最终得出石斛这味中药材对一些疾病有着很好的治疗作用。

旨在为进一步深化研究铁皮石斛有效成分，为之后铁皮石斛可以更好的利用奠定基础。

关键字：有效成分；药理作用；铁皮石斛铁皮石斛(Dendrobium officinale Kimura et Mi-g0)为兰科植物铁皮石斛干燥茎，被称为九大仙草之一。

主产于四川、云南、贵州等地，尤其以广南种铁皮石斛质量最佳。

铁皮石斛被列为《中国药典》收载的5种石斛属植物之一，于2010年单列铁皮石斛。

铁皮石斛是我国传统的名贵中药材。

现代中医药理论认为，铁皮石斛具有健脾养胃、滋阴补肾、润肺生津等功效，用于治疗慢性萎缩性胃炎、高血压、糖尿病、抗肿瘤、抗衰老等。

铁皮石斛常以铁皮枫斗的形式作为药材使用。

铁皮枫斗是将铁皮石斛的茎，在烘烤干燥时手工双向扭曲成螺旋弹簧状的传统药材，目的是将铁皮石斛表皮细胞外的角质层破裂，使有效成分在煎煮时容易释出。

铁皮石斛种子极小、无胚乳、生长周期很长，在自然条件下需与某些真菌共生才能萌发生长，加上因其的凸效的药用价值与近代人类不合理开发，造成野生资源匮乏，1987年被列为国家重点保护的珍稀濒危药用植物。

1、有效成分1.1多糖类很多植物中都含有多糖，但含有活性多糖的却极其少见。

经现代科学技术测定，铁皮石斛中含有丰富的石斛活性多糖，其含量在25％及以上。

多糖是铁皮石斛中最主要的有效成分。

水溶性多糖是铁皮石斛最重要的活性物质之一。

有资料显示，将铁皮石斛进行分离纯化，可得到三种结构的多糖。

这三种结构的多糖均为O一乙酰葡萄甘露聚糖。

有资料显示，O一乙酰葡萄甘露聚糖具有增强T细胞、B细胞及巨噬细胞功能的作用。

黄民权等提取分离了铁皮石斛中的多糖，研究发现主要由D-木糖、L．阿拉伯糖组成和D．葡萄糖组成。

铁皮石斛的功效与作用铁皮石斛的功效与作用有哪些？铁皮石斛的功效与作用：滋阴清热，对经常熬夜、用脑、烟酒过度，体虚乏力的人群，经常饮用非常适宜，下面详解铁皮石斛的功效与作用。

铁皮石斛含多糖、生物碱、氨基酸等物质，并含钙、钾、钠、镁、锌、铁、锰、硒、铜、铬、镍等微量元素。

经中国医药学院药用植物所鉴定多糖含量为18.974%总生物碱为0.03%，能提高人体免疫能力，对人体眼、咽、肺、胃、肠、肾等器官疾病有特殊疗效。

以之入药，有降低血糖、抑制心血管疾病，增强机体免疫力及抗癌之效能;以之代茶，可以清咽润喉、清音明目、解暑益气、养胃清热，因其功效奇特，市场稀缺，素有“千金草”、“软一黄金”之称。

药理功效补五脏虚劳。

心阴虚一营养大脑，营养心肌，降心火;肝阴虚一改善肝血循环，养肝明目;脾胃阴虚一养胃生津，促进肠胃蠕动;肺阴虚一润肺、祛燥、平咳;肾阴虚一补阴潜阳，生精血、填骨髓。

抗肿瘤降血糖。

中国科技大学、中山医科大学的研究表明：“霍山石斛具有增强T细胞、B细胞，NK细胞和巨噬细胞的作用，对抑制肿瘤和降血糖有非常好的疗效。

抗衰老消除疲。

霍山石斛能大幅度提高体内SOD(延缓衰老的主要物质)水平，对经常熬夜、用脑、烟酒过度，体虚乏力的人群，经常饮用非常适宜。

明目恢复嗓音。

台湾阳明大学新药研究中心等科研机构，经过多年研究表明，霍山石斛的确有明目作用，以霍山石斛为主的眼科用药有较高的临床应用价值，霍山石斛医治了中国很多失音，吵哑的政府官员、教师和演艺界人士。

其他医效：具有益胃润肺、养阴生津之功效。

对亏阴虚火、五脏虚损、烦热自汗、精气不足、眼目昏暗、胃热烦渴、咳嗽咽痛、口燥舌苔、熬夜积火、烟酒过度有显著疗效。

常服能治标固本、调和阴阳、壮阳补肾、养颜驻容，从而达到保健益寿之功效。

由于铁皮石斛生长条件十分苛刻，自然产量极为稀少，更因民间长期过度采挖，致使野生资源濒临绝种。

市面上也就只有少数的大品牌，像福临门、北京同仁堂有真正在卖野生的铁皮石斛。

石斛中多糖和生物碱的含量测定
吴刚;季祥彪;康冀川;秦民坚
【期刊名称】《山地农业生物学报》
【年(卷),期】2008(27)3
【摘要】石斛Caulis dendrobii味甘，微寒，归胃、肾经，为常用中药，其药用历史悠久。

原植物为兰科石斛属Dendrobium多种植物的茎，具有益胃生津、滋阴清热、润肺止咳之功效。

现代科学研究表明，石斛主要成分为多糖和生物碱，其药理作用与二者有着密切关联阻引。

随着人们生活水平的提升，保健意识的增强，对石斛的需求不断增加，有必要寻找高产量的品种以利推广。

【总页数】5页(P274-278)
【作者】吴刚;季祥彪;康冀川;秦民坚
【作者单位】中国药科大学,中药资源学研究室,江苏,南京,210038;贵州大学,生命科学学院,贵州,贵阳,550025;贵州大学,生命科学学院,贵州,贵阳,550025;中国药科大学,中药资源学研究室,江苏,南京,210038
【正文语种】中文
【中图分类】Q949.718.430.6;R927.2
【相关文献】
1.铁皮石斛和重唇石斛杂交F1代总生物碱和多糖含量测定 [J], 王涛;应奇才;徐祥彬;王慧中
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3.铁皮石斛中石斛碱、多糖的含量测定 [J], 葛颖华;王杰;周萃;童晔玲;任泽明
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5.铁皮石斛、流苏石斛及紫皮石斛中总多糖含量测定研究 [J], 陈丹; 吴梅青; 张广宁; 李金科; 李柯
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黔产道地金钗石斛不同部位多糖含量的测定∗杨婷婷ꎬ钟㊀可һꎬ黄芯琦ꎬ刘㊀珂(贵州中医药大学ꎬ贵州㊀贵阳㊀５５００２５)摘㊀要:㊀目的:通过正交实验对金钗石斛多糖提取条件与显色条件进行优化ꎬ确定最佳测定方法ꎮ方法:水提醇沉法作为提取方法ꎻ采用苯酚－硫酸法进行多糖测定ꎮ通过正交试验对提取条件㊁显色条件进行考察优选ꎮ结果:金钗石斛多糖回流提取最优条件为:加入石油醚１０ｍＬ回流提取１ｈꎬ过滤后挥干溶媒ꎻ再加入１０ｍＬ８０％乙醇回流１ｈꎬ过滤水浴挥干ꎮ加入１５０ｍＬ蒸馏水沸腾后回流２ｈꎮ最佳显色条件为:加入苯酚１ｍＬ㊁浓硫酸４ｍＬꎬ于９０ħ水浴锅中加热１５ｍｉｎꎬ取出试管后冰浴冷却５ｍｉｎꎬ在波长４８８ｎｍ下进行检测ꎮ测得金钗石斛茎㊁花㊁叶中多糖含量平均值表现为茎>叶>花ꎮ结论:建立的方法操作简便合理㊁稳定性及精确度高ꎬ可适用于金钗石斛多糖含量的测定ꎮ金钗石斛茎㊁花㊁叶多糖含量测定结果ꎬ可为金钗石斛的开发利用提供参考依据ꎮ关键词:㊀金钗石斛ꎬ多糖ꎬ测定方法ꎬ不同部位中图分类号:Ｒ２８４㊀㊀文献标识码:Ａ㊀㊀㊀文章编号:１００３￣６５６３(２０２１)０１￣００１８￣０５ＤｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｃｏｎｔｅｎｔｉｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｐａｒｔｓｏｆＤｅｎｄｒｏｂｉｕｍｎｏｂｉｌｅｆｒｏｍＧｕｉｚｈｏｕ∗ＹＡＮＧＴｉｎｇｔｉｎｇꎬＺＨＯＮＧＫｅһꎬＨＵＡＮＧＸｉｎｑｉꎬＬＩＵＫｅ(ＧｕｉｚｈｏｕＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＴｒａｄｉｔｉｏｎａｌＣｈｉｎｅｓｅＭｅｄｉｃｉｎｅꎬＧｕｉｙａｎｇ５５００２５ꎬＣｈｉｎａ)Ａｂｓｔｒａｃｔ:㊀ＩｎｔｈｉｓｓｔｕｄｙꎬｔｈｅｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓａｎｄｃｏｌｏｒｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｏｆｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｉｎＤｅｎｄｒｏｂｉ￣ｕｍｎｏｂｉｌｅｗｅｒｅｏｐｔｉｍｉｚｅｄꎬａｎｄｔｈｅｂｅｓｔｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｗａｓｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ.Ｗａｔｅｒｅｘｔｒａｃｔｉｏｎａｎｄａｌｃｏｈｏｌｐｒｅｃｉｐｉ￣ｔａｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｗａｓｕｓｅｄꎬａｎｄｐｈｅｎｏｌ－ｓｕｌｆｕｒｉｃａｃｉｄｍｅｔｈｏｄｗａｓａｄｏｐｔｅｄｆｏｒｔｈｅｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ.Ｔｈｅｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓａｎｄｃｏｌｏｒｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｗｅｒｅｏｐｔｉｍｉｚｅｄｂｙｏｒｔｈｏｇｏｎａｌｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ.Ｔｈｅｏｐｔｉｍｕｍｃｏｎ￣ｄｉｔｉｏｎｓｆｏｒｒｅｆｌｕｘｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｏｆｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｉｎＤｅｎｄｒｏｂｉｕｍｎｏｂｉｌｅｗｅｒｅａｓｆｏｌｌｏｗｓ:ａｄｄｉｎｇ１０ｍＬｐｅｔｒｏｌｅｕｍｅｔｈｅｒｆｏｒｒｅｆｌｕｘｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｆｏｒ１ｈꎬｔｈｅｎｖｏｌａｔｉｌｉｚｉｎｇｔｈｅｓｏｌｖｅｎｔａｆｔｅｒｆｉｌｔｒａｔｉｏｎꎻａｄｄｉｎｇ１０ｍＬ８０％ｅｔｈａｎｏｌｆｏｒｒｅｆｌｕｘｅｘｔｒａｃ￣ｔｉｏｎｆｏｒ１ｈꎬｔｈｅｎｖｏｌａｔｉｌｉｚｉｎｇｉｎｗａｔｅｒｂａｔｈａｆｔｅｒｆｉｌｔｒａｔｉｏｎꎻａｄｄｉｎｇ１５０ｍＬｏｆｄｉｓｔｉｌｌｅｄｗａｔｅｒｆｏｒｒｅｆｌｕｘｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｆｏｒ２ｈａｆｔｅｒｂｏｉｌｉｎｇ.Ｔｈｅｏｐｔｉｍｕｍｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｆｏｒｃｏｌｏｒｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｗｅｒｅａｓｆｏｌｌｏｗｓ:ａｄｄｉｎｇ１ｍＬｐｈｅｎｏｌａｎｄ４ｍＬｃｏｎ￣ｃｅｎｔｒａｔｅｄｓｕｌｆｕｒｉｃａｃｉｄꎬｈｅａｔｉｎｇｉｎ９０ħｗａｔｅｒｂａｔｈｆｏｒ１５ｍｉｎꎬｔａｋｉｎｇｏｕｔｔｈｅｔｕｂｅꎬｃｏｏｌｉｎｇｉｎｉｃｅｂａｔｈｆｏｒ５ｍｉｎꎬａｎｄｔｅｓｔｉｎｇａｔ４８８ｎｍ.ＴｈｅａｖｅｒａｇｅｃｏｎｔｅｎｔｏｆｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｉｎｔｈｅｓｔｅｍꎬｆｌｏｗｅｒａｎｄｌｅａｆｏｆＤｅｎｄｒｏｂｉｕｍｎｏｂｉｌｅｗａｓｉｎｔｈｅｏｒｄｅｒｏｆｓｔｅｍ>ｌｅａｆ>ｆｌｏｗｅｒ.Ｔｈｅｍｅｔｈｏｄｉｓｓｉｍｐｌｅꎬｒｅａｓｏｎａｂｌｅꎬｓｔａｂｌｅａｎｄａｃｃｕｒａｔｅ.Ｉｔｃａｎｂｅｕｓｅｄｆｏｒｔｈｅｄｅｔｅｒｍｉ￣ｎａｔｉｏｎｏｆｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｉｎＤｅｎｄｒｏｂｉｕｍｎｏｂｉｌｅ.ＴｈｅｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｒｅｓｕｌｔｓｃａｎｐｒｏｖｉｄｅｒｅｆｅｒｅｎｃｅｆｏｒｔｈｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｎｄｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎｏｆＤｅｎｄｒｏｂｉｕｍｎｏｂｉｌｅ.Ｋｅｙｗｏｒｄｓ:㊀ＤｅｎｄｒｏｂｉｕｍｎｏｂｉｌｅＬｉｎｄｌꎬｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅꎬｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄꎬｄｉｆｆｅｒｅｎｔｐａｒｔｓ㊀㊀金钗石斛(ＤｅｎｄｒｏｂｉｕｍｎｏｂｉｌｅＬｉｎｄｌ.)为兰科多年生草本植物ꎬ是珍稀名贵中药石斛的来源之一ꎬ具有滋阴养肾ꎬ清热生津的功效[１]ꎮ主要分布于我国贵州㊁四川㊁广西㊁云南和海南等省ꎬ在贵州主产于赤水市ꎬ有 赤水金钗石斛 之称ꎬ为道地药材[２－３]ꎮ金钗石斛化学成分有生物碱类㊁多糖㊁倍半萜㊁联苄㊁芴酮㊁酚酸㊁苯丙素㊁菲类㊁木脂素类化合物ꎬ多糖是金钗石斛主要活性成分之一[３－４]ꎬ现代药理研究发现多糖具有抗肿瘤㊁抗疲劳㊁降血糖㊁抗衰老㊁抗氧化等作用[５－７]ꎬ因此建立金钗石斛多糖有效㊁简便㊁可靠的测定方法有重要的实践意义ꎮ水提醇沉回流提取法是多糖常用传统提取方法[８]ꎬ苯酚－硫酸法也常用于多糖含量的测定ꎮ本实验选取贵州赤水金钗石斛为实验对象ꎬ通过正交设计对提取溶剂加入量㊁提取温度㊁提取时间㊁显色剂用量㊁显色反应时间进行考察ꎬ优选最佳提取条件及显色条件ꎬ确定金钗石斛多糖最佳测定方法ꎮ金钗石斛的传统药用部位为茎ꎬ目前研究也集中在金钗石斛茎ꎬ对金钗石斛花和叶的研究相对较少ꎬ市场上有金钗石斛花茶作为保健品使用ꎬ金钗石斛花和叶的开发利用具有极其广阔的市场前景ꎮ通过建立的方法对金钗石斛茎㊁花㊁叶中的多糖含量进行测定ꎬ可为金钗石斛的开发利用提供参考依据ꎮ１㊀材料实验所用１２批金钗石斛药材均采自贵州省赤水市ꎬ北纬２８ʎ３０ᶄ５０ᵡꎬ东经１０５ʎ５２ᶄ４３ᵡꎬ海拔５１０ｍꎮ均为仿野生栽培品ꎬ随机取样ꎬ样品来源见表１ꎮ经贵州中医药大学钟可副教授鉴定为兰科石斛属植物金钗石斛ＤｅｎｄｒｏｂｉｕｍｎｏｂｉｌｅＬｉｎｄｌ.ꎮ采收后的茎除去杂质ꎬ用开水略烫或烘软ꎬ再边搓边烘晒至叶鞘搓净ꎬ于烘箱６０ħ烘干ꎻ金钗石斛叶经洗净处理后ꎬ于烘箱６０ħ烘干ꎻ将金钗石斛花鲜品低温烘干ꎮ以上样品均粉碎过３号筛备用ꎮＤ－无水葡萄糖(中国食品药品检定研究院ꎬ批号１１０８３３－２０１８０８ꎬ仅供国家药品标准检验用)ꎬ石油醚㊁无水乙醇㊁苯酚均为分析纯ꎬ浓硫酸ꎻ实验用水均为娃哈哈纯净水ꎮ紫外分光光度计(上海元析仪器有限公司ꎬＵＶ－５９００)ꎻ电热恒温鼓风干燥箱(上海博讯公司ꎬＧＺＸ－９０７０ＭＢＥ)ꎻ水浴锅(上海双捷实验设备有限公司ꎬＤＲＨＨ－Ｓ８)ꎻ超声机(上海乔跃电子有限公司ꎬＪＯＹＮ－１０Ａ)ꎻ十万分之一天平(日本岛津公司ꎬＡＤＷ１２０Ｄ)㊁万分之一天平(梅特勒－托利多上海有限公司ꎬＭＥ２０４Ｅ)ꎮ表１㊀样品来源表Ｔａｂ.１㊀ＳｏｕｒｃｅｓｏｆＤｅｎｄｒｏｂｉｕｍｎｏｂｉｌｅＬｉｎｄｌ.ｓａｍｐｌｅｓ编号部㊀㊀位编号部㊀㊀位１茎７花２茎８花３茎９花４茎１０花５茎１１叶６茎１２叶２㊀方法与结果２.１㊀标准曲线的绘制以蒸馏水为空白ꎬ分别各精密量取浓度为０ １０ｍｇ/ｍＬ的葡萄糖对照品溶液０ ３ｍＬ㊁０ ４ｍＬ㊁０ ５ｍＬ㊁０ ６ｍＬ㊁０ ７ｍＬꎬ置１０ｍＬ具塞试管中ꎬ加水至１ ０ｍＬꎬ精密加入临用配制的５％苯酚溶液ｌｍＬꎬ再精密加４ｍＬ硫酸ꎬ摇匀ꎬ于９０ħ水浴锅中加热１５ｍｉｎꎬ取出试管冰浴冷却５ｍｉｎꎮ以蒸馏水为空白ꎬ按照紫外－可见分光光度法(通则０４０１)ꎬ在４８８ｎｍ处测定吸光度ꎬ以吸光度为纵坐标ꎬ浓度为横坐标ꎬ绘制标准曲线ꎬ计算回归方程为Ａ＝９ ３３ｘ＋０ ０３５５ꎬｒ２＝０ ９９９ꎮ２.２㊀紫外检测波长的确定精密量取葡萄糖对照品溶液０ ５ｍＬ于１０ｍＬ具塞试管中ꎬ精密加入０ ５ｍＬ蒸馏水ꎬ再加入５％苯酚溶液１ ０ｍＬꎬ迅速加入浓硫酸４ ０ｍＬ摇匀ꎬ置９０ħ水浴中加热１５ｍｉｎ后取出并冰浴５ｍｉｎ后ꎬ并以蒸馏水为空白对照ꎬ按照紫外－可见分光光度法(通则０４０１)ꎬ在２００~８００ｎｍ波长范围内进行扫描ꎬ测得葡萄糖对照品最大吸收峰在４８８ｎｍ波长处ꎮ扫描结果见图１ꎮ图１㊀紫外波长扫描结果Ｆｉｇ.１㊀ＵＶｓｃａｎｎｉｎｇｒｅｓｕｌｔ２.３㊀正交设计优选多糖显色条件与提取工艺２.３.１㊀显色条件通过Ｌ９(３４)正交实验ꎬ对苯酚与浓硫酸的加入量和反应时间进行考察ꎬ以吸光度为指标确定最佳加入量与反应时间ꎮ分别精密量取葡萄糖对照品溶液０.５ｍＬ置于１０ｍＬ具塞试管中ꎬ共９份ꎬ精密加入０.５ｍＬ蒸馏水ꎬ再加入临用配置５％苯酚溶液ꎬ摇匀ꎬ迅速加入浓硫酸ꎬ摇匀ꎬ置９０ħ水浴中加热不同时间后ꎬ取出冰浴５ｍｉｎꎬ于４８８ｎｍ波长处测定吸光度ꎮ因素水平见表２ꎬ正交实验结果见表３ꎬ方差分析结果见表４ꎮ表２㊀显色条件试验因素Ｔａｂ.２㊀Ｔｅｓｔｆａｃｔｏｒｓｏｆｃｏｌｏｒｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ水平因素Ａ苯酚/ｍＬＢ浓硫酸/ｍＬＣ反应时间/ｍｉｎ１０.５４.０１５２１.０５.０２０３１.５６.０２５表３㊀显色条件正交试验结果Ｔａｂ.３㊀Ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｒｅｓｕｌｔｓｏｆｃｏｌｏｒｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ因素试验号ＡＢＣ吸光度１１１１０.６９２２１２２０.４６７３１３３０.４７６４２１１０.７１６５２２２０.６２８６２３３０.６７４７３１１０.５１３８３２２０.６２３９３３３０.５５８Ｋ１１.６３５１.９２１１.９８９Ｋ２２.０１８１.７１８１.７４１Ｋ３１.６９４１.７０８１.６１７Ｒ０.３８３０.２１３０.３７２表４㊀方差分析结果Ｔａｂ.４㊀Ａｎａｌｙｓｉｓｏｆｖａｒｉａｎｃｅｒｅｓｕｌｔｓ变异来源平方和自由度均方ＦＰＡ０.０２８２０.０１４３.１８７０.２３９Ｂ０.０１０２０.００５１.０８３０.４８０Ｃ０.０２４２０.０１２２.６８９０.２７１㊀㊀直观分析可知ꎬ各因素对吸光度的影响顺序为Ａ>Ｃ>Ｂꎬ方差分析结果发现Ａ㊁Ｂ㊁Ｃ均无显著性影响(Ｐ>０.０５)ꎮ综合直观分析及方差分析ꎬ选取反应条件为Ａ２Ｂ１Ｃ１时ꎬ即苯酚用量为１.０ｍＬꎬ浓硫酸用量为４ｍＬꎬ反应时间为１５ｍｉｎ时ꎬ吸光度最高ꎮ２.３.２㊀提取方法根据多糖性能选用水提醇沉法进行金钗石斛多糖的提取条件考察ꎬ选择提取溶剂加入量㊁提取温度㊁提取时间３个试验因素ꎬ选用Ｌ９(３４)正交表对金钗石斛进行石斛多糖的提取与测定ꎬ多糖百分含量作为考察指标ꎮ分别称取金钗石斛茎粉末０ １５ｇ于２５０ｍＬ圆底烧瓶中ꎬ共９份ꎮ各加１０ｍＬ石油醚回流脱脂１ｈꎬ过滤挥干溶媒ꎮ药渣用１０ｍＬ８０％乙醇回流除杂１ｈꎬ过滤水浴挥干ꎮ药渣用不同量的蒸馏水按照不同温度分别提取不同时间ꎬ趁热过滤ꎬ定容至２５０ｍＬ容量瓶中ꎬ摇匀ꎬ因素水平表见表５ꎮ将分别所得金钗石斛供试品溶液ꎬ精密吸取０ ５ｍＬ于具塞试管中ꎬ精密加入０ ５ｍＬ蒸馏水ꎬ按 ２ ３ １ 所得的最优条件反应ꎬ测得吸光度ꎬ分别代入 ２ １ 项所得的回归方程ꎬ计算多糖浓度ꎮ实验结果见表６ꎮ并以多糖百分含量作为衡量提取效率的客观指标ꎬ优选最佳提取工艺ꎮ方差分析结果见表７ꎮ表５㊀提取条件试验因素表Ｔａｂ.５㊀Ｔｅｓｔｆａｃｔｏｒｓｏｆｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ水平因素Ａ加水量/ｍＬＢ提取时间/ｈＣ提取温度/ħ１１００１.０８０２１５０２.０９０３２００３.０１００表６㊀提取条件正交试验结果Ｔａｂ.６㊀Ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｒｅｓｕｌｔｓｏｆｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ序号称样量/ｇＡＢＣ吸光度多糖浓度/(ｍｇ/ｍＬ)百分含量/％１０.１５０５１１１０.５５１０.０５５３１８.３６２０.１５０４１２２０.５４３０.０５４４１８.０８３０.１５０８１３３０.５７１０.０５７４１９.０３４０.１５０３２１２０.４１９０.０４１１１３.６７５０.１５０１２２３０.６１６０.０６２２２０.７３６０.１５０２２３１０.４４６０.０４４０１４.６５７０.１５０２３１３０.５４９０.０５５０１８.３２８０.１５０７３２１０.５１７０.０５１６１７.１２９０.１５０１３３２０.６０８０.０６１４２０.４４续表６序号称样量/ｇＡＢＣ吸光度多糖浓度/(ｍｇ/ｍＬ)百分含量/％Ｋ１７４.１３６６７.６６４７１.８５２Ｋ２６１.６００７４.６９４６９.９７６Ｋ３７９.００７７２.３８５７２.９１５Ｒ１７.４０７７.０３２.９３９表７㊀方差分析结果Ｔａｂ.７㊀Ａｎａｌｙｓｉｓｏｆｖａｒｉａｎｃｅｒｅｓｕｌｔｓ变异来源平方和自由度均方ＦＰＡ５５.７６５２２６.８８２８.６０７０.１０４Ｂ８.５６０２４.２８０１.３７００.４２２Ｃ１.４７６２０.７３８０.２３６０.８０９由直观分析可知ꎬ各因素对多糖含量的影响顺序为Ａ>Ｂ>Ｃꎬ方差分析结果表明ꎬＡ㊁Ｂ㊁Ｃ对提取的多糖浓度无显著性影响(Ｐ>０.０５)ꎮ结合直观分析结果ꎬ最佳反应条件为Ａ２Ｂ２Ｃ３时ꎬ即提取温度为１００ħꎬ加水量为１５０ｍＬꎬ提取时间为２ｈ的条件下ꎬ提取的多糖百分含量最高ꎮ２.４㊀供试品溶液制备及反应条件的确定称取样品粉末０.１５ｇꎬ置于２５０ｍＬ圆底瓶中ꎬ加１０ｍＬ石油醚回流提取１ｈꎬ过滤后挥干溶媒ꎻ再加入１０ｍＬ８０％乙醇回流１ｈꎬ过滤水浴挥干ꎬ用１５０ｍＬ的蒸馏水在１００ħ下回流提取２ｈꎬ过滤ꎬ残渣用蒸馏水洗涤ꎬ定容至２５０ｍＬ容量瓶中ꎬ摇匀即得供试品溶液ꎮ最佳显色反应条件为:取供试品溶液０.５ｍＬꎬ置１０ｍＬ具塞试管中ꎬ再加０.５ｍＬ水补至１ｍＬꎮ取临用配置５％苯酚溶液ｌｍＬꎬ再精密加浓硫酸４ｍＬꎬ摇匀ꎬ于９０ħ水浴锅中加热１５ｍｉｎꎬ取出试管冰浴冷却５ｍｉｎꎬ在４８８ｎｍ处测定吸光度ꎮ２.５㊀方法学考察２.５.１㊀精密度试验分别准确量取浓度为０ １０ｍｇ/ｍＬ的葡萄糖对照品溶液共６份ꎬ按 ２.４ 项下操作ꎬ测定对照品溶液吸光度ꎬＲＳＤ为１.６％ꎬ表明仪器精密度良好ꎮ２.５.２㊀重复性试验精密称取同一批金钗石斛样品６份ꎬ每份约０ １５ｇꎬ按 ２.４ 项下操作ꎬ测定每份样品吸光度ꎬ计算多糖的含量为２０ １４％ꎬＲＳＤ为１ ８３％ꎬ表明方法重复性良好ꎮ２.５.３㊀稳定性试验精密称取金钗石斛样品粉末０ １５ｇꎬ按 ２.４ 项下操作ꎬ分别在０ｈ㊁２ｈ㊁４ｈ㊁８ｈ㊁１６ｈ㊁２４ｈ测定其吸光度ꎬ其ＲＳＤ为１ ５６％ꎬ表明供试品溶液在２４ｈ内稳定ꎮ２.５.４㊀加样回收率试验精密称取已知多糖百分比含量为２０ １４％的金钗石斛茎粉末６份ꎬ每份约０.０７５ｇꎬ分别精密加入与样品中多糖含量相等的Ｄ－无水葡萄糖对照品ꎬ按 ２.４ 项下操作ꎬ测定样品吸光度结果见表８ꎬ其ＲＳＤ为１ ３２％ꎬ平均回收率为１００ ６８％ꎬ均符合要求ꎮ表８㊀加样回收率试验结果Ｔａｂ.８㊀Ｒｅｓｕｌｔｓｏｆｓｐｉｋｅｄｒｅｃｏｖｅｒｙｔｅｓｔｓ序号称样量/ｇ样品中多糖质量/ｍｇ加入葡萄糖对照品质量/ｍｇ测得多糖质量值/ｍｇ回收率/％平均回收率/％ＲＳＤ１０.０７５０１５.１１１５.２９３０.４１１００.０７２０.０７５１１５.１３１５.１８３０.５７１０１.７１３０.０７５１１５.１３１５.４２３０.３６９８.７７４０.０７５３１５.１７１５.３８３０.８４１０１.８９５０.０７５４１５.１９１５.５８３０.７３９９.７４６０.０７５５１５.２１１５.９２３１.４３１０１.８８１００.６８１.３２％２.６㊀样品中多糖含量测定结果按 ２.４ 项下操作ꎬ以蒸馏水为空白ꎬ对１２批样品进行多糖含量的测定ꎬ多糖的百分含量结果见表９ꎮ表９㊀样品多糖含量测定结果(ｎ＝２)Ｔａｂ.９㊀ＤｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｒｅｓｕｌｔｓｏｆｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｃｏｎｔｅｎｔｉｎＤｅｎｄｒｏｂｉｕｍｎｏｂｉｌｅ(ｎ＝２)编号多糖含量/％平均值/％编号多糖含量/％平均值/％１２３.０９２２２.９２３２２.４５４１８.３４５２１.３２６２３.１４２１.８８７１２.６３８１５.０６９１９.５２１０１４.１９１１１５.２６１２１８.３７１５.３５１６.８２由测定结果可知ꎬ１２批样品中ꎬ金钗石斛茎中多糖含量最高ꎬ为２１.８８％ꎬ茎㊁花㊁叶中多糖含量表现为:茎>叶>花ꎮ３㊀讨论实验通过正交设计对金钗石斛多糖提取条件以及显色条件进行考察优选ꎮ以多糖百分含量为指标ꎬ确定最优提取条件为:加入蒸馏水１５０ｍＬ沸腾后回流提取２ｈꎻ以吸光度为指标ꎬ最佳显色条件为:加入苯酚１ｍＬ㊁浓硫酸４ｍＬꎬ于９０ħ水浴锅中加热１５ｍｉｎꎬ取出试管后冰浴冷却５ｍｉｎꎮ建立的方法操作简便ꎬ易控制ꎬ稳定性及精确度高ꎬ多糖的得率较高ꎮ金钗石斛多糖提取方法多种ꎬ如曾雨馨等[８]对金钗石斛多糖超声提取方法进行了优化ꎬ荆晶等[９]对微波辅助提取法进行了优化ꎬ还有酶解辅助提取法等[１０]ꎬ但多糖经过超声或微波处理后其糖苷键可能会发生断裂ꎬ酶解辅助提取法中酶反应条件要求严格ꎬ成本较高[７]ꎮ水提醇沉回流提取法一直是金钗石斛多糖常用的传统提取方法ꎬ苯酚－硫酸法也常用于多糖含量的测定ꎬ水提法[１１－１３]目前亦有提取工艺的优化ꎬ但对苯酚－硫酸法显色条件的考察较少ꎮ本实验在对水提法的提取工艺优化的同时ꎬ对显色条件也进行了优选ꎬ建立的方法可适用于金钗石斛多糖含量的测定ꎮ通过实验建立的方法ꎬ对金钗石斛不同部位多糖的含量进行了测定ꎬ金钗石斛的传统药用部位为茎ꎬ实验结果也表明了茎中多糖含量高于叶与花ꎬ但金钗石斛叶与花中亦有较高的多糖含量ꎬ可为金钗石斛的开发利用提供参考依据ꎮ参考文献ʌＲＥＦＥＲＥＮＣＥＳɔ[１]㊀国家药典委员会.中华人民共和国药典:一部[Ｓ].北京:中国医药科技出版社ꎬ２０１５:９２－９３.[２]㊀施宝盛ꎬ陶永生ꎬ黎唯ꎬ等.金钗石斛化学成分和药理作用研究进展[Ｊ].昆明医科大学学报ꎬ２０１７ꎬ３８(１０):１２４－１２９.[３]㊀许莉ꎬ王江瑞ꎬ郭力ꎬ等.金钗石斛化学成分的研究[Ｊ].中成药ꎬ２０１８ꎬ４０(５):１１１０－１１１２.[４]㊀周威ꎬ夏杰ꎬ孙文博ꎬ等.金钗石斛的化学成分和药理作用研究现状[Ｊ].中国新药杂志ꎬ２０１７ꎬ２６(２２):２６９３－２７００.[５]㊀邓维泽ꎬ古霞ꎬ闫天龙ꎬ等.微波辅助提取金钗石斛多糖及体外抗氧化研究[Ｊ].食品研究与开发ꎬ２０１６ꎬ３７(９):５５－５９.[６]㊀谢苗苗ꎬ肖柳ꎬ杨磊ꎬ等.金钗石斛多糖的分离纯化及其抗衰老活性研究[Ｊ].中国现代中药ꎬ２０１８ꎬ２０(１２):１４８９－１４９３.[７]㊀单冰冰ꎬ陈宽ꎬ李婷ꎬ等.正交设计优化双斛胶囊的总多糖水提取工艺[Ｊ].中国药房ꎬ２０１９ꎬ３０(１８):２５０８－２５１２. 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