实训二十一华山参片总生物碱的含量测定
一、实训目的
1.掌握紫外-可见分光光度法（对照品比较法）含量测定的一般操作步骤和技能。
2.理解紫外-可见分光光度法（对照品比较法）含量测定原理
二、测定依据
1.华山参片药品标准 [《中国药典》2005年版（一部）正文部分 440页]
本品为华山参浸膏片
【含量测定】对照品溶液的制备精密称取在120℃干燥至恒重的硫酸阿托品，加水制成每1ml相当于含莨菪碱7μg的溶液，即得。
供试品溶液的制备取本品40片，除去糖衣，精密称定，研细，精密称取适量（约相当于12片的重量），置具塞锥形瓶内，精密加入枸橼酸-磷酸氢二钠缓冲液（pH4.0）25ml，振摇5分钟，放置过夜，用干燥滤纸滤过，取续滤液，即得。
测定法精密量取供试品溶液与对照品溶液各2ml，分别置分液漏斗中，各精密加枸橼酸-磷酸氢二钠缓冲液（pH4.0）10ml，再精密加入用上述缓冲液配制的0.04%溴甲酚绿溶液2ml，摇匀，用10ml三氯甲烷振摇提取5分钟，待溶液完全分层后，分取三氯甲烷液，用三氯甲烷湿润的滤纸滤入25ml量瓶中，再用三氯甲烷提取3次，每次5ml，依次滤入量瓶中，并用三氯甲烷洗涤滤纸，滤入量瓶中，加三氯甲烷至刻度。照紫外-分光光度法（附录ⅤA）分别在415nm的波长处测定吸光度，计算，即得。
本品含生物碱以莨菪碱（C17H23NO3）计，应为标示量的80.0%～120.0％。
【规格】0.12mg
2.紫外-可见分光光度法[《中国药典》2005年版（一部）附录Ⅴ A]
三、测定原理
1.本品有效成分为莨菪类生物碱，主要有莨菪碱、东莨菪碱、山莨菪碱和东莨菪内酯等（图5-36）。药品标准以莨菪碱为指标，测定总生物碱的含量，以此控制药品质量的优劣。
N OCOCH
CH 2OH
R 1
R CH 3
图5-36 主要莨菪类生物碱的结构式
莨菪碱（R 1,R 2=H ） 东莨菪碱（C 6-O-C 7 R 1,R 2=H ） 山莨菪碱（R 1=OH,R 2=H ） 2.莨菪类生物碱为无色结晶，具有中强碱性，溶于酸水、甲醇、乙醇、三氯甲烷等，故本实验采用枸橼酸-磷酸氢二钠缓冲液（pH4.0）提取总生物碱。此类生物碱在pH4.0的缓冲液中可与酸性染料溴甲酚绿定量生成有色络合物，该络合物可转溶于三氯甲烷生成供试品溶液，并在415nm 波长处有最大吸收，因此可用分光光度法测定。这种方法又称为酸性染料比色法，常用于生物碱的含量测定。
3.对照品硫酸阿托品实际为外消旋莨菪碱的硫酸盐。天然产物左旋莨菪碱不稳定，一般将其消旋化生成性质稳定的硫酸阿托品作为对照品或供药用。
4.测定原理：基于在一定条件下，待测成分的浓度和吸光度呈正比例关系，，将对照品硫酸阿托品和供试品中总生物碱分别与溴甲酚绿定量显色，按紫外-可见分光光度法（对照品比较法）测定，计算华山参片总生物碱的含量。
四、仪器与试剂
紫外分光光度计、石英吸收池、分液漏斗、量瓶（25ml ）、吸量管（2ml 、10ml ）、干燥箱、分析天平（感量0.0001g 、0.00001个）、具塞锥形瓶、滤纸、
华山参片、三氯甲烷、硫酸阿托品对照品、枸橼酸-磷酸氢二钠缓冲液（pH4.0）等。
五、实训内容与步骤：
1.对照品溶液制备 在2000ml 量瓶中用分析天平（感量0.00001g ）精密称取在120℃干燥至恒重的硫酸阿托品16.4mg ，称量范围0.01635～0.01645g ，加水溶解并稀释到刻度，制成每1ml 相当于含莨菪碱7.00～7.04μg 的溶液，即得。
2.供试品溶液制备 取本品40片，除去糖衣，用分析天平（感量0.0001g ）精密称定并计算平均片重（保留四位有效数字），研钵研细，用分析天平（感量0.0001g ）精密称取适量（约相当于12片的重量，该重量=平均片重×12，称量范围=该重量±该重量×10%，保留四位有效数字），置50ml 具塞锥形瓶内，用吸量管精密加入枸橼酸-磷酸氢二钠缓冲液（pH4.0）25ml ，密塞振摇5分钟，放置过
6
7
夜，用干燥滤纸滤过，取续滤液，即得。
3.测定法 用吸量管精密量取供试品溶液与对照品溶液各2ml ，分别置50ml 分液漏斗中，用吸量管各精密加枸橼酸-磷酸氢二钠缓冲液（pH
4.0）10ml ，再用吸量管精密加入用上述缓冲液配制的0.04%溴甲酚绿溶液2ml ，摇匀，用量筒量取10ml 三氯甲烷，加入，振摇提取5分钟，待溶液完全分层后，分取三氯甲烷液，用三氯甲烷湿润的滤纸滤入25ml 量瓶中，再用三氯甲烷提取3次，每次5ml ，依次滤入量瓶中，并用三氯甲烷洗涤滤纸，滤入量瓶中，加三氯甲烷至刻度。照紫外-分光光度法（《中国药典》附录ⅤA ）分别在415nm 的波长处测定吸光度，记录测量数据。
4.含量计算
（1）计算供试品溶液中总生物碱的浓度C 供（μg/ml ）
C 供（μg/ml ） =（A 供/A 对）× C 对（μg/ml ） （2）计算药品中总生物碱的含量（标示含量 ％）
【操作要点】
①硫酸阿托品对照品(C 17H 23NO 3)2·H 2SO 4分子量为676.82，其中2分子阿托品（莨菪碱）(C 17H 23NO 3)2分子量为578.74，二者的比值为 1.169。因此配制每1ml 相当于含莨菪碱7μg 的对照品溶液时，硫酸阿托品的称取量X （mg ）应按下式计算：X=1.169×14.0mg 。
②两相溶液萃取时，在无严重乳化的前提下，要充分振摇和放置，待溶液完全分层后才可分液，以提高萃取效率。
③其他可参照本章紫外-可见分光光度法中的“注意事项”。 六、结果判断
将测定结果与药品标准比较，若在规定的范围之内则判定本品符合规定。 七、实训思考
1.供试品为什么采用pH4.0枸橼酸-磷酸氢二钠缓冲液提取？
2.供试品和对照品与溴甲酚绿反应为什么需在pH4.0的条件下进行？
3.水/三氯甲烷两相溶剂萃取时，分液漏斗下口旋转活塞能用凡士林做润
C 供（mg/ml ）×10-3
×V 供（ml ）×平均片重（mg/片） ×100%
滑剂吗？
八、实训测试
华山参片总生物碱的含量测定实训测试表（百分计）
测试指标测试内容及观测点
分
值
评价等级
A B C D E
1.0 0.7 0.5 0.3 0
着装 2
检验依据写出检验依据的出处：
3
相关知识1.本法检测哪类生物碱？
2.根据药品标准什么规定判断本法为对照品比较法？
3.写出本法的含量测定原理。
9
操作步骤及实验先在以下括号内填写操作步骤的序号和名称，然后进行
实验。
（）
60 （）
（）
（）
（）
（）
（）
（）
结果
描述 2 清场 1
填写检验报告
10
回答问题1.本法应选用什么光源？
2.测定吸光度时，吸收池是否要加盖？为什么？。
3.除了本药品外还有哪种中成药还采用了酸性染料比
色法测定含量？
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讨论酌情给分