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细胞转染技术 PPT

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细胞转染PPT课件

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蛋白转染
Adherent cell lines
3T3 L1 A549 BHK-21 CaSki CHO CV-1 HEK-293
60-80% 80% 30-40% 80-90% 80-90% 50% 45-55%
HeLa HepaRG MCF-7 MLE-15 NIH-3T3 RAW 264.7 Si Ha
• Release
第11页/共73页
技术原理
蛋白转染
PULSin™: cationic amphiphilic-based formulation
第12页/共73页
操作步骤
蛋白转染
For 24-well plate:
细胞融合度：70-80%
1 稀释蛋白：1µg of protein/100µl Hepes 2 加 4 µl PULSin™ 3 孵育 15 min
第3页/共73页
-
-
-
细胞转染难易比较
体外转染
Adherent > Suspension
Problem: Membrane
E.g.:
THP1, Jurkat…
Fast dividing cell > non dividing cell
Problem: Access to the nucleus
E.g.:
k562gapdh788thp1gapdh818sirna转染转染第32页共73页原代细胞的高效沉默24wellplatebrancheddnaassay20406080100120nmsirnaconcentrationsirnagapdhsirnamm20406080100120nmsirnaconcentrationsirnagapdhsirnamm96人原代肝实质细胞人原代纤维原细胞82sirna转染转染第33页共73页interferin优势低浓度sirna甚至pmol级别就能达到高效的基因沉默在反向操作转染中的效率高sirna转染转染第34页共73页sirna转染竞争对手lipofectamine2000invitrogenolgofectamineinvitrogenhiperfectqiagensilentfectbioradlargestsirnatransfectionmarketdangerousoutsiderhiperfectsirna转染转染第35页共73页nterferinvslipofectamine2000interferinlipofectamine2000sirna浓度nmsirna降低成本20100nmsirna40nm血清和抗生素不受血清和抗生素影响不能加入抗生素基因沉默效率90以上操作即用型简单需稀释复杂细胞毒性无细胞毒性细胞毒性大sirnareagentwell24well06pmol13ul1050pmol0515ul价格第36页共73页nterferinvsoligofectamineinterferinoligofectaminesirna浓度nmsirna100nmsirna血清和抗生素不受血清和抗生素影响不能加入抗生素基因沉默效率90以上一般操作即用型简单需稀释复杂细胞毒性无细胞毒性细胞毒性大sirnareagentwell24well06pmol13ul60pmol3ul价格第37页共73页nterferinvshiperfectsilentfectinterferinhiperfectsilentfectsirna浓度nmsirna5nmsirna10nmsirna细胞融合度305050805090基因沉默效率高见表见表见表细胞毒性无细胞毒性细胞毒性较小细胞毒性大sirnareagentwell24well06pmol84ng13ul375ng3ul价格
细胞转染技术 PPT

细胞转染技术 PPT


脂质体介导法（目前应用最广泛）
原理：阳离子脂质体试剂与DNA混合后，形成一 种稳定的脂质双层复合物，DNA被包在脂质体中 间，这种脂质双层复合物可直接加到培养的细胞 中，脂质体粘附到细胞表面并与细胞膜融合， DNA被释放到胞浆中。
【主要应用】:瞬时转染 稳定转染.
【特点】：使用方法简单，可携带大片段DNA， 通用于各种类型的裸露DNA或RNA，能转染 各种类型的细胞，没有免疫原性。虽在体外基 因转染中有很高的效率，但在体内，能被血清 清除，并在肺组织内累积，诱发强烈的抗炎反 应，导致高水平的毒性，很大程度上应用受限 制。
将细胞稀释到1000个细胞/mL ，每孔100μl加 入有培养基的24孔板，将每孔中的G418浓度稀释至0， 100， 200，300， 400，500， 600，700，800， 900， 1000，1100μg/ml等12个级别，选择出在 10~14天内使细胞全部死亡的最低G418浓度来进行 下一步的筛选试验。一般400-800 μg/ml左右。
最常见的载体上带有新霉素抗性基因neo， 所以筛选的时候用G418 。G418是目前获 得稳转最常用的试剂之一。
ห้องสมุดไป่ตู้
G418是一种氨基糖苷类抗生素，其结构与 新霉素，庆大霉素，卡那霉素相似，通过 影响干扰核糖体功能而阻断蛋白质合成， 对原核和真核细胞等产生毒素，包括细菌 ，酵母，植物和哺乳动物细胞，也包括原 生动物和蠕虫。
鉴定之后
一般经过4周左右的筛选，得到的阳性克隆都 比较稳定。但是外源基因如果没有整合到基因组中 的话，目的基因还是很容易丢失的。但是外源基因 整合到基因组中的概率太小了，而且是随机整合， 会导致表达的目的蛋白的量产生很大差异。随着培 养时间的延续，那些丢失了外源基因的细胞和很少 表达目的基因的细胞会占据优势，强表达目的蛋白 的细胞会越来越少。这样再次筛选是必不可少的。 只有经过2次以上的筛选之后才能找到那种我们想 要的遗传稳定的细胞克隆。
1. 细胞转染技术

1. 细胞转染技术


慢病毒载体——介绍
慢病毒（Lentiviruses）属于逆转录病毒科。 慢病毒核蛋白质前整合复合物具有噬核特性，病毒基因组运 输至细胞核，从而使慢病毒可以感染和在非有丝分裂细胞中 复制。这一特性使慢病毒成为基因治疗的转移载体。
HIV（Human immunodeficiency virus） EIAV（Equine infectious anemia virus） FIV（Feline immunodeficiency virus） SIV（Simian immunodeficiency virus） 其中研究最多最为透彻的是HIV。
DOSPA
阳离子脂质体转染
阳离子脂质体转染——原理
1. Formation of Lipoplexes
2. Get into the cell
3. Get into the nuclear
Lipoplexes的形成
Lipoplexes的形成
FIGURE: Electron microscopy of DNA-liposome complexes. (A-E) Complexes prepared from a constant amount of DNA (3.5 μg/mL) and a gradually increasing amount of cationic liposomes. LiposometoLDNA'ratios (in terms of positive to negative charges) are (A) 0.2, (B) 0.4, (C) 0.6, (D) 1.0, and (E) 1.5. Note the aggregated (B-D) versus fused (E) complexes. Scale bar represents 0.5 μm.(1993, Hezi Gershon)
细胞转染

细胞转染


ShineGene Molecular Biotech,Inc. 上海闪晶分子生物科技有限公司 二. 实验材料与器材
1）材料 293T 细胞 MyoD 表达质粒和 EGFP 表达质粒 DMEM 培养基 链霉素/青霉素（双抗） FCS（小牛血清） PBS（磷酸盐缓冲溶液） 胰酶/EDTA 消化液 转染试剂（TransFast） 2）器材 20ul/200ul/1ml 微量移液器和 Tip 头 酒精灯 废液缸 血球计数板 涡旋振荡器 恒温水浴箱 台式离心机 35mm 培养皿 转染管 15ml 离心管 观察用倒置显微镜 荧光显微镜和 CCD
6 。
7） 加入混合液，将细胞放回培养箱中培养一个小时。 8） 到时后，根据细胞种类决定是否移除混合液，之后加入完全培养基继续培养 24－48 小时。 第二次细胞传代 1） 2） 在转染后 24 小时，观察实验结果并记录绿色荧光蛋白表达情况。 再次进行细胞传代，按照免疫染色合适的密度 0.8X10 个细胞/35mm 培养皿将细胞重新粉入 培养皿中。 3） 在正常条件下培养 24 小时后按照染色要求条件固定。
ShineGene Molecular Biotech,Inc. 上海闪晶分子生物科技有限公司
Add: Floor 2,Building A,328#, Wuhe Road,Minhang District,Shanghai,201109,China Tel: +86-21-54460832 Web: Fax:+86-21-54460831 E-mail: master@
ShineGene Molecular Biotech,Inc. 上海闪晶分子生物科技有限公司
(3) 用 Tip 头加入 1ml Trypsin 液，消化 1 分钟（37 C，5%CO2 )。用手轻拍培养瓶壁，观察到细胞 完全从壁上脱落下来为止。 (4) 加入 1ml 的含血清培养基终止反应。 (5) 用 Tip 头多次吹吸，使细胞完全分散开。 (6) 将培养液装入离心管中，1000rpm 离心 5min。 (7) 用培养液重悬细胞，细胞计数后选择 0.8X10 个细胞加入一个 35mm 培养皿。 (8) 将合适体积完全培养液加入离心管中，混匀细胞后轻轻加入培养皿中，使其均匀分布。 (9) 将培养皿转入 CO2 培养箱中培养，第二天转染。 细胞转染 1）转染试剂的准备 A. 将 400ul 去核酸酶水加入管中，震荡 10 秒钟，溶解脂状物。 B.震荡后将试剂放在－20 摄氏度保存，使用前还需震荡， 。 2） 选择合适的混合比例（1：1－1：2/脂质体体积：DNA 质量）来转染细胞。在一个转染管中加入 合适体积的无血清培养基。加入合适质量的 MyoD 或者 EGFP 的 DNA，震荡后在加入合适体积的转染 试剂，再次震荡。 5） 将混合液在室温放置 10—15 分钟。 6) 吸去培养板中的培养基，用 PBS 或者无血清培养基清洗一次。
细胞转染简介PPT教案

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样，电泳图谱不一样。
B. 同一载体连接不同的DNA片断，不同的载
体连接同一片段(片段上也有位点）酶切图谱是
不同的 。
第15页/共40页
C. 插入法(单酶单切点)或替代法 (双酶双位点)酶切，一般来说用 3种限制酶切： ①可鉴定载体及 ②插入片 段的大小,方向,切后并电泳分 析,以确定是否得到预期的olyA尾设计共同引物 → 将所用 mRNA并逆转录成cDNA利用工具酶在cDNA末端加尾 → 采用一对共用引物扩增所有cDNA 计 算 机 克 隆 － 即 利 用 GenBank 信息，利用不同种属同源性设计 引物，尝试获取未知基因片段， 这有赖于各种计算机软件的应用。
➢ (1)基础培养基
➢ (2)胎牛血清
➢ (3)添加剂
第36页/共40页
➢ 5 转染方案
➢ 一般原则：建立一套适当的转
染方案；首先从一种标准方案 开始，然后通过改变试剂/DNA
的配比和复合物的剂量进行优 化。
➢ （1）转染复合物的制备
➢ （2）转染试剂/DNA配比（负
载比）
第37页/共40页
Hale Waihona Puke ➢ （3）转染复合物的加入
➢ 6 时间进度
➢ 一般原则提示：要确保最终结 果的成功；建立一个合适的时 间进度进行转染实验以保证您 所需要的目的蛋白能得到最佳 表达。
➢ （1）转染的开始 ➢ （2）培养基更第3换8页/共40页
➢ （3）时间测定
谢谢指导！
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第21页/共40页
➢ 【主要应用】:瞬时转染 稳定 转染
➢ 【特点】：使用方法简单，可 携带大片段DNA，通用于各种 类型的裸露DNA或RNA，能转 染各种类型的细胞，没有免疫 原性。虽在体外基因转染中有 很高的效率，但第22页在/共40体页 内，能被 血清清除，并在肺组织内累积，
细胞转染技术课件

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细胞转染技术的应用
研究基因功能
基因表达调控
通过转染特定基因，研究其在细胞内的表达调控机制，有助于深入 了解基因的功能和作用。
基因敲除与敲入
利用转染技术将特定基因敲除或敲入细胞中，以探究基因对细胞生 长、分化等过程的影响。
表观遗传学研究
通过转染特定因子或抑制剂，研究表观遗传修饰对基因表达的调控作 用。
与合作。
降低对细胞的毒性
寻找低毒性的转染试剂
研发和选用对细胞毒性更低的转染试剂，减轻对细胞的损伤。
控制转染条件
优化转染条件，如降低转染浓度、减少转染时间等，以减轻对细胞的毒性。
细胞株的选择
选用对转染更具有耐受性的细胞株，降低转染过程中的毒性。
发展新型的转染技术与方法
非病毒载体转染技术
研究和发展非病毒载体转染技术，如纳米材料、基因 编辑技术等，以实现更高效、安全的基因转移。
体内转染技术
探索和发展体内转染技术，提高基因治疗在临床应用 中的效果和安全性。
跨物种转染技术
研究和发展跨物种转染技术，拓宽基因功能研究和基 因治疗的应用范围。
CHAPTER 06
案例分析：某基因的功能研 究
研究背景与目的
某基因在肿瘤发生发展中的重要作用
近年来，研究发现某基因在多种肿瘤中高表达，可能与肿瘤的发生、发展、转移等过程 密切相关。
提高转染效率的方法
预处理细胞
通过药物处理、电穿孔等方式预处理细胞，可以提高细胞膜的通 透性，有利于转染试剂进入细胞。
共转染
同时转染多个基因或质粒，可以提高转染效率和基因表达水平。
筛选稳定转染细胞株
通过药物筛选或克隆选择等方法，筛选出稳定表达目的基因的细胞 株，可以长期保存和应用。
细胞生物学技术课件GFP细胞转染实验讲义

细胞生物学技术课件GFP细胞转染实验讲义

Chemical-based transfection：calcium phosphate ； liposomes Non chemical methods： Electroporation Particle-based methods：gene gun Viral methods：viral transduction Other (and hybrid) methods： nucleofection； heat shock.
这些特殊的结构可以实现目的基因在靶细胞内的稳 定表达
back
载体名称：pEYFP-C1 载体类型：哺乳动物细胞表达载体
载体大小：4.7kb 载体宿主：大肠杆菌，哺乳动物细胞（E.coli, Mammalian cells） 细菌抗性：卡纳（kan） 真核筛选标记：新霉素（Neomycin） 5' 测序引物：EGFP-N Sequencing Primer (#6479-1) 3' 测序引物：EGFP-C Sequencing Primer (#6478-1) 载体描述：encodes an enhanced yellow-green variant of the Aequorea victorioiled plasmid DNA or siRNA constructs), or even proteins such as antibodies, may be transfected.
Transfection of animal cells typically involves opening transient pores or "holes" in the cell membrane, to allow the uptake of material.
细胞转染PPT课件

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稳定转染子的选择
• 成功完成稳定转染需要高效DNA输送和筛选获得DNA的细胞的 方法。
• 筛选稳定表达转染DNA的细胞的最可靠方法之一是在用于转 染的DNA重组体或共转染至细胞的独立载体中加入选择标记 物，然后经过短暂的恢复期后，在细胞中应用适当的选择压 力。当共转染载体上表达选择标记物时，携带目的基因的载 体与携带选择标记物的载体的摩尔比应在5:1至10:1范围内， 以确保包含选择标记物的细胞也含有目的基因。
2019/8/2
尽管转染效率因细胞类型的不同而异，在104个转染 细胞中只有大约一个细胞可以稳定整合DNA (不论使用 的是线性还是环状DNA)。
没有一种方法可以适用于所有细胞和所有实验。必须 根据您的细胞类型和实验要求选择理想的方法，必须具 有高转染效率、低血细胞毒性、对正常生理学的影响最 小，且使用简单、可重复。
3、物理方法：将核酸直接导入细胞质或细胞核内。 显微注射、激光介导的转染
阳离子脂质体介导的输送
• 特殊设计的阳离子脂质体(如LipofectamineR转染试剂)可促进 DNA和siRNA进入细胞。基本结构包括带正电荷的头基和一个或 两个碳氢链。
• 采用阳离子脂质体试剂时，带负电荷的DNA与带正电荷的脂质 体自发结合，形成DNA-阳离子脂质体试剂复合物。一般认为， 转染复合物通过内吞作用进入细胞。
• 低毒性：病毒载体应尽量不对其感染的细胞的生理学造 成影响。
• 稳定性：一些病毒具有遗传不稳定性，会迅速重排基因 组。这会对使用病毒载体的操作的可预测性和可重复性产 生不利影响。
• 选择性：病毒载体应包含选择标记物，如特定的抗生素抗 性，从而可以分离出摄取了病毒载体的细胞。
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人的微孔。电穿孔技术可用于瞬时转染和稳定转染，可方便 地用于悬浮细胞，重现性好，但需要较多的细胞。影响转染 效率的主要因素是脉冲强度和持续时间。必须找到能够使核 酸有效释放而又不杀死细胞的最佳平衡点。
(2）显微注射法 该法虽然费力，但却是非常有效的将核酸导入细
胞或细胞核的方法。这种方法常用来制备转基因动物， 但不适用于需要大量转染细胞的研究。 （3）基因枪法
最常见的载体上带有新霉素抗性基因neo， 所以筛选的时候用G418 பைடு நூலகம்G418是目前获 得稳转最常用的试剂之一。
G418是一种氨基糖苷类抗生素，其结构与 新霉素，庆大霉素，卡那霉素相似，通过 影响干扰核糖体功能而阻断蛋白质合成， 对原核和真核细胞等产生毒素，包括细菌 ，酵母，植物和哺乳动物细胞，也包括原 生动物和蠕虫。
当neo基因被整合进真核细胞基因组合适的 地方后，则能启动neo基因编码的序列转录 为mRNA，使细胞获得抗性而能在含有 G418的选择性培养基中生长。目前G418 的这一特性已在基因转移，敲除，抗性筛 选以及转基因动物等方面得以广泛应用。
筛选之前
由于每种细胞对G418的敏感性不同，而且不同的 厂家生产的相同浓度的G418的活性不尽相同，所以在 筛选之前，一定要确定G418的最佳筛选浓度。具体如 下：
加药时间
由于基因转染到细胞内之后要一段时间才能表达出 蛋白质。所以筛选不能太早；但是也不能太晚，因为转 染了外源基因的细胞代谢负荷较大，增殖较慢，时间长 了就会被没有外源基因转入的细胞所淹没，最终导致筛 选不出阳性克隆，一般要在转染24小时之后才开始加 G418筛选。随着细胞的代谢G418的浓度和活性都会下 降，所以每2~3天都要更换一次含有G418的筛选液。
将细胞稀释到1000个细胞/mL ，每孔100μl加 入有培养基的24孔板，将每孔中的G418浓度稀释至0， 100， 200，300， 400，500， 600，700，800， 900， 1000，1100μg/ml等12个级别，选择出在 10~14天内使细胞全部死亡的最低G418浓度来进行 下一步的筛选试验。一般400-800 μg/ml左右。
细胞转染技术 PPT
一 ：转染的简介 二 ：转染的分类 三： 转染的方法
一 、 转染的简介
1.基因转染:将具生物功能的核酸转移或运送到 细胞内并使核酸在细胞内维持其生物功能。
转染的DNA：cDNA,基因组DNA，有目的基因的质 粒DNA。
2.基因转染技术已广泛应用于基因组功能研究和
基因治疗研究。
标有neo（实际上应该是neo resistance）的载体，指载有降解新霉 素的基因，新霉素作用于原核和真核细 胞，对两者都有杀伤作用。用于转染后 ，稳定表达外源基因细胞的阳性筛选。
标有amp（实际上应该是amp resistance ）的载体，指载有降解氨苄青霉素的基因 （β－内酰胺酶），作用于原核细胞，只对 敏感菌有作用。用于克隆菌的筛选。
利用脂质体转染法最重要的就是防止其毒 性，因此脂质体与质粒的比例，细胞密度以及 转染的时间长短和培养基中血清的含量都是影 响转染效率的重要问题，通过实验摸索的合适 转染条件对于效率的提高有巨大的作用。
物理方法(电穿孔、显微注射及基因枪)
（1）电穿孔法 利用高压电脉冲对细胞膜的干扰，使其形成利于核酸进
该法依靠携带了核酸的高速粒子而将核酸导入细 胞内，这种方法适用于培养的细胞和在体的细胞。
实验室用到的转染方法
脂质体介导法
脂质体转染法的步骤：
细胞转染以Lipofectamine 2000转染试剂为例： 转染前一天，将细胞铺到6孔培养板中， 加入有血清无双抗的培养基（2ml）； 24小时换上无血清无双抗的培养基2ml； 将2μg的质粒用375μL无血清无双抗的培养基稀释； 取12 μL的Lipofectamine 2000加入375 μL无血清无
双抗的培养基稀释； 将质粒和Lipofectamine 2000稀释液混合在一起，室
温放置15-45min后加入培养皿中，再加入750 μL无血 清无双抗培养基混匀；（注：为一孔的试剂配制量） 4-6h后换上完全培养基48h培养观察； 注：24h看一次，如果培养基变颜色换培养基；
转染后筛选
筛选所选用的抗生素跟转染所用的质粒 上所带的真核筛选抗性基因有关的 。
脂质体介导法（目前应用最广泛）
原理：阳离子脂质体试剂与DNA混合后，形成一 种稳定的脂质双层复合物，DNA被包在脂质体中 间，这种脂质双层复合物可直接加到培养的细胞 中，脂质体粘附到细胞表面并与细胞膜融合， DNA被释放到胞浆中。
【主要应用】:瞬时转染 稳定转染.
【特点】：使用方法简单，可携带大片段DNA， 通用于各种类型的裸露DNA或RNA，能转染 各种类型的细胞，没有免疫原性。虽在体外基 因转染中有很高的效率，但在体内，能被血清 清除，并在肺组织内累积，诱发强烈的抗炎反 应，导致高水平的毒性，很大程度上应用受限 制。
鉴定之后
一般经过4周左右的筛选，得到的阳性克隆都 比较稳定。但是外源基因如果没有整合到基因组中 的话，目的基因还是很容易丢失的。但是外源基因 整合到基因组中的概率太小了，而且是随机整合， 会导致表达的目的蛋白的量产生很大差异。随着培 养时间的延续，那些丢失了外源基因的细胞和很少 表达目的基因的细胞会占据优势，强表达目的蛋白 的细胞会越来越少。这样再次筛选是必不可少的。 只有经过2次以上的筛选之后才能找到那种我们想 要的遗传稳定的细胞克隆。
不表达 表达； 表达
不表达
二 、转染的分类
基因转染真核细胞的方法
转染方 法
化学 转染法
物理 转染法
病毒 感染法
DEAE一 葡聚糖法
磷酸钙法
人工 脂质体法
显微 注射法
电穿孔法 基因枪法 逆转录病毒
腺病毒
DEAE-葡聚糖法
是最早应用哺乳动物细胞转染的试剂之一。 DEAE-葡聚糖是阳离子多聚体,它与带负电的核 酸结合后接近细胞膜而被摄取。DEAE一葡聚糖 转染已成功地应用于瞬时转染，但用于稳定转 染却不可靠。
大家学习辛苦了，还是要坚持
继续保持安静
磷酸钙共沉淀转染法
由于试剂易得、价格便宜而被广泛用于瞬 时转染和稳定转染的研究。原理是，先将外源 性DNA和氯化钙混合，然后加入到含磷酸离子 的缓冲液，在特定PH下（通常PH7.1），慢慢 形成DNA-磷酸钙沉淀，后把含有沉淀的混悬液 加到培养的细胞中，培养一段时间后，通过胞 膜的内吞作用摄入DNA。