细胞转染技术ppt课件

常规转染技术可分为两大类，一类是瞬时转染，一类是稳定转染（永久转染）。

前者外源DNA/RNA 不整合到宿主染色体中，因此一个宿主细胞中可存在多个拷贝数，产生高水平的表达，但通常只持续几天，多用于启动子和其它调控元件的分析。

一般来说，超螺旋质粒DNA 转染效率较高，在转染后24-72小时内（依赖于各种不同的构建）分析结果，常常用到一些报告系统如荧光蛋白，β半乳糖苷酶等来帮助检测。

后者也称稳定转染，外源DNA 既可以整合到宿主染色体中，也可能作为一种游离体（episome ）存在。

尽管线性DNA 比超螺旋DNA 转入量低但整合率高。

外源DNA 整合到染色体中概率很小，大约1/104转染细胞能整合，通常需要通过一些选择性标记，如来氨丙基转移酶（APH ；新霉素抗性基因），潮霉素B 磷酸转移酶（HPH ），胸苷激酶（TK ）等反复筛选，得到稳定转染的同源细胞系。

转染技术的选择对转染结果影响也很大，许多转染方法需要优化DNA 与转染试剂比例，细胞数量，培养及检测时间等。

一些传统的转染技术，如DEAE 右旋糖苷法，磷酸钙法，电穿孔法，脂质体法各有利弊，其主要原理及应用特点见下表： 转染方法 原理 应用特点磷酸钙法 磷酸钙DNA 复合物吸附细胞膜被细胞内吞 稳定转染 瞬时性转染 不适用于原代细胞 操作简便但重复性差 有些细胞不适用DEAE-右旋糖苷法 带正电的DEAE-右旋糖苷与核酸带负电的磷酸骨架相互作用形成的复合物被细胞内吞瞬时性转染 相对简便、结果可重复 但对细胞有一定的毒副作用 转染时需除血清 电穿孔法 高脉冲电压破坏细胞膜电位，DNA 通过膜上形成的小孔导入 稳定转染 瞬时性转染 所有细胞 适用性广但细胞致死率高，DNA 和细胞用量大， 需根据不同细胞类型优化电穿孔实验条件病毒介导法 通过侵染宿主细胞将外源基因整合到染色体中 稳定转染 可用于难转染的细胞、原代细胞，体内细胞等逆转录病毒 特定宿主细胞 但携带基因不能太大细胞需处分裂期 需考虑安全因素腺病毒 通过侵染宿主细胞将外源基因整合到染色体中 瞬时转染 特定宿主细胞可用于难转染的细胞 需考虑安全因素 阳离子脂质体法 带正电的脂质体与核酸带负电的磷酸基团形成复合物被细胞内吞 稳定转染 瞬时性转染 所有细胞 适用性广，转染效率高，重复性好，但转染时需除血清。

转染的原理转染是生物学实验中常用的一种技术，它是指将外源DNA或RNA引入到细胞内的过程。

转染技术在基因工程、细胞生物学和药物研发等领域有着广泛的应用。

本文将从转染的原理入手，介绍转染技术的基本概念、原理和常见方法。

转染的基本概念。

转染是指将外源核酸（DNA或RNA）引入到细胞内，并使其稳定地表达或转录的过程。

通过转染技术，可以实现对细胞内基因的敲除、过表达或靶向修饰，从而研究基因功能、调控细胞信号通路、开发新药物等。

转染的原理。

转染的原理主要包括细胞膜通透性增加、核酸与细胞膜的相互作用、内吞作用和核酸的释放等过程。

在转染过程中，外源核酸首先需要穿过细胞膜，进入到细胞内部。

然后，外源核酸需要与细胞内的生物分子发生相互作用，从而实现其稳定的表达或转录。

最后，外源核酸需要在细胞内定位到特定的细胞器或亚细胞结构，发挥其功能。

常见的转染方法。

目前，常见的转染方法包括化学法、生物物理法和病毒载体法等。

化学法是指利用化学试剂（如聚乙烯亚胺、脂质体等）改变细胞膜的通透性，使外源核酸能够进入到细胞内。

生物物理法是指利用物理手段（如电穿孔、微注射等）将外源核酸导入到细胞内。

病毒载体法是指利用病毒载体将外源核酸传递到细胞内，并实现其表达或转录。

转染技术的应用。

转染技术在基因工程、细胞生物学和药物研发等领域有着广泛的应用。

在基因工程领域，转染技术被用于敲除或过表达特定基因，从而研究基因功能和调控信号通路。

在细胞生物学领域，转染技术被用于标记细胞器、跟踪蛋白质定位和研究细胞信号转导等。

在药物研发领域，转染技术被用于筛选潜在的药物靶点、评估药物毒性和研究药物的作用机制等。

结语。

总之，转染技术是一种重要的生物学实验技术，它在基因工程、细胞生物学和药物研发等领域有着广泛的应用。

通过对转染的原理和常见方法的了解，可以更好地应用转染技术进行科研工作，推动生命科学领域的发展和进步。

细胞转染是一种常用的生物技术，用于将外源基因或药物引入细胞中。

下面是细胞转染的实验原理、所需试剂和耗材、实验仪器、准备工作、实验方法、注意事项、常见问题及解决方法。

一、实验原理细胞转染是利用细胞膜的通透性，将带有特定基因或药物的载体分子导入细胞内。

常用的载体分子包括病毒载体和非病毒载体。

病毒载体如腺病毒、逆转录病毒等，能将外源基因高效地导入细胞中，但可能对细胞产生一定毒性。

非病毒载体如脂质体、阳离子聚合物等，相对安全，但导入效率较低。

通过细胞转染，可以实现对基因的表达调控，探索基因功能和药物筛选等研究。

二、所需试剂和耗材1.试剂：o培养基：如DMEM、F12等，用于细胞培养。

o血清：如胎牛血清，提供细胞生长所需的营养物质。

o抗生素：如青霉素、链霉素等，用于防止细胞污染。

o转染试剂：如Lipofectamine、Effectene等，用于细胞转染。

o DNA或RNA：携带目的基因的质粒或寡核苷酸。

2.耗材：o细胞培养瓶、板：用于细胞培养。

o离心管：用于细胞转染后洗涤和离心。

o移液器及枪头：用于精确加样。

o过滤器：用于过滤溶液中的杂质。

o无菌水：用于稀释和配制溶液。

三、实验仪器1.实验室搅拌器：用于混合溶液。

2.高速冷冻离心机：用于离心和分离细胞。

3.水浴锅：用于加热溶液。

4.无菌工作台或超净工作台：用于进行无菌操作。

5.分光光度计：用于测量细胞生长状况和转染效率。

6.荧光显微镜：用于观察细胞转染后荧光蛋白的表达情况。

7.CO2培养箱：提供细胞培养所需的气体环境。

四、准备工作1.仔细阅读实验步骤和注意事项，了解所需的试剂和耗材及其使用方法。

2.准备好所需的试剂和耗材，并确保它们处于保质期内。

3.检查实验室内是否具备上述实验仪器，并确保其正常运行。

4.用70%乙醇擦拭实验台面，以确保无菌环境。

5.用高压蒸汽灭菌法灭菌所有的实验器具，包括离心管、移液器等，需在适当的压力和温度下进行灭菌处理，以消除所有潜在的污染源。

细胞转染细胞转染转染，是将外源性基因导入细胞内的一种专门技术。

随着基因与蛋白功能研究的深入，转染目前已成为实验室工作中经常涉及的基本方法。

转染大致可分为物理介导、化学介导和生物介导三类途径。

电穿孔法、显微注射和基因枪属于通过物理方法将基因导入细胞的范例；化学介导方法很多，如经典的磷酸钙共沉淀法、脂质体转染方法、和多种阳离子物质介导的技术；生物介导方法，有较为原始的原生质体转染，和现在比较多见的各种病毒介导的转染技术。

理想的细胞转染方法，应该具有转染效率高、细胞毒性小等优点。

病毒介导的转染技术，是目前转染效率最高的方法，同时具有细胞毒性很低的优势。

但是，病毒转染方法的准备程序复杂，常常对细胞类型有很强的选择性，在一般实验室中很难普及。

其它物理和化学介导的转染方法，则各有其特点。

需要指出的一点是，无论采用哪种转染技术，要获得最优的转染结果，可能都需要对转染条件进行优化。

影响转染效率的因素很多，从细胞类型、细胞培养条件和细胞生长状态，到转染方法的操作细节，都需要考虑。

常用转染方法一、脂质体转染法阳离子脂质体表面带正电荷，能与核酸的磷酸根通过静电作用，将DNA分子包裹入内，形成DNA-脂质体复合物，也能被表面带负电的细胞膜吸附，再通过融合或细胞内吞进入细胞。

脂质体转染适用于把DNA转染入悬浮或贴壁培养细胞中，是目前实验室最方便的转染方法之一，其转染率较高，优于磷酸钙法。

由于脂质体对细胞有一定的毒性，所以转染时间一般不超过24小时。

二、电穿孔转染法电流能够可逆地击穿细胞膜形成瞬时的水通路或膜上小孔促使DNA分子进入胞内，这种方法就是电穿孔转染法。

当遇到某些脂质体转染效率很低或儿乎无法转入时建议使用电穿孔法转染。

一般情况下，高电场强度会杀死50%-70% 的细胞。

现在针对电穿孔转染会引起大量细胞死亡而开发出了一种电转保护剂，可以大大的降低细胞的死亡率，同时提高电穿孔转染效率。

三、病毒感染对于脂质体转染与电穿孔转染都无法成功转染的细胞系建议用病毒感染，此法可以快速100%感染，检测成功率高。

细胞转染实验1．实验目的学习和掌握外源基因导入真核细胞的主要方法—脂质体介导的转染。

了解外源基因进入的一般性方法，观测外源蛋白的表达（绿色荧光蛋白），为染色准备实验材料。

2．实验原理Transfect上图所示是脂质体介导转染的示意图，它显示了外源质粒进入细胞的一般过程。

外源基因进入细胞主要有四种方法：电击法、磷酸钙法和脂质体介导法和病毒介导法。

电击法是在细胞上短时间暂时性的穿孔让外源质粒进入；磷酸钙法和脂质体法是利用不同的载体物质携带质粒通过直接穿膜或者膜融合的方法使得外源基因进入细胞；病毒法是利用包装了外源基因的病毒感染细胞的方法使得其进入细胞。

但是由于电击法和磷酸钙法的实验条件控制较严、难度较大；病毒法的前期准备较复杂、而且可能对于细胞有较大影响；所以现在对于很多普通细胞系，一般的瞬时转染方法多采用脂质体法。

利用脂质体转染法最重要的就是防止其毒性，因此脂质体与质粒的比例，细胞密度以及转染的时间长短和培养基中血清的含量都是影响转染效率的重要问题，通过实验摸索的合适转染条件对于效率的提高有巨大的作用。

上图是本次实验采用的脂质体中阳离子组分的结构的示意图。

本次实验采用的脂质体是promega公司的TransFast脂质体试剂，它是一种阳离子脂质体和中性脂质体的混合物，是对于本次实验中采用的293T细胞优化的转染试剂。

3. 实验材料与器材1）材料293T细胞MyoD表达质粒和EGFP表达质粒DMEM培养基链霉素/青霉素（双抗）FCS（小牛血清）PBS（磷酸盐缓冲溶液）胰酶/EDTA消化液转染试剂（TransFast）2）器材20ul/200ul/1ml微量移液器和Tip头酒精灯废液缸血球计数板涡旋振荡器恒温水浴箱台式离心机35mm培养皿转染管15ml离心管观察用倒置显微镜荧光显微镜和CCD4. 实验步骤细胞传代(1) 试验准备：200ul/1mlTip头各一盒（以上物品均需高压灭菌），酒精棉球，废液缸，试管架，微量移液器，记号笔，培养皿，离心管。