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1.简介原核表达技术路线。
一个完整的表达系统通常包括配套的表达载体和表达菌株。
如果是特殊的诱导表达还包括诱导剂，如果是融合表达还包括纯化系统或者Tag检测等等。
选择表达系统通常要根据实验目的来考虑，比如表达量高低，目标蛋白的活性，表达产物的纯化方法等等。
a)为了获得高水平的基因表达产物，人们通过综合考虑控制转录、翻译、蛋白质稳定性及向胞外分泌等诸多方面的因素，设计出了许多具有不同特点的表达载体，以满足表达不同性质、不同要求的目的基因的需要。
通常关心的表达载体质粒上的元件包括：启动子、多克隆位点、终止密码、融合Tag（如果有的话）、复制子、筛选标记或报告基因等。
b)表达菌株是我们往往最容易忽视的一点。
目前绝大多数重要的目的基因都是在大肠杆菌中表达的。
不同的表达载体对应有不同的表达菌株，一些特别设计的菌株更有助于解决一些表达难题。
2.掌握免疫组化基本策略。
1，切片，烤片60℃，1h。
2，脱蜡及复水二甲苯10min，100％乙醇5min，95％乙醇5min，90％乙醇5min，85％乙醇5min，80％乙醇5min，75％乙醇5min，60％乙醇5min，50％乙醇5min，30％乙醇5min，自来水1min，双氧水1min。
3，1份30％H2O2加10份蒸馏水，室温10min，蒸馏水洗3次，每次3min。
4，微波修复将切片浸入0.01M枸橼酸缓冲液，微波中最大火力（98℃-100℃）加热至沸腾，冷却（约5-10min），反复两次。
5，将切片自然冷却至室温，PBS洗涤3次，每次5min。
6，封闭，5％BSA，室温20min，甩去多余液体。
7，滴加一抗，37℃，1h，或者4℃过夜。
8，PBS洗涤3次，每次3min。
9，滴加二抗，37℃，15-30min。
10，PBS洗涤3次，每次3min。
11，滴加SABC，37℃， 30min。
12，PBS洗涤3次，每次5min。
13，1ml蒸馏水中分别滴加显色剂，混匀。
原核表达（原理、材料与实验方案）一、原理1、E . coli表达系统E . coli是重要的原核表达体系。
在重组基因转化入E . coli 菌株以后，通过温度的控制，诱导其在宿主菌内表达目的蛋白质，将表达样品进行SDS-PAGE 以检测表达蛋白质。
2、外源基因的诱导表达提高外源基因表达水平的基本手段之一，就是将宿主菌的生长与外源基因的表达分成两个阶段，以减轻宿主菌的负荷。
常用的有温度诱导和药物诱导。
本实验采用异丙基硫代-β-D-半乳糖昔（IPTG）诱导外源基因表达。
不同的表达质粒表达方法并不完全相同，因启动子不同，诱导表达要根据具体情况而定。
二、材料1、诱导表达材料( 1 ) LB （Luria—Bertani）)培养基酵母膏(Yeast extract) 5g 蛋白胨(Peptone) 10gNaCl 10g 琼脂(Agar) 1-2%蒸馏水(Distilled water) 1000ml pH 7.0适用范围：大肠杆菌( 2 ) IPTG 贮备液：2 g IPTG溶于10 mL 蒸馏水中，0 . 22 μm 滤膜过滤除菌，分装成1 mL /份，－20 ℃保存。
( 3 ) l×凝胶电泳加样缓冲液：50 mmol / L Tris -CI ( pH 6 . 8 )50 mmol / L DTT2 % SDS （电泳级）0.1 ％溴酚蓝10 ％甘油2、大肠杆菌包涵体的分离与蛋白纯化材料1 ）酶溶法（1）裂解缓冲液：50 mmol / L Tris-CI ( pH 8 . 0 )1 mmol / L EDTA100 mmol / LNaCI（2）50 mmol / L 苯甲基磺酰氟（PMSF ）。
（3）10 mg / mL 溶菌酶。
（4）脱氧胆酸。
（5）1 mg / mL DNase I。
2 ）超声破碎法( 1 ) TE 缓冲液。
( 2 ) 2×SDS -PAGE 凝胶电泳加样缓冲液：100 mmol / L Tris-HCI ( pH 8 . 0 )100 mmol / L DTT4 %SDS0.2 ％溴酚蓝20 ％甘油三、实验方案1、外源基因的诱导表达( 1 ）用适当的限制性内切核酸酶消化载体DNA 和目的基因。
一、原理1、E . coli表达系统E . coli是重要的原核表达体系。
在重组基因转化入E . coli 菌株以后，通过温度的控制，诱导其在宿主菌内表达目的蛋白质，将表达样品进行SDS-PAGE 以检测表达蛋白质。
2、外源基因的诱导表达提高外源基因表达水平的基本手段之一，就是将宿主菌的生长与外源基因的表达分成两个阶段，以减轻宿主菌的负荷。
常用的有温度诱导和药物诱导。
本实验采用异丙基硫代-β-D-半乳糖昔（IPTG）诱导外源基因表达。
不同的表达质粒表达方法并不完全相同，因启动子不同，诱导表达要根据具体情况而定。
二、材料1、诱导表达材料( 1 ) LB （Luria—Bertani）)培养基酵母膏(Yeast extract) 5g 蛋白胨(Peptone) 10gNaCl 10g 琼脂(Agar) 1-2%蒸馏水(Distilled water) 1000ml pH 7.0适用范围：大肠杆菌( 2 ) IPTG 贮备液：2 g IPTG溶于10 mL 蒸馏水中，0 . 22 μm 滤膜过滤除菌，分装成1 mL /份，－20 ℃保存。
( 3 ) l×凝胶电泳加样缓冲液：50 mmol / L Tris -CI ( pH 6 . 8 )50 mmol / L DTT2 % SDS （电泳级）0.1 ％溴酚蓝10 ％甘油2、大肠杆菌包涵体的分离与蛋白纯化材料1 ）酶溶法（1）裂解缓冲液：50 mmol / L Tris-CI ( pH 8 . 0 )1 mmol / L EDTA100 mmol / LNaCI（2）50 mmol / L 苯甲基磺酰氟（PMSF ）。
（3）10 mg / mL 溶菌酶。
（4）脱氧胆酸。
（5）1 mg / mL DNase I。
2 ）超声破碎法( 1 ) TE 缓冲液。
( 2 ) 2×SDS -PAGE 凝胶电泳加样缓冲液：100 mmol / L Tris-HCI ( pH 8 . 0 )100 mmol / L DTT4 %SDS0.2 ％溴酚蓝20 ％甘油三、实验方案1、外源基因的诱导表达( 1 ）用适当的限制性内切核酸酶消化载体DNA 和目的基因。
大肠原核表达摘要：1.大肠杆菌原核表达概述2.大肠杆菌原核表达的优点3.大肠杆菌原核表达的应用领域4.大肠杆菌原核表达的局限性5.我国在大肠杆菌原核表达领域的发展正文：1.大肠杆菌原核表达概述大肠杆菌原核表达，是指将目标基因通过重组DNA 技术插入到大肠杆菌的基因组中，使大肠杆菌能够表达出目标蛋白质。
这种方法具有操作简便、成本低廉、表达速度快等优点，因此在生物制药、生物材料、生物能源等领域得到了广泛应用。
2.大肠杆菌原核表达的优点（1）操作简便：大肠杆菌原核表达的操作步骤相对简单，包括基因克隆、转化、筛选等过程，便于实验室进行常规操作。
（2）成本低廉：与真核表达系统相比，大肠杆菌原核表达的成本较低，可以降低药物研发和生产的成本。
（3）表达速度快：大肠杆菌生长速度快，繁殖周期短，可以快速获得大量目标蛋白质。
3.大肠杆菌原核表达的应用领域（1）生物制药：大肠杆菌原核表达广泛应用于生物制药领域，例如通过大肠杆菌表达胰岛素、重组人生长激素等药物。
（2）生物材料：大肠杆菌原核表达可以用于生产生物材料，如通过大肠杆菌表达重组蛋白聚糖、重组胶原蛋白等。
（3）生物能源：大肠杆菌原核表达可以用于生产生物能源，如通过大肠杆菌表达脂肪酶、纤维素酶等酶类，以促进生物质的降解和转化。
4.大肠杆菌原核表达的局限性尽管大肠杆菌原核表达具有许多优点，但仍存在一定的局限性，如表达的蛋白质可能存在生物活性低、稳定性差等问题。
此外，大肠杆菌表达的蛋白质可能受到宿主细胞内源性蛋白酶的降解，从而影响蛋白质的产量和纯度。
5.我国在大肠杆菌原核表达领域的发展我国在大肠杆菌原核表达领域取得了显著的成果。
近年来，我国科学家通过优化表达载体、增强启动子等元件，不断提高大肠杆菌原核表达的效率和质量。
原核表达系统的工作原理原核表达系统是指利用原核生物（如大肠杆菌等）来表达外源蛋白质的工具，在生物技术和基因工程领域应用十分广泛。
原核表达系统通过重组DNA技术将目标基因插入原核细胞的表达载体中，并利用细胞自身的代谢机制，将目标蛋白质大量表达出来。
本文将详细介绍原核表达系统的工作原理。
1. 原核表达系统的基本构成原核表达系统的基本构成包括表达载体和宿主细胞两部分。
表达载体是一种重组DNA分子，通常包括以下基本组成成分：（1）起始位点（起始密码子）：在大肠杆菌中通常为AUG。
（2）表达基因：包括编码目标蛋白质的DNA序列和转录启动子、转录终止子等序列。
（3）选择标记：旨在筛选出带有目标基因的细胞，并提高表达效率。
常用的选择标记有抗生素抵抗基因和荧光标记基因等。
（4）复制起点：能够使表达载体在宿主细胞内进行自我复制，提高表达效率。
宿主细胞则是一种能够实现表达载体遗传信号转录、翻译和合成目标蛋白质的生命体。
2. 原核表达系统的工作流程原核表达系统通过以下几个步骤来实现目标蛋白质的表达：（1）制备表达载体将目标基因插入表达载体中，构建成重组DNA分子。
（2）转化宿主细胞将制备好的表达载体转化（transform）到宿主细胞内。
转化过程中，表达载体通过电击、热激或溶菌酶处理等方法，被宿主细胞吞噬并与其细胞质融合。
（3）表达基因转录和翻译转录因子识别插入表达载体的启动子序列，调节基因在宿主细胞内能够合成被表达的mRNA。
转录后的mRNA与核糖体结合，开始翻译，合成蛋白质。
（4）目标蛋白质的后处理和纯化将宿主细胞内表达的蛋白质从培养基或细胞酶中提取出来。
通常采用离心、过滤或柱层析等方法，对蛋白质进行分离和纯化。
3. 原核表达系统的优缺点原核表达系统在生物技术和基因工程领域应用广泛，主要因为其有以下的优缺点。
（1）优点①高效：能够表达大量的目标蛋白质，通常能够达到10%以上的蛋白质总产量。
②简便：操作简便，不需要昂贵的设备，很容易进行规模化操作。
如下：（我的目的蛋白是
，信心十足往下做，
SDS-PAGE
然目的蛋白也是很少，但是至少
PAGE图如下：
数真的影响表达啊，没有加
，SDS-PAGE
抗，哈哈，老天
是沉淀表达，我是按照分子克隆指南上面的做法，
，沉淀和上清分
很开心，今天时间
上清的目的蛋白会更多一点。
等我
多了，但是杂
未过柱裂解液是菌体裂解后上清的液体（应该算阳性对照吧这个），看出来250mM处蛋白挺多的，这样应该就没有问题了吧，我这个是50ml菌液摇的，5ml裂解上清，上样为10μl，祝大家实验顺利哈。
以后会用lc-ms研究这个蛋白和受体的作用，有什么新的进展我会更新的。
原核生物基因表达调控的特点原核生物指的是没有真核细胞核的生物，包括细菌和古细菌。
在原核生物中，基因表达调控是一种重要的生物学过程，通过调控基因的转录、翻译和后转录调控来控制蛋白质的合成和功能，从而适应环境的变化。
原核生物基因表达调控具有以下特点：1. 调控元件简单：原核生物的基因组相对较小，基因数目较少，调控元件相对简单。
通常，原核生物的基因调控主要依赖于启动子、操作子以及结合蛋白等几个关键的调控元件。
2. 调控网络简化：原核生物的基因调控网络相对简化，通常以正式的反式调控为主。
正式调控是指调控蛋白质与调控元件结合后，促进或抑制基因的转录。
3. 转录和翻译的耦合：在原核生物中，转录和翻译是同时进行的，没有真核生物中的核内转录和胞质翻译的空间分隔。
这种耦合使得原核生物能够更加高效地调控基因表达。
4. 调控速度快：原核生物的基因表达调控速度相对较快。
由于转录和翻译的耦合以及调控元件的简单性，原核生物可以在短时间内快速响应环境的变化，调整基因表达水平。
5. 基因调控的灵活性：原核生物的基因调控具有较高的灵活性。
原核生物通过对调控蛋白质的合成和降解进行调控，可以实现对基因表达的快速调整。
此外，原核生物还可以通过突变、重组和水平基因转移等方式来调整基因表达。
6. 调控机制多样：原核生物的基因表达调控机制多样。
除了上述的正式调控外，原核生物还可以通过DNA甲基化、RNA干扰、RNA 修饰等多种方式对基因进行调控。
在原核生物中，基因表达调控具有重要的生物学意义。
通过调控基因表达，原核生物能够适应不同的环境条件，维持稳定的内部环境，并实现生存和繁殖的目标。
同时，原核生物的基因表达调控机制也为生物学研究提供了重要的模型系统。
通过研究原核生物的基因表达调控，可以深入理解基因调控的基本原理，并为生物技术和医学研究提供理论基础和实验依据。
原核表达系统三大要素的选择及优化(总4页)--本页仅作为文档封面，使用时请直接删除即可----内页可以根据需求调整合适字体及大小--原核表达系统是目前使用最广泛、最完善的重组蛋白表达系统，具有遗传背景清晰、表达周期快、表达量高、成本低等优势，缺点是无法进行蛋白的翻译后修饰，得到具有生物活性蛋白的几率较小。
原核表达系统适用于表达原核来源的蛋白或不需要翻译后修饰的真核来源蛋白。
在原核蛋白表达过程中，需要综合考虑表达菌株、质粒载体、表达条件三大因素，以获得最满意的表达效果。
下面为大家一一介绍这三大因素的选择和优化。
1. 表达菌株菌株的选择往往是大家最容易忽视的，大多数人会选择使用自己实验室有的或用过的表达菌株。
当蛋白表达效果不佳时，大多会在质粒载体或表达条件上找原因，而不会考虑菌株的选择是否合适。
但作为表达宿主，菌株一定会对外源基因表达蛋白产生影响。
图1 大肠杆菌原核表达系统常用的菌株包括大肠杆菌、芽孢杆菌和链霉菌。
其中运用最为广泛的就是大肠杆菌表达系统。
以下为大家列出了一些常用的大肠杆菌表达菌株，可根据不同的需求进行选择。
2. 质粒载体质粒表达载体上的重要元件包括启动子，多克隆位点，终止子，复制子，信号肽，融合标签，筛选标记等。
根据载体上这些元件的特性，有多种质粒可供选择。
图2 大肠杆菌表达质粒pET-22b(+)图谱启动子：根据启动子的强弱考虑，强启动子可以提高蛋白表达量；弱启动子可以降低本底表达、增加可溶表达、表达小量伴侣蛋白等。
根据启动子的作用方式考虑，组成型启动子使宿主不停的表达重组蛋白；诱导型启动子使宿主在特定诱导条件下表达重组蛋白。
终止子：终止子的作用在于保护mRNA在核外不被降解，延长mRNA的寿命，以提高重组蛋白表达量。
对于T7系统来说，由于T7 RNA聚合酶效率非常高，保证一直有充足的mRNA提供翻译，所以终止子对其影响不大，只有一些自身带有起始密码子的外源基因需要终止子。
复制子：复制子决定质粒载体拷贝数，拷贝数越高，重组蛋白表达量就越高。
最近在做原核表达，包涵体。
以前也做过，但经验不多。
从园子里也学到不少。
一点失败的教训以及纯化过程中的体会，贴出来与大家共享，同时希望得到同行们的指正。
1. 首先介绍一下背景。
载体是novagen公司的pET22b，Amp 抗性。
菌株是Invitrogen的BL21 star DE3，是一个蛋白降解酶突变菌株，也就是说是一种优化表达菌株。
2. 第一次失败。
第一次做诱导的时候，重复了很多次，但总是诱导不出来。
PCR、酶切都正确。
但没等测序结果出来就开始做了。
失败了，曾在园子求助。
后来证明是引物错误。
我们实验室合成引物都要先发给purchasing office，然后才由他们与公司交涉。
这个office的老太太把引物弄掉了一个碱基。
教训：在实验过程中，再仔细都是不为过的。
引物来了后管壁上贴有序列，但我忽略了。
3. 第二次失败。
后来重新构建、转化、诱导。
第一次诱导时根本就没带。
见附图（图片质量太差了，下面几个帖会逐渐好转）然后开始闷头找原因。
周一下午5点我就接了DE3菌，由于那天人非常不舒服，去看医生了，等了很久，到第二天中午11点才转接！而且是按1:50转接的！也就是菌在转接之前培养了18 h！Amp产生抗性的机制和其他抗生素的情况是不同的（具体可以翻看分子克隆）。
到菌体生长到足够浓度的时候，培养基的Amp就会慢慢减少。
一旦细菌失去选择压力，就可能造成质粒丢失。
当Amp降到很低，不足以抑制细菌生长时，未携带质粒的菌就会长得比带质粒的快。
所以当培养时间足够长后，培养基中的B－内酰胺酶就会积累到很高的浓度。
转接时（我是1:50转的），高浓度的酶可能破坏新鲜培养基中的Amp（而且我用的浓度是50 ug/ml）。
这样，就造成最后收集的菌中，大部分都是没有带质粒的菌了。
当然还有一个可能的原因就是死亡的菌体分泌一些降解酶，使得表达检测失败。
这两种推测都只是推测，但我觉得第一种情况应该引起我们的重视。
在使用Amp抗性的时候要格外注意。
浅谈原核表达的技巧摘要：原核表达是表达外源基因常用的方法，具有操作简单、快捷，需时较短，表达产量高，适合工业化等优点。
本文作者根据自己的实践经验，总结了原核表达的一些技巧。
关键词：原核表达表达载体限制性内切酶将植物、动物、微生物等的目的基因插入合适载体后导入大肠杆菌用于表达大量蛋白质的方法一般称为原核表达。
这种方法在蛋白纯化、定位及功能分析等方面都有应用。
大肠杆菌用于表达重组蛋白有以下优点：易于生长和控制；易于培养，实验耗费少；可选择多种大肠杆菌菌株及与之匹配的具各种特性的质粒。
原核表达是近年来表达外源蛋白常用的方法，本文根据自己的实践经验，着重谈谈对原核表达中的技巧问题。
一、原核表达一般程序表达前准备-获得目的基因-构建含目的片段的表达载体（测序验证）-转化表达宿主菌-诱导靶蛋白的表达-表达蛋白的分析。
二、原核表达中各操作步骤的关键因素及技巧1.表达前的准备要素：原核表达注重表达前对目的片段、表达载体及表达菌株的分析、选择。
正所谓“磨刀不误砍柴功”，经过细致、周全的分析、准备、设计可带来较为顺当的实验，可免去许多不必要的麻烦。
（1）对表达载体的分析载体的选择：同样的载体，同样的系统，很可能表达这个蛋白表达量起高，但另外一个就是做不出来，所以表达载体的选择非常重要，没有万能的载体。
选择载体通常我们关心质粒上的几个功能组件及所带来的问题：是否为诱导表达型载体，启动子的强弱、多克隆位点、限制性内切酶的位置、终止密码子的有无及位置，融合Tag的有无，筛选报告基因的位置等。
所选载体一定要保持原来的遗传背景（有些载体经过多次交换已变异）。
选择表达载体时，要根据所表达蛋白的最终应用考虑，如果为了方便纯化，可选择融合表达；如果为了获得天然蛋白，可选择非融合表达。
融合表达时在选择外源DNA同载体分子连接反应时，对转录和转译过程中密码结构的阅读不能发生干扰。
翻译的起始位点：要表达目的蛋白，在该基因的5’端必须有一起始位点，现在大部分的表达载体都提供起始位点，起始密码子与核糖体结合位点的距离都已被优化，一般情况下不需要自己再加，实际操作时要留意载体图谱上是否注明有起始密码子和终止密码子，如无，还得根据自己的实际情况加上。
在起始密码子附近的mRNA二级结构：外源基因其始转录后，保持mRNA的有效延伸、终止及稳定存在是外源基因有效表达的关键，尤其是在起始密码子附近的mRNA二级结构可能会抑制翻译的起始或者造成翻译暂停从而产生不完全的蛋白。
如果利用Primer Premier软件分析DNA或RNA结构上有柄（stem）结构，并且结合长度超过8个碱基，这种结构会因为位点专一突变等因素而变得不稳定，影响正常的翻译。
（2）对目的片段的分析基因（或蛋白）的大小：原核表达的成功与否与所要表达的蛋白（或基因）大小有关，一般说来小于5kD或者大于100kD的蛋白都是难以表达的。
蛋白越小，越容易被内源蛋白水解酶所降解。
在这种情况下可以采取串联表达，在每个表达单位（即单体蛋白）间设计蛋白水解或者是化学断裂位点。
如果蛋白较小，那么加入融合标签GST、Trx、MBP或者其它较大的促进融合的蛋白标签就较有可能使蛋白正确折叠，并以融合形式表达。
如果蛋白较大，大于60kD的蛋白建议使用较小的标签（如6×组氨酸标签）。
对于结构研究较清楚的蛋白可以采取截取表达。
当然表达时要根据目的进行截取，如果是要进行抗体制备而截取，那么一定要保证截取的部位抗原性较强。
对于抗原性也可以利用软件分析，比如Vector NIT Suite或者一些在线软件，不过在分析之余也要认识到这是一种资料统计的结论，如果蛋白和免疫动物亲缘关系较远的话还是不妨一试的。
表达序列的GC含量：表达序列中的GC含量超过70％的时候可能会降低蛋白在大肠杆菌中的表达水平。
GC 含量可以利用DNA STAR、VectorNTI Suite等软件进行预测。
亲疏水性：经常做表达的人都发现表达亲水区域时表达量会比较高，如果你要表达一个膜蛋白，它的疏性会增加实验难度。
有许多软件可以对氨基酸的亲疏水性进行分析，比如VectorNIT Suite，除此之外还可以利用在线跨膜区预测软件对跨膜区进行预测。
2.获得目的基因基因工程中，目的基因的制备有直接分离法、构建基因组文库分离法，构建cDNA基因文库分离法、聚合酶链式反应扩增法（PCR）和化学合成法。
原核表达一般都是利用PCR把目的基因克隆扩增出来。
PCR法的关键是设计引物，可以使用两个软件，PrimerPremier或者Oligo来分析。
如果要表达全长，用不着考虑太多，从一头一尾找至少8个匹配序列在加上与载体匹配的序列就行。
注意以下几点：、先查查表达外源片段中含有什么内切酶位点，否则设计重了，酶切后电泳就会老发现有预期外的小片段出现。
根据载体上的酶切位点设计引物，现在许多类似T 载原理的克隆方法也可以应用到原核表达中，如果T载克隆方法要定向，设计引物时很多时候要多加4个碱基。
、在设计酶切位点的5端要加保护碱基，使限制性内切酶能有效识别，不同内切酶所需的保护碱基不同，SalⅠ不需要保护碱基，EcoRⅤ需要1个，NotⅠ需要2个，HindⅢ最好有3个，一般情况下，都设计2个，可参考有关书籍。
、特别注意起始密码子和终止密码子的读码框，不要造成目的片段碱基移码。
如果载体上有起始密码子ATG，可不另加，但是通常ATG后不是紧跟外源片段的，中间还含有载体序列，这种情况一定要保证中间这段序列不会造成你外源序列的移码。
按情况需要，可以加1到2个碱基在引物中使读码框正确。
同理，正常的终止密码子才能保证蛋白的产出。
大部分载体也有终止密码子，如果你对载体的不放心，也可以在引物中设计上终止密码子。
、在PCR 反应体系中，引物的最适浓度为0.1-1.0umol/I。
引物过多会影响PCR的产量。
⑥所设计的一对引物之间的Tm值相差不宜过大，最好能一样。
一般来说，PCR反应的退火温度不超过Tm值上下5℃；⑦一对引物不宜形成发夹结构、互相配对，若配对时最好不要是G-C的结合（可以用软件分析）；⑧3端以G、C结尾为宜；⑨把上游引物设计成有义链，下游设计成反义链，否则没有片段出现。
3.构建重组表达载体将目的片段有效地插入表达载体中是原核表达中较为关键的步骤，一般构建的重组载体有插入重组和置换重组两种类型，优先考虑能产生粘性末端的限制性内切酶，以便高效连接。
作者将构建重组表达载体分为酶切过程和连接过程。
（1）酶切过程：将目的片段和表达质粒用限制性内切酶进行双酶切，酶切产物经琼脂糖电泳后，用试剂盒回收有效片段。
酶切反应体系首先应根据所切底物的大小和浓度计算出限制性内切酶的用量，试剂公司提供的限制性内切酶包装上通常标明总的酶活性单位和容积活性。
对于能被高效切割的DNA样品（起决于特定的识别序列）用酶量少，反之则多。
（2）连接过程：在T4DNA连接酶作用下，载体和片段连接。
连接反映体系中，连接酶的用量越大，反应速度越大，但用量过大，酶液中的甘油会影响连接效果，也会造成浪费，一般20μl体系中用5U足够。
另外，连接酶的最适温度虽为37℃，在此温度中酶的活性最高，但此温度能使粘性末端的氢键结合不稳定，易脱开。
建议在26℃，4h反应可得较好效果。
目的片段和载体的摩尔比例在2：1（或3：1）为好，DNA总量应根据实际浓度控制在一定范围，多了，DNA分子运动慢，反而影响连接效果，假阳性多。
少了，片段和载体在反映体系中难以碰撞连接，以至没有连接的菌落。
20μl体系中，10μl底物即可。
4.转化表达宿主菌将连接产物转化感受态大肠杆菌，根据重组载体的标志（如抗Amp或蓝白斑）作筛选，挑取单菌落，碱裂解法小量抽提质粒，用PCR和双酶切法作初步鉴定后进行测序验证，进一步检测目的基因的插入方向、阅读框架及片段序列是否正确。
测序时可挑选多个菌落进行测定，因为在PCR、连接等过程中，有不确定因素会导致目的片段发生碱基错配甚至移码突变。
将经过测序分析正确的大肠杆菌质粒DNA转化表达宿主菌的感受态细胞。
5.诱导表达原核表达，一般需要诱导表达，诱导表达过程中，把构建好的载体转化到宿主菌中表达，不同的表达载体对应有不同的表达菌株，一些特别设计的菌株更有助于解决一些表达难题。
在此不再多说，请参照有关书籍。
6.表达蛋白的分析、纯化、检测诱导表达成功后，表达蛋白的分析、纯化、检测应该顺当，按一般的实验步骤做没太大的问题。
虽然，在大肠杆菌中表达的蛋白由于缺少高级修饰和糖基化、磷酸化等翻译后加工，常形成包涵体而影响表达蛋白的生物学活性及构象等缺点，但原核表达具有的操作简单、快捷，需时较短，表达产量高，适合工业化等优点，仍是我们合成外源蛋白的首选。
原核表达的全过程有许多不确定因素，所以每完成一步都得检验结果是否正确，当实验遇到困难时如何进行分析，找到问题的症结是我们实验的关键。
原核表达个人秘笈：表达前的分析比什么都重要生物通原核表达技术专辑：表达不同于其它一些实验，比如：提取质粒、PCR、电镜切片，这些人为控制的因素比较多，出问题相对来说也比较好分析。
表达呢，你把质粒克隆好啦，交给细胞，然后有些事情就不全是你要怎样就怎样了。
原核表达在表达当中来说还是比较简单，细菌培养条件简单、生长速度快，需要的仪器和培养基都比较便宜。
当然，它也存在一些缺乏高级修饰、细胞内部还原性过高等缺点。
原核表达从一开始的设计就非常重要，所谓好的开始是成功的一半。
做足准备功夫，可是省去很多将来后悔的事情。
首先，我们要根据是否要求可溶将载体分成两大类，如果希望可以同时尝试多种表达系统，也有许多商业化的系统供选择。
RealTime ready智力大冲浪！答对5题，即获赠美国傲仕优质保温杯！前面已经介绍过许多公司的商业化载体、菌株和多系统表达体系，现在我想先从自己的蛋白分析讲起。
同样的载体、同样的系统，很可能表达这个蛋白表达量奇高，但是另外一个就是做不出来，所以没有万能的载体，只有永恒的分析。
当然如果你的蛋白曾经在原核系统中成功表达出来那是最好的，选择同样的载体表达成功率会高很多。
如果没有也最好尝试找一些曾经表达过和你的蛋白拥有相类似结构的文献。
比如大部分含有哺乳动物src同源的SH2蛋白相互作用域的蛋白都是用pGEX系列载体表达出来的。
根据经验而言，含有较少半胱氨酸和脯氨酸的、平均大小为60kD的单体蛋白较容易表达。
在下面将列出几个影响表达的因素，大家可以在表达前根据这几个因素自己分析一下：1.翻译起始位点现在大部分的表达载体都提供起始位点，所以它已经把起始密码子与核糖体结合位点的距离进行优化了，一般情况下不需要自己再加，不过还是要留意载体图谱上是否注明有起始密码子和终止密码子2.GC含量表达序列中的GC含量超过70％的时候可能会降低蛋白在大肠杆菌中的表达水平。
