猪轮状病毒检测卡说明书(完整版)

猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻与猪轮状病毒三联活疫苗使用说明书[兽用名称]猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻与猪轮状病毒三联活疫苗商品名：无英文名：Swine Transmissble Gastroenteritis,Porcine Epidemic Diarrhea and Porcine Rotavirus Vaccine，live汉语拼音：Zhu Chuanranxing Weichangyan、Zhu Liuxingxing Fuxie yu Zhu Lunzhuangbingdu Sanlian Huoyimiao【主要成分与含量】疫苗含猪传染性胃肠炎病毒弱毒化毒株和猪流行性腹泻病毒弱毒CV777株病毒和猪轮状病毒NX株，每头份疫苗病毒含量≥105.0TCID50。

【性状】为黄白色或微粉色海绵状疏松团块，易与瓶壁脱离，加稀释液后迅速溶解，无异物。

【作用与用途】用于预防猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻与猪轮状病毒感染。

主动免疫接种后7日产生免疫力，免疫期为6个月。

仔猪被动免疫的免疫期至断奶后7日。

【用法与用量】每瓶疫苗稀释至5ml或10ml（根据头份数），妊娠母猪与产仔前40日后海穴位（即尾根与肛门中间凹陷的小窝部位）接种，20日后二免，每次1头份（1ml）；其所生仔猪与断奶后7-10日内接种疫苗1头份。

未免疫母猪所产3日龄以内仔猪接种1头份；进针深度：3日龄仔猪为1.5cm，随猪龄增大而加深，成猪为4cm。

【不良反应】无。

【注意事项】1. 产品仅用于控制这三种病毒引起的腹泻，对于细菌、寄生虫和其他因素引起的腹泻无效。

2. 疫苗运输过程中应防止高温和阳光照射。

3. 妊娠母猪接种疫苗时要适当保定，以免引起机械性流产。

4. 疫苗稀释后，限1小时内用完。

5. 进行抗体检测，在抗体水平较低（TGE、PED中和抗体效价≤1:8，PRV中和抗体效价≤1:16）的情况下使用。

6. 后海穴位接种时，针头保持与脊柱平行或者稍偏上，以免将疫苗注入直肠内。

猪圆环病毒抗体金标快速检测卡使用说明书【产品用途】本检测卡采用免疫原理和胶体金免疫层析技术制成快速检测猪血液或血清中的圆环病毒抗体。

检测时间仅需3-15分钟，操作简便、快速、结果准确、直观、灵敏度高、容易判定。

当猪圆环病毒抗体滴度达到能抵御圆环病毒强毒攻击时，在检测区和对照区各形成一条色线，则视为阳性，抗体滴度越高，检测线颜色越深；当猪圆环病毒抗体滴度达不到抵御圆环病毒强毒攻击的抗体滴度时，只在对照区形成一条色线，则视为阴性。

【操作步骤】1．打开包装袋，取出检测卡平放在桌面上，并做好标记；2．在检测卡的加样孔内加入2-3滴待检血液或血清样品；3．在3-15分钟内观察和记录结果，超过15分钟的结果只能作为参考。

【结果判定】见右图阳性：在检测区（T）和对照区（C）各出现一条紫红色线。

检测线颜色越深，表明圆环病毒抗体滴度越高。

弱阳性：在检测区（T）和对照区（C）各出现一条紫红色线，但检测线颜色很浅。

阴性：只在对照区（C）出现一条紫红色线。

无效：都不出现紫红色线或只在检测区（T）出现紫红色线，对照区（C）不出现紫红色线。

【注意事项】1．请严格按照说明书要求进行操作和结果判定。

2．检测样品可以是猪血液或血清。

3．检测卡从铝箔袋取出后应尽快使用，尽量避免长时间放置在空气中，否则吸潮后将失效。

4．检测环境应保持一定的湿度，避风和避免在过高温度下进行操作。

5．检测卡在室温下保存，如在2-8℃冷藏，使用时需平衡至室温后方可打开包装进行检测操作。

【包装规格】单头份铝箔袋包装（内含检测卡、吸管和干燥剂）；20头份/盒。

【贮藏和有效期】3-30℃，避光干燥处贮存，有效期12-18个月。

轮状病毒是一种常见的肠胃病毒，可引起腹泻、呕吐、腹痛等症状。

轮状病毒检测试剂是一种用于检测轮状病毒的试剂盒，以下是其说明书的概述。

产品名称
轮状病毒检测试剂盒
产品原理
本试剂盒利用免疫层析法检测人体样品中的轮状病毒抗原，并通过结果的颜色变化判定是否存在轮状病毒。

其中，试剂盒的主要成分包括试剂盒条、样本处理盒、稀释盒等。

检测流程
将待测样品收集到样本处理盒中；
添加几滴稀释液进行稀释，充分混合后，将混合物放置于试剂盒条的样本孔上；
等待10-15分钟，待结果出现后，使用结果对照表判断检测结果。

注意事项
试剂盒仅供专业技术人员使用，避免直接与样本接触。

样本处理过程中需佩戴手套、护目镜等个人防护用具。

试剂盒开封后需在有效期内使用，过期试剂盒使用可能导致结果不准确。

试剂盒储存温度应在2-8℃之间，避免阳光直射和冷冻。

结果解释
根据试剂盒提供的结果对照表，判断检测结果的阳性、阴性或无效。

总结
轮状病毒检测试剂盒是一种快速检测轮状病毒的诊断试剂盒，操作简单，结果明确。

但其检测结果仅供参考，需与其他临床资料一起综合分析，最终由专业人士进行诊断和治疗。

猪瘟抗体快速检测试剂盒——（胶体金法）使用说明书【名称】通用名称：猪瘟抗体快速检测试剂盒（胶体金法）英文名称：Rapid Anti-CSFV Test汉语拼音：Zhuwen Kangti Kuaisu Jiance ShijiHe(Jiaoti Jin Fa)【用途】用于检测猪血清/血浆/全血样品中猪瘟(Classical Swine Fever, CSF)抗体。

【实验原理】猪瘟抗体快速检测试剂盒（胶体金法），系采用胶体金免疫层析技术，检测样品（血清、血浆或全血）中猪瘟抗体的方法。

在玻璃纤维纸上预包被金标记灭活猪瘟抗原（Au-Agl），在硝酸纤维素膜上检测线和对照线处分别包被猪瘟抗原(Ag2)和兔抗猪瘟抗体。

当检测样品为阳性时，样品中猪瘟抗体与胶体金标记猪瘟抗原（Au-Ag1）结合形成复合物，由于层析作用复合物沿纸条向前移动，经过检测线时与预包被的猪瘟抗原(Ag2)形成“Au-Ag1-猪瘟抗体-Ag2-固相材料”免疫复合物而凝聚显色，游离金标记抗原则在对照线处与兔抗猪瘟抗体结合而富集显色。

阴性样品则仅在对照线处显色。

操作简便，快速，结果直观、准确，灵敏度高，容易判定。

【试剂盒组成】1.猪瘟抗体检测卡50头份2.说明书1份3.一次滴管50根【操作方法】1.用1.5ml样品管，采血0.5-1ml待检测血清自然析出或用离心机离心10分钟左右，使血清析出。

2.将检测卡平置于桌面上，用吸管吸取被检血清，在检测卡的椭圆形加样孔内加入2滴约80~100ul。

在室温下反应20分钟判定结果。

（检测卡如在4℃保存，必须恢复至室温后方可进行检测）【结果判定】阳性：对照线区（C）和检测线区(T)各出现一条紫红色线。

检测线(T)的颜色越深，表明猪瘟抗体的滴度越高。

阴性：只有对照线区（C）出现一条紫红色线。

无效：未出现紫红色线或只在检测区(T)出现紫红色线，对照线区(C)未出现紫红色线。

【诊断参考】被检样品加样后20分钟可与对照卡的色带滴度进行参考比较。

猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻与猪轮状病毒三联活疫苗使用说明书[兽用名称]猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻与猪轮状病毒三联活疫苗商品名：无英文名：Swine Transmissble Gastroenteritis,Porcine Epidemic Diarrhea and Porcine Rotavirus Vaccine，live汉语拼音：Zhu Chuanranxing Weichangyan、Zhu Liuxingxing Fuxie yu Zhu Lunzhuangbingdu Sanlian Huoyimiao【主要成分与含量】疫苗含猪传染性胃肠炎病毒弱毒化毒株和猪流行性腹泻病毒弱毒CV777株病毒和猪轮状病毒NX株，每头份疫苗病毒含量≥105.0TCID50。

【性状】为黄白色或微粉色海绵状疏松团块，易与瓶壁脱离，加稀释液后迅速溶解，无异物。

【作用与用途】用于预防猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻与猪轮状病毒感染。

主动免疫接种后7日产生免疫力，免疫期为6个月。

仔猪被动免疫的免疫期至断奶后7日。

【用法与用量】每瓶疫苗稀释至5ml或10ml（根据头份数），妊娠母猪与产仔前40日后海穴位（即尾根与肛门中间凹陷的小窝部位）接种，20日后二免，每次1头份（1ml）；其所生仔猪与断奶后7-10日内接种疫苗1头份。

未免疫母猪所产3日龄以内仔猪接种1头份；进针深度：3日龄仔猪为1.5cm，随猪龄增大而加深，成猪为4cm。

【不良反应】无。

【注意事项】1. 产品仅用于控制这三种病毒引起的腹泻，对于细菌、寄生虫和其他因素引起的腹泻无效。

2. 疫苗运输过程中应防止高温和阳光照射。

3. 妊娠母猪接种疫苗时要适当保定，以免引起机械性流产。

4. 疫苗稀释后，限1小时内用完。

5. 进行抗体检测，在抗体水平较低（TGE、PED中和抗体效价≤1:8，PRV中和抗体效价≤1:16）的情况下使用。

6. 后海穴位接种时，针头保持与脊柱平行或者稍偏上，以免将疫苗注入直肠内。

猪流感病毒检测试纸条使用说明书【原理】猪流感是由正粘病毒科A型流感病毒属的特定病毒引起的。

A型猪流感病毒可根据其血凝素和神经氨酸酶蛋白再进一步细分为H1N1,H1N2和H3N2等。

猪流感病毒（SIV）抗原快速检测卡采用了快速免疫层析检测技术，用于检测猪鼻腔拭子中的猪流感病毒抗原。

本检测卡对A型猪流感病毒的所有亚型都有极高的敏感性。

把待检样本加入到加样孔后，与胶体金标记的抗SIV单克隆抗体一起沿层析膜移动。

若样品中存在SIV抗原时，与检测线上的抗体结合而显示酒红色。

如果样品中不存在SIV抗原时，则不产生颜色反应。

【试剂组成】1. 猪流感病毒快速检测卡50片/盒2. 样本稀释液50管/盒3．棉签50支/盒4．一次性手套5支【操作方法】操作流程1）应采集急性、体温高的及未经处理的病猪鼻拭子。

棉签应插入鼻腔，并在内壁上反复旋转擦拭。

2）立即将棉签插入装有样品缓冲液的试管，将棉签在试管壁上反复用力旋转至少10次，并混匀溶液，使标本尽可能溶解在溶液中。

在液面上方的试管壁上挤压棉签，使液体尽可能被挤出，丢弃棉签。

3）从密封袋中取出检测卡。

将检测卡放置在平整表面，用吸管从试管内吸取上层清亮液体，缓慢、逐滴的准确滴加4滴到有“S”标记的加样孔内。

4）在室温下放置10-15分钟判断结果，超过15分钟结果无效。

【结果判定】1. 阳性：在观察孔内，若对照线C显色，检测线T同时显色，判为阳性。

2. 阴性：在观察孔内，若对照线C显色，而检测线T不显色，判为阴性。

3. 无效：在观察孔内，若对照线不显色，则结果无效，建议重新测试。

【检测方法的局限性】1. 检测线红色线条的颜色深浅直接与检测病毒多少相关。

当检测病毒含量很高时，检测线可能在出现后，红色又慢慢变淡，此时建议将样品数倍稀释后再进行检测，红色线条就可以稳定了。

2. 当检测线出现模糊的色迹，但不显示为清楚的线形时，判为阴性。

3. 本试剂是定性筛选试剂，一个明确的临床诊断结果应该由医生在考虑到所有的临床和实验室的现象后作出。

中国畜牧兽医 2022,49(8):3151-3162C h i n aA n i m a lH u s b a n d r y &V e t e r i n a r y Med i c i ne 猪轮状病毒江西株A Y 01的分离鉴定刘小兰1,刘昌锦1,余文洋1,李潇翔1,边彦超1,黄校花1,罗 锋2,邓舜洲1(1.江西农业大学动物科学技术学院,南昌330045;2.江西金伊博生物科技有限公司,南昌330013)摘 要:ʌ目的ɔ确定江西省某猪场哺乳仔猪发生腹泻的病因㊂ʌ方法ɔ对送检的仔猪小肠样品进行猪流行性腹泻病毒(P o r c i n e e p i d e m i c d i a r r h e a v i r u s ,P E D V )㊁猪传染性胃肠炎病毒(T r a n s m i s s i b l e g a s t r o e n t e r i t i sv i r u s ,T G E V )和猪轮状病毒(P o r c i n e r o t a v i r u s ,P o R V )的R T -P C R 检测,将阳性样品接种MA 104细胞传代进行P o R V 的分离;对分离毒株进行电镜观察㊁间接免疫荧光试验㊁P o R V V P 4和V P 7基因序列测序和动物回归等试验㊂ʌ结果ɔ猪小肠病料样品经终浓度15μg /m L 的胰酶处理37ħ孵育2h ,接种MA 104细胞,能在细胞上增殖传代,第6代开始表现稳定的细胞病变;电镜观察可见病毒粒子直径大小为61~70n m ,平均大小为65n m ,呈带有短纤突且外缘光滑的形似车轮状的粒子,具有轮状病毒粒子典型的形态特征;间接免疫荧光试验和R T -P C R 检测均为P o R V 阳性,确定该分离株为P o R V ㊂分离株V P 4和V P 7基因序列分析显示,V P 4基因型与P [23]基因型相似性最高,V P 7基因型与G 5基因型相似性最高,根据A 群轮状病毒最新分类方法,分离株属于G 5P [23]型㊂动物回归试验结果显示,经口感染该分离株的1日龄初生仔猪于感染后24h 左右陆续出现水样腹泻㊁呕吐等临床症状,并能在粪便中检测到P o R V ㊂ʌ结论ɔ通过MA 104细胞连续传代,从江西某猪场的腹泻仔猪小肠样品成功分离到1株P o R V ,该分离株属于G 5P [23]型P o R V ,为哺乳仔猪发生腹泻的病原㊂关键词:猪轮状病毒(P o R V );分离鉴定;动物回归试验中图分类号:S 852.65+1文献标识码:AD o i :10.16431/j.c n k i .1671-7236.2022.08.031 开放科学(资源服务)标识码(O S I D ):收稿日期:2022-02-28基金项目:江西省现代农业产业技术体系建设专项资金(J X A R S -03)联系方式:刘小兰,E -m a i l :2386356391@q q .c o m ㊂邓舜洲,E -m a i l :s h z h d e n g@163.c o m I s o l a t i o na n d I d e n t i f i c a t i o no f P o r c i n eR o t a v i r u s J i a n gx i S t r a i nA Y 01L I U X i a o l a n 1,L I U C h a n g j i n 1,Y U W e n y a n g 1,L IX i a o x i a n g 1,BI A N Y a n c h a o 1,HU A N G X i a o h u a 1,L U OF e n g 2,DE N GS h u n z h o u 1(1.C o l l e g e o f A n i m a lS c i e n c e a n dT e c h n o l o g y ,J i a n g x i A g r i c u l t u r a lU n i v e r s i t y ,N a n c h a n g330045,C h i n a ;2.J i a n g x i J i n y i b oB i o t e c h n o l o g y C o m p a n y ,N a n c h a n g 330013,C h i n a )A b s t r a c t :ʌO b j e c t i v e ɔT h e s t u d y w a s a i m e d t od e t e r m i n e t h e e t i o l o g y o f d i a r r h e a p i g l e t s i na p i gf a r mi n J i a ng x i p r o v i n c e .ʌM e th o d ɔT h e s m a l li n t e s t i n e s a m p l e s o f p i gl e t sw e r e t e s t e d f o rP o r c i n e e p i d e m i c d i a r r h e a v i r u s (P E D V ),po r c i n e T r a n s m i s s i b l e g a s t r o e n t e r i t i s v i r u s (T G E V )a n d P o r c i n er o t a v i r u s (P o R V )b y R T -P C R .P o s i t i v es a m pl e w a si n o c u l a t e di n t o MA 104c e l l sf o r p a s s a g et oi s o l a t eP o R V .T h e i s o l a t e ds t r a i n w a sd e t e c t e db y e l e c t r o n m i c r o s c o p eo b s e r v a t i o n ,i n d i r e c t i m m u n o f l u o r e s c e n c et e s t ,P o R V V P 4a n d V P 7g e n e ss e q u e n c i n g a n da n i m a l r e g r e s s i o n t e s t .ʌR e s u l t ɔT h e r e s u l t s s h o w e d t h a t p o r c i n e i n t e s t i n a l d i s e a s e s a m pl e sw e r e i n c u b a t e d a t 37ħf o r2h w i t hf i n a l c o n c e n t r a t i o no f15μg /m Lt r y p s i na n di n o c u l a 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o n g e d t oG5P[23]g e n o t y p eP o R V,w h i c hw a s t h e p a t h o g e no f d i a r r h e a i n p i g l e t s.K e y w o r d s:P o r c i n e r o t a v i r u s(P o R V);i s o l a t i o na n d i d e n t i f i c a t i o n;a n i m a l r e g r e s s i o ne x p e r i m e n t猪轮状病毒(P o r c i n e r o t a v i r u s,P o R V)是导致哺乳仔猪和断奶仔猪腹泻的常见病原之一,属呼肠孤病毒科轮状病毒属成员[1]㊂感染P o R V后,发病猪主要表现厌食㊁呕吐㊁水样腹泻等特征,P o R V在世界范围的流行非常普遍,各种年龄㊁性别的猪均可感染,主要危害1~4周龄仔猪,尤其1~10日龄仔猪感染后发病率可超过80%,死亡率为50%~ 100%[2-3],成年猪多为隐性感染,该病潜伏期短㊁传染性强㊁流行范围广,给养猪业造成巨大的经济损失㊂P o R V为无囊膜正链R N A病毒,具有二十面体立体对称的双层衣壳,直径在65~75n m之间,在电镜下,可观察到形似 车轮状 的病毒粒子[4]㊂病毒核酸由11个双股R N A基因片段组成,每一基因片段各编码一种蛋白,其中V P1~V P4㊁V P6㊁V P7为结构蛋白,N S P1~N S P6为非结构蛋白[5]㊂V P6是数量最多的结构蛋白,是病毒的群抗原,根据V P6可将轮状病毒分为10个基因群(A~J),其中A群轮状病毒(R V A)是最典型的轮状病毒㊂轮状病毒的基因型主要根据病毒表面的V P4和V P7蛋白分型,分别为P㊁G血清型,目前在人和动物的R V A 中发现35个P血清型和27个G血清型[6]㊂1969年轮状病毒在犊牛中首次被报道[7],随后1975年R o d g e r等[8]在猪粪便中分离到P o R V,中国于1982年由庞其方等[9]在腹泻仔猪粪便中分离出该病毒,随后陆续有学者在马㊁羊㊁鸡等多种动物的腹泻粪便中发现轮状病毒㊂P o R V在全球范围内广泛分布,以猪R V A最为常见,其复杂的流行病学㊁遗传多样性被广泛研究,在猪群中的患病率在3.3%~67.3%之间,猪场阳性感染率为61%~ 74%[10-11],此病毒的感染传播高发季为早春㊁冬季和晚秋这些温度较低时节[12]㊂P o R V常与多种猪源性传染病混合感染仔猪,导致P o R V的流行很复杂㊂本试验从疑似P o R V感染的猪场采集病料,对此病毒的分离培养条件进行探究,利用MA104细胞分离获得1株P o R V,观察该分离株人工感染新生仔猪后的临床表现和剖检病理学变化,以期为P o R V的流行情况提供理论参考㊂1材料与方法1.1材料1.1.1病料㊁细胞系和试验动物病料为江西南昌某规模化猪场腹泻仔猪的小肠样品,-80ħ保存备用;MA104细胞(C R L-2378.1)㊁V e r o细胞(C C L-81)㊁P K15细胞(C C L-33)㊁MA R C-145细胞(C R L-12231)㊁M c C o y细胞(C R L-1696)㊁S T细胞(C R L-1746)㊁I E C-18细胞(C R L-1589)㊁I P E C-J2细胞均由江西农业大学预防兽医室保存;1日龄未吃初乳初生仔猪购自江西省某规模化猪场㊂1.1.2主要试剂高糖D M E M细胞培养液㊁胎牛血清(G i b c o公司);反转录酶M-M L V㊁R R I试剂(T a K a R a公司);胰酶㊁羊抗鼠F I T C-I g G抗体(S o l a r b i o公司);鼠抗轮状病毒V P6蛋白高免血清(效价1ʒ5.12ˑ105至1ʒ10.24ˑ105)由江西农业大学预防兽医教室制备保存;一步法反转录实时荧光定量检测试剂盒(G e n S t a r公司)㊂1.2病料处理取小肠组织用无菌匀浆器匀浆后,按比例制成1ʒ10的D M E M悬液,反复冻融3次,4ħ㊁12000r/m i n离心15m i n,用0.22μm细菌滤器过滤上清液,-80ħ保存备用㊂1.3引物设计与合成参考G e n B a n k中收录的轮状病毒V P4基因序列(登录号:K C113250.1)设计1对V P4基因全长25138期刘小兰等:猪轮状病毒江西株A Y01的分离鉴定的测序引物;参考G e n B a n k上收录的A型轮状病毒的V P7基因序列(登录号:MT025938.1)设计2对引物,分别作为检测引物和V P7基因全长的测序引物;参考C V777毒株的O R F1基因序列(登录号: L T906581.1)设计猪流行性腹泻病毒(P o r c i n e e p i d e m i cd i a r r h e av i r u s,P E D V)的检测引物;参考H E-1毒株的N基因序列(登录号:K X083668.1)设计猪传染性胃肠炎病毒(T r a n s m i s s i b l e g a s t r o e n t e r i t i s v i r u s,T G E V)的检测引物,引物序列见表1㊂引物均由南京金斯瑞生物科技有限公司合成㊂表1引物信息T a b l e1P r i m e r i n f o r m a t i o n引物P r i m e r s引物序列P r i m e r s e q u e n c e s(5'ң3')产物大小P r o d u c t l e n g t h/b p退火温度A n n e a l i n g t e m p e r a t u r e/ħP o R V-F G T A T G G T A T T G A A T A T A C C A C A G T T C50350 P o R V-R C C A T T G G A T T A C A T A G C C A T T C AV P4-F A T G G C T T C T C T A A T T T A C A G233147 V P4-R T T A T A A T C T A C A T T G T A G T A T A A G T T G T TV P7-F C G A C T G G C T A T C G G A T A G C T C C T T103552 V P7-R G G T C A C A T C A T A C A A T T C T A A CP E D V-F T G A C T G G C A A C T G G T T C G T T132450 P E D V-R C G C A G G T C C G G T T T A T C T G AT G E V-F C A A A C T C G C T A T C G C A T G G52950 T G E V-R T C T T G T C A C A T C A C C T T T A C C T G C1.4R T-P C R扩增采用T R I z o l法提取病毒总R N A,按照反转录试剂盒说明书将R N A反转录为c D N A,以其为模板进行P C R扩增㊂P C R反应体系50μL:c D N A模板2μL,H i F i B u f f e r5μL,d N T P s4μL,H i F i酶0.5μL,上㊁下游引物(20μm o l/L)各0.5μL,d d H2O37.5μL㊂P C R反应程序:94ħ预变性5m i n;94ħ变性30s,50ħ退火30s,72ħ延伸1m i n,共37个循环;72ħ延伸8m i n㊂P C R产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定㊂1.5病毒分离培养在病毒滤液中加入终浓度为15μg/m L的胰酶,37ħ处理1.5h㊂取出汇合度约90%的MA104细胞,弃去培养液,并用无血清的D M E M洗3遍,将处理好的样品接种于细胞,37ħ吸附2h,加入含终浓度为7.5μg/m L胰酶的D M E M维持液,继续培养48h后收集病毒液,反复冻融3次,即为第1代P1分离株,收集培养液进行下一代在MA104细胞上盲传,直至产生细胞病变,同时收集每代的细胞培养物进行R T-P C R扩增鉴定㊂1.6病毒鉴定1.6.1病毒V P4㊁V P7基因R T-P C R鉴定提取分离毒株的第5(P5)和第10代(P10)细胞培养物的R N A,将其反转录为c D N A,以此为模板,分别用V P4㊁V P7基因特异性引物进行P C R扩增,扩增产物进行1.0%琼脂糖凝胶电泳检测,并将产物送至湖南擎科生物技术有限公司测序㊂将测序结果在N C B I上进行B L A S T比对分析,从G e n B a n k中查找到P o R V V P4和V P7各型的参考毒株,利用M e g a7.0软件构建V P4㊁V P7基因的系统进化树,确定分离株的基因型㊂1.6.2病毒间接免疫荧光试验鉴定将MA104细胞接种于96孔细胞培养板,细胞长成单层后接种病毒液,37ħ培养48h后弃上清,预冷甲醇固定,以鼠抗V P6蛋白多克隆抗体(1ʒ2000)为一抗㊁羊抗鼠F I T C-I g G(1ʒ500)为二抗对病毒进行染色检测,于倒置荧光显微镜下观察检测结果㊂1.6.3病毒电镜观察收集分离株细胞培养物,病毒液反复冻融3次,12000r/m i n离心10m i n,离心上清经蔗糖浓缩后透析,过0.22μm细菌滤器,收集滤液经磷钨酸负染后用日立H T7700透射电镜观察病毒形态㊂1.7病毒部分生物学特性检测1.7.1病毒增殖曲线绘制取出汇合度约90% MA104细胞,用无血清培养液洗3次,以感染复数(MO I)为0.05的病毒量感染,置于37ħ㊁5%3513中国畜牧兽医49卷C O2培养箱中培养2h后,弃病毒液,每孔补加含5μg/m L胰酶的无血清D ME M维持液,每隔4h刮取细胞,收集病毒液㊂将各时间点收集的病毒液分别按照10倍倍比稀释,从10-1稀释至10-8,接种于已铺满MA104细胞的96孔细胞培养板,并设正常细胞作为对照,置于37ħ㊁5%C O2培养箱中培养2d后㊂利用间接免疫荧光试验进行荧光染色观察,按照R e e d-M u e n c h法计算各时间点的50%组织细胞感染量(T C I D50),并以时间为横坐标㊁各时间点的T C I D50为纵坐标,绘制病毒的增殖曲线㊂1.7.2分离毒株对不同细胞的易感性将MA104㊁V e r o㊁I P E C-J2㊁P K15㊁MA R C-145㊁M c C o y㊁S T㊁I E C-18细胞分别接种于96孔细胞培养板中培养,待细胞铺满培养板后,用无血清的D M E M培养液洗3次,以MO I为0.05的病毒量感染分离毒株,置于37ħ㊁5%C O2培养箱中吸附2h,弃病毒液,每孔补加含5μg/m L胰酶的无血清D M E M维持液,同时设置相应的正常细胞作为对照,置于37ħ㊁5%C O2培养箱中培养2d后弃培养液,固定,进行间接免疫荧光检测㊂1.8动物回归试验将4头1日龄未吃初乳的新生仔猪随机分组,其中试验组3头,对照组1头,试验组仔猪经人工口服分离株第20代细胞培养液,1m L/头(病毒含量106.0 T C I D50/m L),对照组仔猪口服等体积D M E M㊂每隔2h饲喂仔猪专用猪奶粉,每隔4h采集粪便拭子,并记录试验仔猪的食欲及精神状况,攻毒后48h剖杀㊂参考许梦怡等[13]建立的P E D V㊁T G E V㊁P o R V的多重荧光定量P C R检测方法,应用一步法反转录实时荧光定量检测试剂盒检测粪便排毒情况㊂上游引物:5'-C G C G G A G C T A A A C G T G A A A A-3';下游引物:5'-T T A C T C T C C A T A A T T G C G T C T A T G T T C-3';探针:5-(R O X)-C C A C A A C A G A A T G A A C G T C T G C-A A G A A A A A-(B H Q2)-3'㊂P C R反应体系20μL: 2ˑS t a r S c r i p tⅡP r o b eO n e-S t e pq R T-P C RB u f f e r 10μL,S t a r S c r i p tⅡP r o b eO n eS t e p E n z y m e M i x 2μL,探针(10μm o l/L)0.5μL,上㊁下游引物(10μm o l/L)各0.5μL,R N A模板2μL,D E P C水补至20μL㊂P C R反应程序:50ħ15m i n;94ħ2m i n;94ħ15s,60ħ30s,共40个循环㊂试验结束后,剖检,收集仔猪小肠样品,用4%多聚甲醛固定,用于H E病理切片染色和免疫组织化学检测㊂2结果2.1病料R T-P C R检测对处理好的病料样品进行R T-P C R,经1.0%琼脂糖凝胶电泳分析,结果表明P o R V-F/R引物扩增产物电泳后可见约503b p的扩增条带,与预期大小相符,而使用P E D V和T G E V特异性引物未扩增出特异性条带(图1),表明该病料样品含P o R V㊂M,D L2000D N A M a r k e r;1㊁4㊁7,病料样品;2,P o R V阳性对照;5,P E D V阳性对照;8,T G E V阳性对照;3㊁6㊁9,阴性对照M,D L2000D N A M a r k e r;1,4a n d7,S i c k m a t e r i a l s a m p l e s; 2,P o R V p o s i t i v e c o n t r o l;5,P E D V p o s i t i v e c o n t r o l;8,T G E V p o s i t i v e c o n t r o l;3,6a n d9,N e g a t i v e c o n t r o l图1样品P o R VR T-P C R检测结果F i g.1R T-P C Rd e t e c t i o n r e s u l t s o f s a m p l e s f o rP o R V2.2病毒分离病料滤液经胰酶处理后接种MA104单层细胞,盲传细胞第1~3代无明显变化;第4~5代细胞在48h脱落细胞增多;传至第6代时,16~24h时产生明显的细胞病变,具体表现为细胞变圆皱缩,出现拉网现象并逐渐脱落(图2A),未感染的MA104细胞正常生长(图2B)㊂继续传代后,分离毒株逐渐适应MA104细胞,将该毒株命名为P o R V A Y01株㊂2.3分离株鉴定结果2.3.1V P4和V P7基因检测结果提取分离株的P5和P10代细胞培养液进行R T-P C R,R T-P C R产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳的检测结果见图3㊁4㊂结果显示在约2331和1035处出现目的条带,分别与预期V P4㊁V P7基因片段大小相符㊂2.3.2分离株基因型鉴定及基因进化树分析对分离株V P4基因测序结果经B L A S T在线比对,结果显示,分离株与P o R V的V P4基因相似性达96.65%,确定分离株V P4基因为P[23]型㊂系统进化树结果显示,A Y01株的V P4基因与四川的猪轮状病毒S C Y B-C3株(MT198752.1)的亲缘关系45138期刘小兰等:猪轮状病毒江西株A Y 01的分离鉴定最近(图5)㊂分离株V P 7基因测序结果经B L A S T 在线比对,结果显示,分离株与P o R V V P 7基因相似性达97.78%,确定分离株V P 7基因为G 5型㊂系统进化树结果显示,A Y 01株的V P 7基因与黑龙江的猪轮状病毒Z j h 3-2株(J X 498961.1)的亲缘关系最近,同时与中国流行血清型G 5型的代表毒株O S U 在进化关系上构成一个分支(图6)㊂因此分离毒株的基因型为G 5P [23]型㊂A ,A Y 01毒株感染的MA 104细胞;B ,正常MA 104细胞A ,MA 104c e l l s i n f e c t e dw i t hA Y 01s t r a i n ;B ,N o r m a lMA 104c e l l s 图2 分离株感染M A 104细胞时的细胞病变(100ˑ)F i g .2 C y t o pa t h i c e f f e c t o f t h e i s o l a t e d s t r a i no n M A 104c e l l s (100ˑ)M ,D N A M a r k e r Ⅳ,1,阳性对照;2,P 5代细胞培养物;3,P 10代细胞培养M ,D N A M a r k e r Ⅳ;1,P o s i t i v ec o n t r o l ;2,P 5g e n e r a t i o n c e l l c u l t u r e ;3,P 10g e n e r a t i o n c e l l c u l u r e图3 A Y 01株V P 4基因R T -P C R 扩增结果F i g .3 R T -P C R a m p l i f i c a t i o nr e s u l to f V P 4g e n eo fA Y 01s t r a inM ,D L 2000D N A M a r k e r ;1,阳性对照;2,P 5代细胞培养物;3,P 10代细胞培养物M ,D L 2000D N A M a r k e r ;1,P o s i t i v e c o n t r o l ;2,P 5c e l l c u l t u r e ;3,P 10c e l l c u l u r e图4 A Y 01株V P 7基因R T -P C R 扩增结果F i g .4 R T -P C Ra m p l i f i c a t i o n r e s u l t o f V P 7g e n e o f t h eA Y 01s t r a i n5513中 国 畜 牧 兽 医49卷图5 A Y 01株V P 4基因核苷酸序列系统进化树F i g .5 P h y l o g e n e t i c t r e e b a s e do n t h e n u c l e o t i d e s e qu e n c e o f V P 4g e n e o fA Y 01s t r a in 图6 A Y 01株V P 7基因核苷酸序列系统进化树F i g .6 P h y l o g e n e t i c t r e e b a s e do n t h e n u c l e o t i d e s e qu e n c e o f V P 7g e n e o fA Y 01s t r a i n 2.3.3 间接免疫荧光试验结果 将分离毒株的细胞培养液接种MA 104细胞,以鼠抗V P 6蛋白多克隆抗体为一抗㊁羊抗鼠F I T C -I g G 为二抗进行间接免疫荧光试验,结果显示,感染病毒的孔内细胞胞浆内可见特异性绿色荧光(图7A ),正常MA 104细胞孔内未见荧光(图7B )㊂2.3.4 病毒电镜观察结果 P o R V A Y 01株细胞培养物经超速离心纯化,负染后进行透射电镜观察,电镜下可看到形态呈球形,具有明显的双层衣壳结构,似车轮状的病毒颗粒,直径大小为61~70n m ,平均大小65n m (图8)㊂65138期刘小兰等:猪轮状病毒江西株A Y 01的分离鉴定A ,A Y 01毒株感染的MA 104细胞;B ,正常MA 104细胞A ,MA 104c e l l s i n f e c t e dw i t hA Y 01s t r a i n ;B ,N o r m a lMA 104c e l l s图7 P o R VA Y 01株感染M A 104细胞间接免疫荧光试验检测结果(100ˑ)F i g.7 I F At e s t r e s u l t s o fM A 104c e l l s i n f e c t e dw i t hP o R VA Y 01s t r a i n (100ˑ)图8 P o R VA Y 01株病毒粒子电镜观察(20000ˑ)F i g .8 E l e c t r o n m i c r o g r a pho fv i r u s p a r t i c l eo fP o R V A Y 01s t r a i n (20000ˑ)2.4 分离毒株的部分生物学特性检测结果2.4.1 分离毒株增殖曲线的绘制 由图9可知,分离株A Y 01在接毒后8~12h 就可达到病毒滴度峰值,随后进入病毒增殖稳定期(图9)㊂图9 P o R VA Y 01株的增殖曲线F i g.9 P r o l i f e r a t i o n c u r v e o fP o R VA Y 01s t r a i n 2.4.2 分离毒株对不同细胞的易感性 间接免疫荧光试验结果显示,分离毒株对试验所用细胞有感染,可用免疫荧光方法检测P o R V ㊂在可见光下,分离株在MA 104㊁V e r o ㊁I P E C -J 2㊁P K 15细胞中产生细胞病变,在S T ㊁M c C o y㊁I E C -18细胞中无细胞病变;经免疫荧光检测,分离株在MA 104㊁V e r o 细胞中可检测到大面积的荧光,其中毒株在MA 104细胞的胞浆内可见特异性绿色荧光,在V e r o 细胞的细胞核中能检测到特异性绿色荧光,在I P E C -J 2㊁P K 15细胞中的荧光较少,在S T ㊁M c C o y 细胞中只有零星的荧光,在MA R C -145㊁I E C -18细胞中无荧光(图10)㊂综上得出,分离毒株在所用细胞中的易感性排序为MA 104>V e r o>I P E C -J 2>P K 15>S T>M c C o y >MA R C -145>I E C -18细胞,表明P o R V 分离株在MA 104细胞上的易感性最好㊂2.5 动物回归试验2.5.1 临床症状及剖检变化 试验组3头仔猪接种A Y 01株后,8~24h 时3头猪排软粪,24~48h 时均陆续由黄色软粪转为水样腹泻,具体表现为精神沉郁㊁嗜睡,饮食量严重下降,排黄色水样稀粪便,并伴有腥臭味,48h 时剖检攻毒组仔猪可见胃内有未消化的凝乳,小肠肠壁变薄㊁出血,肠内有黄色液体㊂试验期间,对照组仔猪未出现上述症状㊂表明分离毒株A Y 01株攻毒可致使仔猪持续排毒,并产生典型腹泻症状㊂2.5.2 P o R V 感染后排毒检测 试验期间每4h收集2组仔猪肛门拭子,利用一步法实时荧光定量P C R 方法监测排毒情况,结果显示,在24~48h 时C t 值变化明显,36~44h 降到最低(图11),此时仔猪临床表现为饮食量下降,精神萎靡,腹泻严重,排黄色水样粪便㊂2.5.3 病理组织及免疫组化切片观察 病理组织切片观察结果显示,试验组仔猪小肠绒毛呈弥漫性萎缩㊁绒毛减少,脱落(图12A ),对照组肠道结构7513中 国 畜 牧 兽 医49卷完整,未见坏死脱落(图12C )㊂免疫组化检测结果显示,试验组仔猪肠绒毛及黏膜层处分散有褐色点状物(图12C ),为P o R V 阳性;对照组仔猪肠道均正常(图12D )㊂图10 分离毒株A Y 01对不同细胞的易感性(100ˑ)F i g .10 S u s c e p t i b i l i t y of i s o l a t e d s t r a i nA Y 01t od i f f e r e n t c e l l s (100ˑ)85138期刘小兰等:猪轮状病毒江西株A Y 01的分离鉴定图11 仔猪接种P o R VA Y 01株后粪便排毒检测F i g .11 D e t e c t i o no f f e c a l d e t o x i f i c a t i o n i n p i gl e t s i n o c u l a t e dw i t hP o R VA Y 01s t r a in ①A ㊁B ,分别为试验组和对照组仔猪空肠切片H E 染色结果(100ˑ);C ㊁D ,分别为试验组和对照组仔猪空肠切片免疫组化染色结果(200ˑ)㊂②图A 中箭头表示肠绒毛脱落;图C 中箭头表示P o R V 抗原①Aa n dB ,H Es t a i n i n g r e s u l t s o f j e j u n u ms e c t i o n s o f i n f e c t e d p i g l e t s i n t h e t e s t a n dc o n t r o l g r o u p s ,r e s p e c t i v e l y (100ˑ);Ca n dD ,I m m u n o h i s t o c h e m i c a l s t a i n i n g r e s u l t s o f j e j u n u ms l i c e s o f p i g l e t s i n t h e t e s t a n d c o n t r o l g r o u p s ,r e s p e c t i v e l y (200ˑ).②A r r o w s i n p a n e lAi n d i c a t e s h e d d i n g o f i n t e s t i n a l v i l l i ;A r r o w s i n p a n e l C i n d i c a t eP o R Va n t i g e n s 图12 肠道组织病理及免疫组化切片观察F i g .12 P a t h o l o gi c a l a n d i m m u n o h i s t o c h e m i c a l s e c t i o n s o b s e r v a t i o no f i n t e s t i n a l t i s s u e 3 讨 论P o R V 在猪群中的感染非常普遍,在中国规模化猪场仔猪腹泻粪便中的阳性率为7.69%~28.76%[14-17],早期分离的P o R V 很难适应细胞,直到1984年B o h l 等[18]首次用胰酶处理样品,感染MA 104细胞,开启了P o R V 的体外分离培养进程,B e n u r e a u [19]证实胰酶能结合轮状病毒颗粒,溶解其外壳蛋白,从而增强病毒的感染能力㊂随着现代生物科技的发展,对P o R V 的分离培养技术逐渐成熟,目前的轮状病毒体外培养是否成功主要由细胞种类㊁胰酶浓度以及粪液中病毒粒子的完整性等因素决定,其中胰酶在轮状病毒增殖时有重要作用,时洪艳等[20]在处理病料时加入20μg/m L 胰酶消化,从MA 104细胞上分离到1株P o R V ㊂陈淑红等[21]9513中国畜牧兽医49卷则使用30μg/m L胰酶消化处理才从MA104细胞上分离到P o R V毒株㊂杨娟[22]仅加入0.1μg/m L 胰酶消化处理病料便从V e r o细胞上分离到P o R V S WU-1C/2018株㊂本研究将病料滤液经终浓度15μg/m L胰酶预处理,在维持液中添加终浓度7.5μg/m L胰酶为分离培养P o R V的条件,成功分离到1株P o R V,将该毒株命名为P o R V A Y01株㊂A Y01株在MA104细胞上盲传至第6代后表现稳定的细胞病变,具体表现为细胞折光性增强㊁拉网脱落等,这与张贺伟等[23]㊁黄小波等[24]结果一致㊂P o R V在体内只感染肠绒毛的上皮细胞,在体外能感染肾或肠道上皮细胞,其中最敏感的是MA104细胞,随后发现用胰酶处理的轮状病毒也能在S T㊁MA R C-145㊁P K15㊁V e r o等细胞上增殖[25-27],本试验分离株能够在MA104㊁V e r o㊁I P E C-J2㊁P K15㊁S T㊁M c C o y㊁M A R C-145细胞中增殖,其易感性排序为M A104>V e r o>I P E C-J2>P K15>S T>M c C o y> MA R C-145>I E C-18细胞,进一步验证MA104细胞是分离轮状病毒的最佳选择㊂轮状病毒基因型和血清型很多,且在自然界中还存在着人与动物㊁动物与动物之间的基因片段重组现象[28-30],R V A的基因型众多,且G型与P型之间会产生不同的组合,不同组合型的R V A毒株的交叉保护性很低[31-32]㊂目前,R V A中与猪相关的轮状病毒G血清型有12种,P血清型16种,其中在中国流行的P o R V G血清型为G3㊁G4㊁G5㊁G9㊁G11和G26,通常会与P[5]㊁P[6]㊁P[7]㊁P[13]㊁P[23]组合的形式流行[33-34]㊂在本试验中,分离株的V P4基因与P[23]型的P o R V S C Y B-C3株亲缘关系最近,相似性为96.65%,V P7基因与G5型的P o R V Z j h z l3-2株和O S U/U S A株相似性分别为97.78%和93.8%,据M a t t h i j n s s e n s等[6]提出的 轮状病毒V P4编码区核苷酸序列相似性>90%,即为同一基因型,轮状病毒V P7编码区核苷酸序列相似性> 80%,即为同一基因型 的划分方法,确定A Y01株属于G5P[23]型P o R V㊂在众多P o R VG/P组合型中,G5P[7]型P o R V是全球流行最广泛的组合型,占所有P o R V的37.3%[35],但随着R V A基因片段间重组频繁,近年来在中国陆续报道了G11P[13]㊁G9P[23]㊁G9P[7]㊁G4P[13]㊁G26P[13]等新型组合的P o R V[36-38],本试验报道了一种新组合型P o R V A Y01株,丰富了国内P o R V的资料,有利于对国内P o R V的监测㊂目前,国内关于P o R V分离的报道越来越多,但关于P o R V对猪致病性的相关报道较少㊂本试验开展P o R V A Y01毒株人工感染仔猪的致病性研究,为防止仔猪母源抗体对试验的影响,选择1日龄新生未吃初乳的仔猪为试验对象,仔猪经口感染分离毒株,在攻毒后24~48h期间,仔猪表现呕吐㊁腹泻㊁排黄色水样并伴有腥臭的稀粪的症状,剖检可见各肠段胀气明显,小肠肠壁变薄,肠系膜充血肿胀,小肠绒毛萎缩,肠上皮细胞脱落㊁坏死㊂黄小波等[24]使用3日龄仔猪感染P o R V O S U株,在感染10h后,仔猪开始腹泻,拉黄色水样稀粪,感染42h 后仔猪脱水死亡㊂N a r i t a等[39]通过对8头口服P o R V的新生仔猪的肠道病变进行研究时,发现感染P o R V的仔猪在接种后18~24h表现腹泻,肠绒毛脱落㊁萎缩,特别是空肠和回肠的变性,这与本试验分离株感染仔猪的症状和病理切片观察结果一致㊂此外,在整个试验过程中,使用实时荧光定量P C R方法对试验组仔猪粪便排毒情况进行检测,发现试验组仔猪均在24~48h期间C t值变化明显, 36~44h降到最低,此时仔猪临床表现为腹泻㊁呕吐㊁排黄色水样粪便等典型的P o R V症状,表明此时是仔猪粪便排毒的高峰期㊂因此,初步得出P o R V在进行动物致病性研究时,可结合仔猪临床与实时荧光定量P C R方法,对试验过程进行监测,当发病症状表现明显及C t值最低时处死仔猪,能最大程度得到病毒含量高的病料样品㊂4结论本试验成功分离到1株基因型为G5P[23]型的P o R V,为了解江西地区P o R V的流行变异情况及有效防治P o R V感染提供了参考依据㊂参考文献(R e f e r e n c e s):[1] Z I MM E R MA NJ J.猪病学[M].赵德明,译.10版.北京:中国农业大学出版社,2014.Z I MM E R M A NJ J.D i s e a s e s o f S w i n e[M].Z H A OD M,t r a n s l a t i o n.10t h e d.B e i j i n g:C h i n a A g r i c u l t u r a lU n i v e r s i t y P r e s s,2014.(i nC h i n e s e)[2] F L E W E E T T H,WO O D EG N.T h eR o t a v i r u s e s[J].A r c 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