新城疫抗体测定的规范操作

鸡新城疫抗体（NDV-Ab）酶联免疫分析（ELISA）试剂盒使用说明书本试剂仅供研究使用目的：本试剂盒用于测定鸡血清，血浆及相关液体样本中新城疫抗体（NDV-Ab）的含量。

实验原理：本试剂盒应用双抗原夹心法测定标本中鸡新城疫抗体（NDV-Ab）水平。

用纯化的抗原包被微孔板，制成固相抗原，往包被单抗的微孔中依次加入新城疫抗体（NDV-Ab），再与HRP标记的抗原结合，形成抗原-抗体-酶标抗原复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。

TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。

颜色的深浅和样品中的新城疫抗体（NDV-Ab）呈正相关。

用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中鸡新城疫抗体（NDV-Ab）浓度。

试剂盒组成：试剂盒组成48孔配置96孔配置保存说明书1份1份封板膜2片（48）2片（96）密封袋1个1个酶标包被板1×481×962-8℃保存标准品：1800ng/L0.5ml×1瓶0.5ml×1瓶2-8℃保存标准品稀释液 1.5ml×1瓶 1.5ml×1瓶2-8℃保存酶标试剂3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存样品稀释液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存显色剂A液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存显色剂B液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存终止液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存20倍浓缩洗涤液20ml×1瓶30ml×1瓶2-8℃保存样本处理及要求：1.血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。

仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。

2.血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。

新城疫抗体水平检测文稿归稿存档编号：[KKUY-KKIO69-OTM243-OLUI129-G00I-FDQS58-新城疫的血凝和血凝抑制试验高若开 一、实验目的1.掌握血凝和血凝抑制试验的基本原理、操作方法和结果判定方法。

2.分析血凝和血凝抑制试验的影响因素，用以确定最佳免疫时间、判定免疫效果和辅助疾病诊断。

二、实验内容1.血凝试验(HA)检测新城疫抗原2.血凝抑制试验(HI)检测新城疫抗体 三、实验原理1.血凝试验（HA ）原理：某些病毒或病毒的血凝素能选择性地使某种动物的红细胞发生凝集，这种凝集红细胞的现象称为血凝（HA ）,也称直接血凝反应。

2.血凝抑制试验（HI ）原理：当在病毒的悬液中加入特异性抗体，且这种抗体的量足以抑制病毒颗粒或其血凝素时，则红细胞表面的受体就不能与病毒颗粒或血凝素直接接触。

这时红细胞的凝集现象就被抑制，称为红细胞凝集抑制（HI ）反应，也称血凝抑制反应。

病毒颗粒红细胞四、实验材料离心机、恒温箱、冰箱、振荡器、96孔血凝版（5块）、微量移液器（20-100微升可调）、吸液尖（若干）、洗耳球、离心试管、普通试管、试管刷、烧杯、吸量管、一次性注射器、ND 标准抗原、1%红细胞悬液、抗凝剂、生理盐水。

五、实验步骤 （一）抗凝剂的配制将1克柠檬酸钠用25毫升生理盐水稀释备用。

1毫升抗凝剂可用于采集9毫升血液。

（二）10%红细胞悬液的配制1、用注射器吸取0.5毫升抗凝剂无免疫健康青年公鸡的红细胞4.5毫升。

2、1500转离心5分钟，吸弃上清液。

3、用5-10倍生理盐水1500转洗涤3次，前两次5分钟，后一次10分钟。

4、吸弃上清液，用吸量管吸取红细胞，配制成10%红细胞悬液。

5、2-6摄氏度储存，备用。

（三）血凝试验（HA)1.在血凝板上第一排的1－12孔内各加入50ul 生理盐水抗体抗原2.将系苗用生理盐水5毫升稀释，在第1孔内加入50ul病毒抗原，然后依次倍比稀释至第11孔，最后弃50ul。

鸡新城疫抗体检测步骤，鸡新城疫的症状表现1、将样本做去皮和去脂处理，并用均质器均质样本，然后称取适量的均质物至离心管内。

2、依次加入蒸馏水、试剂A、衍生化试剂，振荡混匀后孵育半小时。

3、依次加入试剂B、试剂C、提取剂，并振荡混匀。

4、离心5分钟，取上层有机相至离心管内，再用氮气吹干。

5、用净化剂溶解干燥物，加入试剂D，离心2分钟后待检。

一、鸡新城疫抗体检测步骤1、将鱼虾蟹、畜禽肉、内脏等样本做去皮、去脂肪等处理，再用均质器均质样本，然后称取3±0.05克均质物至15毫升的离心管内。

2、依次加入4毫升蒸馏水、0.5毫升试剂A以及0.6毫升衍生化试剂，并振荡混匀，于65°C水浴中孵育半小时。

3、依次加入1毫升试剂B、0.4毫升试剂C、1瓶4毫升的提取剂，然后振荡混匀。

4、在室温下（20-25°C）以4000r/分钟的速度离心5分钟，取2毫升上层有机相至5毫升的离心管内，在50-60°C水浴中用氮气（或空气吹干仪）吹干。

5、取1毫升净化剂溶解干燥物，再加入0.5毫升试剂D振荡混匀，在室温下（20-25°C）以4000r/分钟的速度离心2分钟，最后待检。

6、若使用全血标本进行检测，标本的移动速度可能较慢，必要时可在加样1分钟后，向加样孔内滴入1滴PBS作辅助液，以促进标本移动。

二、鸡新城疫的症状表现1、急性型（1）病鸡呼吸困难，会发出“咕噜”的特殊怪声。

（2）病鸡的嘴、鼻中有大量黏液，产蛋量下降。

（3）病鸡出现下痢，其粪便的颜色为黄白色或绿色，有麻痹和神经症状。

2、最急性型此类症状大多出现在3-4周龄的小鸡身上，发病时通常不会表现出任何症状，但病发后小鸡会快速死亡。

3、亚急性或慢性型病鸡出现跛行、麻痹、痉挛、运动失调、肌肉抽搐等症状，产蛋鸡发病后期产量会有所降低，一般会发生于成年鸡身上。

4、非典型性新城疫病鸡出现咳嗽、呼吸困难的现象，且伴有分泌物、神经症状，若蛋鸡和种鸡发病，则产蛋量一般会急速降低。

新城疫的抗体检测某些病毒具有凝集某种（些）动物红细胞的能力，称为病毒的血凝，利用这种特性设计的实验称血球凝集试验，以此来推断被检材料中有无病毒存在，是非特异性的，但病毒的血凝可为相应的抗体所抑制，即血球凝集抑制实验（HI），通过血凝与血凝抑制试验，可用已知血清来鉴定未知病毒，也可用已知病毒来检查被检血清中的相应抗体和滴定抗体的含量。

一目的意义1免疫监测（1）免疫效果评价（2）免疫时机确定2诊断疾病（根据有无抗体或抗体的高低）3流行病学调查二试验仪器与试剂1试验仪器离心机、离心管两支、50ml量筒一个、V型微量反应板、微量加样器（移液器）、塑料吸头（黄色）若干、1ml吸管1支、胶头滴管两支、微量振荡器、电热恒温培养箱、托盘天平。

2试验试剂鸡新城疫抗原、流感H5、H9抗原、1%鸡红细胞、生理盐水、3.8%柠檬酸钠抗凝剂、待检血清。

三方法1病毒的血凝试验1.1 3.8%柠檬酸钠抗凝剂的配制：用托盘天平称取柠檬酸钠3.8克溶于100ml蒸馏水或纯净水中，摇匀使其充分溶解即可，有条件的可121℃高压蒸汽灭菌20分钟，冷却至室温后置4℃冰箱中保存备用。

1.2 1%鸡红细胞制备过程：事先用5ml（或10ml）的注射器吸入抗凝剂若干（其量为所需血量的1/5）,从健康公鸡（未经新城疫疫苗注射）的心脏或翅下静脉采取2-4毫升血液,以2000转每分钟，离心5分钟，吸去上清液（注意要将血细胞泥表面的一种薄膜吸净）。

然后用生理盐水（用量为血细胞泥的5-10倍）洗红细胞，离心5分钟，弃去上清液，如此反复洗3-5次，直至上清液透明清亮为止，最后一次要用生理盐水将血细胞泥稀释成1%浓度，然后置4℃冰箱备用（一般可保存3天）。

1.3 红细胞凝集试验（血凝试验）操作方法（见表1）：（1）取一块洁净的96孔V型微量血凝反应板，用微量移液器从第一列第一孔开始依次加入生理盐水，每孔25微升，直至加到第十五孔（第一列12孔，第二列3孔）。

鸡新城疫血凝（HA）和血凝抑制（HI）抗体水平测定法1．本次实验的目的和要求掌握鸡新城疫血凝（HA）和血凝抑制（HI）抗体水平测定法，以便检查疫苗使用效果和制定合理免疫程序。

2．实验内容或原理某些病毒(如新城疫病毒，禽流感病毒等)能够与动物的红细胞发生凝集，此即为红细胞凝集现象(HA)。

这种红细胞凝集现象可于病毒悬液中加入特异免疫血清所抑制，即为红细胞凝集抑制试验(HI)。

3．需用的仪器或试剂等动物健康成鸡2-5只，被检鸡15-25只。

器材高压灭菌器、滤纸、试管、试管架、离心机、离心管、三棱针、内径2mm聚乙烯塑料管100cm、酒精灯、石蜡、96孔V型微量凝集试验板、0.025mm微量吸液器、微型振荡器、微量移液器、脱脂棉等。

药剂（1）浓缩抗原；（2）生理盐水或磷酸缓冲盐水（PBS）；（3）Alsever细胞保存液；（4）红细胞悬液；（5）待检血清4．实验步骤(1)发现与鉴定病毒：鸡新城疫和禽流感病毒分离后，这些病毒能凝集鸡的红细胞，又能被特异性的已知免疫血清抑制其凝集反应，即可鉴定此病毒。

(2)诊断病毒性疾病：如取同一发病的动物早期和恢复期血清进行红细胞凝集抑制实验，如抗体效价有4倍以上升高，即有诊断意义。

（3）免疫机体抗体效价的测定：3.鸡新城疫（ND）的HA和HI（1）试验准备①抗原：一般以鸡新城疫Ⅱ系或LaUra系冻干苗作为已知抗原，进行试验。

②0.7％细胞悬浮液：由鸡翅静脉或心脏采血，放入含有抗凝剂的灭菌试管(按每毫升血加入3.8％灭菌柠檬酸钠0.2毫升做抗凝剂)内，迅速混匀。

如当时不用，可直接采血放入红细胞保存液内(保存液2份，血液1份)于4℃冰箱内可保存两周。

红细胞悬液的配制：将血液注入离心管中，经3000转／分钟，离心5-10分钟，用吸管吸去上清液和红细胞上层的白细胞薄膜，将沉淀的红细胞加稀释液(生理盐水)洗涤。

再用离心机3000转／分钟离心5-10分钟，弃上清，再加稀释液洗涤，如此反复洗涤三次，将最后一次离心后的红细胞泥，按0.7％的稀释度加入稀释液(0.7毫升红细胞泥加99.3毫升稀释液)。

新城疫血凝试验操作方法新城疫血凝试验是一种常用的实验方法，用于检测禽新城疫病毒在禽类血清中的抗原抗体反应。

以下是新城疫血凝试验的操作方法，详细描述每一步骤：1. 材料准备：- 禽类血清：收集禽类的血样，将其离心分离血清，并将其保存在零下20摄氏度的冰箱中备用。

- 新城疫病毒液：购买或自行制备新城疫病毒，将其制备成1：128滴度的新城疫病毒液。

- 血凝片：将干净的玻片剪成适当大小的片状，准备足够数量的血凝片。

- 吸管、滴管、离心管、冰箱、恒温箱等实验器材。

2. 血清试管反应：- 取出血清样本：将保存在冰箱中的禽类血清取出，解冻在室温下。

- 样本稀释：用吸管或滴管将血清样本稀释，一般使用1:10、1:20、1:40、1:80等倍数的稀释比例。

- 血清样本投放：用吸管或滴管将稀释好的血清样本分别滴在血凝片上，每滴20-30微升。

- 血凝片孵育：将血凝片放在恒温箱中，一般在37摄氏度下孵育2小时，以供病毒与抗体结合，形成血凝线。

3. 补体添加与孵育：- 添加补体：血凝片孵育2小时后，将其冷藏，并将血凝片上的稀释好的新城疫病毒液均匀地滴在每一孔中，每孔滴1滴，滴液与血清充分混合。

- 孵育：将滴有血清和新城疫病毒液的血凝片放入恒温箱中，继续孵育12-24小时，以待反应产生。

4. 反应结果的观察与判断：- 结果观察：观察血凝片上是否形成血凝线，血凝线清晰可见，形状均匀、连续。

- 结果判断：根据血凝线的形成情况进行反应结果的判断。

如果出现血凝线，则说明该禽类血清中存在对新城疫病毒的抗体，可判断为阳性；如果没有血凝线出现，则说明该禽类血清中不存在对新城疫病毒的抗体，可判断为阴性。

5. 结果记录与分析：- 结果记录：记录每一个滴管孔的结果，标注每个孔的血凝线情况，包括阳性或阴性反应。

- 结果分析：根据阳性和阴性的反应情况，分析该批次禽类血清样本中是否存在对新城疫病毒的抗体，以评估疫情的发展情况和禽类的抗体水平。

需要注意的是，在操作过程中要严格遵守实验的安全规范，并按照操作方法进行操作，确保实验结果的准确性和可靠性。

鸡新城疫抗体检测实验报告
引言
•鸡新城疫（Newcastle Disease，ND）是一种由鸡新城疫病毒引起的急性、高度传染性疾病。

•对鸡新城疫的抗体检测是确保家禽养殖业安全和疫情控制的重要手段之一。

实验目的
•通过检测鸡群中的抗体水平，判断其是否感染了鸡新城疫病毒，从而进行及时的干预和控制措施。

实验方法
1.样本采集：
–从鸡群中选取一定数量的鸡只，代表样本群体。

–采集鸡只的血液样本，确保采样的无菌和无血栓。

2.抗体检测：
–使用ELISA技术或HI技术等方法，对血液样本中的鸡新城疫抗体进行检测。

–按照相关试剂盒说明书的步骤进行操作，确保准确性和可重复性。

3.结果分析：
–根据检测结果，对鸡群中抗体水平的高低进行评估。

–判断鸡群是否处于鸡新城疫感染风险中，从而制定相应的预防措施。

实验结果
•检测结果显示，样本群体中的抗体水平明显升高。

•鸡群中的抗体阳性率达到95%以上，为鸡新城疫感染的警戒线。

结论
•根据本次实验的结果，可以推断该鸡群已经感染了鸡新城疫病毒。

•建议立即采取相应的疫情控制措施，包括隔离感染鸡只、加强清洁消毒等。

展望
•随着科技的发展，抗体检测方法将更加准确和高效。

•将来可以探索更多的抗体检测技术，如PCR等，以提高鸡新城疫的早期检测和预防效果。

参考资料
•[鸡新城疫病毒抗体检测方法研究进展](
•鸡新城疫病毒抗体检测方法研究进展. 农业科学研究. 2020. •鸡新城疫病毒感染与抗体检测技术综述. 动物医学进展. 2018.。

新城疫抗体测定（一）血凝试验（HA）：取96孔板，按以下步骤操作：1、第一排1-12孔各加生理盐水50ul，第二排1-12孔加生理盐水50ul为红细胞对照（20分）；2、吸50ul病毒液于第一排第1孔，混匀后取50ul至第2孔，依次稀释至第12孔，弃去50ul，各孔经倍比稀释后稀释度依次为2-1-2-12（25分）。

3、第一排1-12孔及第二排1-12孔各加1%鸡红细胞50ul，微型震荡器震荡2min混匀（25分）。

4、室温静置10-30分，观察结果（10分）。

5、结果判定：红细胞对照组红细胞完全沉降，以试验排中能使等量红细胞发生完全凝集的病毒最高稀释倍数，作为病毒的血凝价，即HI效价，用2n表示。

结果判定：以出现完全凝集的抗原最大稀释度为该抗原的血凝滴度（20分）。

注意:由于新城疫病毒含有神经氨酸酶，它能破坏红细胞表面的血凝素受体，使凝集的病毒从红细胞上解脱下来，所以要及时观察结果。

（二）血凝抑制试验（HI）：取一96孔板，按以下步骤操作：1、4个单位抗原的制备：按HA试验测出的病毒血凝价乘4即为4个单位血凝素的稀释度（10分）。

2、待检血清的稀释：第一、二、三排1-12孔各加生理盐水50ul，于第一排第1孔中加入50ul待检血清，反复吹吸3-5次混匀后，取50ul至第2孔混匀，吸取50ul至第3孔…,依次稀释至第12孔，弃去50ul，经倍比稀释，血清的稀释度为2-1-2-12（20分）。

3、第一、二排1-12孔各加4个单位血凝素50ul，微量震荡器震荡2min混匀（20分）；4、室温静置20min（5分）；5、第一、二、三排1-12孔各加1%鸡红细胞50ul，微量震荡器震荡2min混匀混匀（15分）。

6、室温静置10--30分，观察结果（10分）；结果判定：以完全抑制红细胞凝集的最大稀释度为该血清的血凝抑制（HI）滴度（20分）。

鸡群HI滴度的高低在一定程度上反映了免疫保护水平的高低。

鸡群HI滴度的高低在一定程度上反映了免疫保护水平的高低。

鸡新城疫抗体（NDV-Ab）说明书鸡新城疫抗体（NDV-Ab）酶联免疫分析（ELISA）试剂盒使用说明书本试剂仅供研究使用目的：本试剂盒用于测定鸡血清，血浆及相关液体样本中新城疫抗体（NDV-Ab）的含量。

实验原理：本试剂盒应用双抗原夹心法测定标本中鸡新城疫抗体（NDV-Ab）水平。

用纯化的抗原包被微孔板，制成固相抗原，往包被单抗的微孔中依次加入新城疫抗体（NDV-Ab），再与HRP标记的抗原结合，形成抗原-抗体-酶标抗原复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。

TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。

颜色的深浅和样品中的新城疫抗体（NDV-Ab）呈正相关。

用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中鸡新城疫抗体（NDV-Ab）浓度。

试剂盒组成：试剂盒组成48孔配置96孔配置保存说明书1份1份封板膜2片（48）2片（96）密封袋1个1个酶标包被板1×481×962-8℃保存标准品：1800ng/L0.5ml×1瓶0.5ml×1瓶2-8℃保存标准品稀释液1.5ml×1瓶1.5ml×1瓶2-8℃保存酶标试剂3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存样品稀释液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存显色剂A液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存显色剂B液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存终止液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存20倍浓缩洗涤液20ml×1瓶30ml×1瓶2-8℃保存样本处理及要求：1.血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。

仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。

2.血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。