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环介导等温扩增技术原理专题培训课件

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第8章环介导等温扩增

第8章环介导等温扩增

扩增分两个阶段
第1阶段为起始阶段，任何一个引物向双链 DNA的互补部位进行碱基配对延伸时，另 一条链就会解离，变成单链。
扩增分两个阶段
上游内部引物FIP的F2 序列首先与模板F2c结合 （如图B所示），在链置 换型DNA聚合酶的作用下 向前延伸启动链置换合成 。
扩增分两个阶段
外部引物F3与模板F3c结 合并延伸，置换出完整的 FIP连接的互补单链（如图 C所示）。FIP上的F1c与 此单链上的Fl为互补结构 。自我碱基配对形成环状 结构（如图C所示）。
F3引物：上游外部引 物(Forward Outer Primer)，由F3区组 成，并与靶基因的 F3c区域互补。
BIP引物：下游内部引物 (Backward Inner Primer )，由B1C和B2区域 组成，B2区与靶基因3’ 端的 B2c区域互补，B1C域与靶 基因5’端的Blc区域序列相同。
B3引物：下游外部引物 (Backward Outer Primer )，由B3区域组成， 和靶基因的B3c区域互补。
2．扩增原理
60—65℃是双链DNA复性及延伸的中间温 度，DNA在65℃左右处于动态平衡状态。 因此，DNA在此温度下合成是可能的。利 用4种特异引物依靠一种高活性链置换DNA 聚合酶。使得链置换DNA合成在不停地自 我循环。
结合。开始链置换合成，解离出的单链核 酸上也会形成环状结构。迅速以3’末端的 B1区段为起点，以自身为模板。进行DNA 合成延伸及链置换．
扩增分两个阶段
第2阶段是扩增循环阶段。 形成长短不一的2条新茎环状结构的DNA，BIP
引物上的B2与其杂交。启动新一轮扩增。且产物 DNA长度增加一倍。在反应体系中添加2条环状 引物LF和LB，它们也分别与茎环状结构结合启动 链置换合成，周而复始。

lamp环介导等温扩增原理

lamp环介导等温扩增原理

lamp环介导等温扩增原理
LAMP（Loop-mediated isothermal amplification）是一种新型的等温扩增技术，它可以在恒定温度下快速扩增DNA序列，因此被广泛应用于分子生物学和医学领域。

LAMP技术的原理如下：
1.引物设计
LAMP技术需要设计4-6个特异性引物，其中包括两个外部引物（F3和B3），两个内部引物（FIP和BIP）和一个环形引物（loop primer）。

这些引物的设计基于目标DNA序列的特异性，以及引物之间的相互作用，以确保扩增的特异性和高效性。

2.等温扩增
LAMP技术的扩增过程是在恒定温度下进行的，一般为60-65℃。

引物结合到目标DNA序列上后，FIP和BIP引物通过自身的反向和正向扩增，形成一个DNA 环，这个环可以作为模板，引导F3和B3引物的扩增。

同时，环形引物也可以加速扩增速度和提高扩增效率。

3.产物检测
LAMP技术的产物是大量的DNA片段，可以通过凝胶电泳或实时荧光检测来进行检测。

实时荧光检测可以在扩增过程中实时监测DNA量的增加，从而确定扩增的特异性和灵敏度。

总之，LAMP技术是一种快速、特异性和高效的等温扩增技术，可以广泛应用于分子生物学和医学领域，例如病原体检测、基因突变分析和DNA测序等。

环介导等温扩增技术

环介导等温扩增技术
总之,LAMP方法是一种特异性强、灵敏度高、方 便快捷的检测方法,为金黄色葡萄球菌的检测提供了新 的方法,具有很高的使用价值。
谢谢欣赏！
采自奶场的125份样品进行了检测。结果表明,LAMP检 测出阳性样品81份, GB/T 4789.10- 2003检测出阳性样品84 份,LAMP阳性检出率为96.43%。
图5 金黄色葡萄球菌LAMP特异性的检测结果
M:DL2000 DNA Marker; 1:金黄色葡萄球菌ATCC25923;2:沙门氏菌 CGMCC 111552; 3:沙门氏菌ATCC13067;4:沙门氏菌HJ- 004; 5: ETEC: 44247 (6∶15∶16) ;6: EPEC: 44706 (111∶58∶- ) ; 7:荧光假单胞菌 CGMCC 111802;8:恶臭假单胞菌CGMCC111819; 9:铜绿假单胞菌 ATCC27853;
散法、免疫学方法、基因芯片法、基因探针法、 测试片法、PCR 法等。
环介导恒温扩增技术( loop -mediated isothermal amp lification, LAMP)是Notomi等2000年发明的一种 新颖的扩增技术,其特点是针对靶基因的6个区域设计4 种特异引物,在DNA聚合酶(B st DNA polymerase)的 作用下,恒温条件下进行核酸扩增,具有操作简单、特异 性强特点。另外通过环引物的添加,大大加快了反应的 速度 。国外报道,LAMP被广泛食品等病原菌的检测中, 如巴西芽生菌、锥虫病 、沙门氏菌 、虾中的白斑综合
测金黄色葡萄球菌特异性强、灵敏度高、时间 短且操作简便,有望成为快速检测金黄色葡萄 球菌的新方法。
简介：金黄色葡萄球菌( S taphy lococcus
aureus)是引起食物中毒的主要致病菌之一,也是 引起奶牛患乳房炎的重要病原菌 ,在自然界中广 泛存在,食品受污染的机会很多。近年来随着抗 生素的大量使用,耐甲氧西林金黄色葡萄球菌

大学课程遗传学实验实验九 环介导 jc课件

大学课程遗传学实验实验九 环介导 jc课件

8U/µl
dNTPs
2.5mM of each
F3、B3、FIP、BIP
25µM
琼脂糖凝胶
2﹪
10×Thermopol缓冲液
实验步骤
1、提取含有目的片段的质粒作为阳性模板（为了便于提取 目的DNA，我பைடு நூலகம்将靶序列克隆到质粒中）。
2、将各成分按以下次序在0.5ml灭菌离心管内混合：
阳性模板（质粒DNA） 1µl
环介导的等温扩增(Loop–mediated isothermal amplification，LAMP):针对 靶基因的六个区域设计四条特异性引物,利 用链置换DNA聚合酶(Bst DNA Polymerase)在等温条件下高效、快速、 特异地扩增靶序列。
实验目的
1. 掌握LAMP扩增单纯疱疹病毒II型 DNA的 基本原理。
第2阶段是扩增循环阶段。以茎环状结构为模 板，FIP与茎环的F2c区结合。开始链置换合成， 解离出的单链核酸上也会形成环状结构。迅速以3’ 末端的B1区段为起点，以自身为模板。进行DNA 合成延伸及链置换．形成长短不一的2条新茎环状 结构的DNA，BIP引物上的B2与其杂交。启动新 一轮扩增。且产物DNA长度增加一倍。扩增的最 后产物是具有不同个数茎环结构、不同长度DNA 的混合物。且产物DNA为扩增靶序列的交替反向 重复序列。
6、 取15µl DNA扩增产物，在含0.5μg/ml溴 化乙锭的2%琼脂糖凝胶上电泳30 min，电 压5V/cm，紫外灯下观察结果。
思考题
1、与PCR相比，LAMP有哪些优势? 2、LAMP与PCR的电泳条带有什么差别？
乙肝病毒检测
起始阶段
任何一个引物向双链DNA的互补部位进行碱基配对延 伸时，另一条链就会解离，变成单链。上游内部引物FIP 的F2序列首先与模板F2c结合，在链置换型DNA聚合酶的 作用下向前延伸启动链置换合成。外部引物F3与模板F3c 结合并延伸，置换出完整的FIP连接的互补单链。FIP上的 F1c与此单链上的Fl为互补结构。自我碱基配对形成环状 结构。以此链为模板。下游引物BIP与B3先后启动类似于 FIP和F3的合成，形成哑铃状结构的单链。迅速以3’末端 的Fl区段为起点,以自身为模板，进行DNA合成延伸形成 茎环状结构。该结构是LAMP基因扩增循环的起始结构。

环介导等温扩增技术

环介导等温扩增技术

环介导等温扩增技术
无环介导等温扩增技术，又称无环PCR技术（Loop-less PCR），是一种建立在核酸扩增基础上的空洞检测机制，专门用于精确地发现定位特异性核酸条带。

该技术是由德国Max Planck研究所研究员Gero Steinbacher和其同事于2012年提出的。

无环介导等温扩增（LPCR）技术首先引入Gero Steinbacher提出的标记聚合物链反应（MPCR），并且大大地简化了传统偶联反应扩增的整个过程。

该技术主要通过设计两个特殊的引物，一个引物由正向片段和逆向片段组成，另一个引物只由正向片段组成，双方引物由T4 DNA尾端核酸连接而成，这种新颖的结构就是MPCR技术的核心。

该技术的优点在于：
1、空洞检测的结果更加准确可靠；
2、反应涉及的步骤少，整个扩增过程机械性好，易于操作；
3、可以有效提高检测标记特异性核酸信号强度，准确定位检测到特定碱基；
4、可实现环境友好，加快分析过程。

随着医学和生物技术领域对无环介导等温扩增技术的不断进步，该技术在克隆特异性序列，基因检测，基因组分析，病毒鉴定，抗体反应定量，微生物检测等多个领域得到了广泛的应用。

相比于传统的PCR技术，无环介导等温扩增技术拥有更高的检测效率，更简便的操作过程，并且可以有效实现环境友好。

由于该技术具有上述特点，极大地提高了信息的准确性，广泛应用于各种生命科学相关领域。

LAMP技术及应用 PPT

LAMP技术及应用 PPT

LAMP法在结核菌检测中的应用
技术特点：
适宜的检测对象 以临床上引起结核感染的结核分枝杆菌复合群为检测 对象，可避免假阳性过高。
反应管预装反应体系 扩增及检测在全封闭反应管中进行，有效降低气溶胶 污染；用户操作简便、减少操作误差。
结果易读 产物和显色液直接显色即可肉眼判断结果。
LAMP法在结核菌检测中的应用
LAMP法和其他PCR法的比较
LAMP法和其他PCR法的比较
技术特点
特异性高 4条引物靶向目标基因6个区段，特异性高于PCR和qPCR
灵敏度高 扩增模板可低至每测试10拷贝或更少。
检测时间短 恒温扩增，省却温度循环，扩增时间60min。
设备简易，可同时检测多批样本 不需特定或高端检测仪器，恒温设备即可，例如水浴锅， 可以随时放入后续批次样本。
琼脂糖凝胶电泳法 由LAMP原理可知，LAMP反应的最终扩增产物是茎环DNA组
成的混合物，即有若干倍茎长度的茎环结构和类似花椰菜的结构。 因此，LAMP扩增产物在2％的琼脂糖凝胶糖上呈现的是典型的梯 状条带。（图A）
肉眼观察法 在LAMP反应过程中，可以通过产生的副产物焦磷酸镁白色
沉淀的产生来肉眼直接判断扩增反应是否进行。（图B）
LAMP法在结核菌检测中的应用 靶标限定: 结核分枝杆菌复合群
临床上感染人类的是结核分枝杆菌复合群，包括结核分枝 杆菌、牛分枝杆菌、田鼠分枝杆菌、非洲分枝杆菌、卡氏 分枝杆菌。
对检测对象的准确限定能避免假阳性过高而增加治疗成本， 长远来说，更有利于避免耐药性的产生。
gyrB基因作为结核分枝杆菌重要的功能基因，在复合群进 化过程中非常保守，LAMP法检测即以gyrB基因作为靶标。
通过荧光染料检测 有时，通过肉眼观察白色沉淀来检测会存在一定的误差，所

环介导等温扩增技术简介


环介导等温扩增反应的检测
荧光目视试剂检测
钙黄绿素 Mn2+
DNA聚合酶 扩增反应
dNTPs Mg2+
钙黄绿素
Mn2+ P2O74-
﹣+
焦磷酸锰（白色沉淀）
钙黄绿素（螯合剂）与试剂中的锰离子结合处于淬灭状态，扩增 反应的副产物焦磷酸离子与锰离子结合释放钙黄绿素，淬灭状态解 除，发出黄绿色荧光。
环介导等温扩增反应的检测
具体引物设计信息请参照网页：http://primerexplorer.jp/e/
哑铃状模板构造形成的过程
（1）
FIP
（2）
（3）
F3 Primer
（4） （5）
＋
解离链
（6） 环状结构
BIP
（7）
（8）
＋
解离链
环状结构
B3 Primer
环状结构
循环扩增阶段和延伸循环阶段
环介导等温扩增反应的体系
应用浊度的实时检测
如上图所见，可用分光光度计或浊度计对白色浑浊物（焦磷酸镁） 的浊度进行测定。
LAMP与普通PCR的比较
缺点
灵敏度高，一旦开盖容易形成气溶胶污染，故在进行试剂盒的研发过程
中可采用实时浊度仪，不要把反应后的反应管打开。
引物设计要求比较高，有些疾病的基因可能不适合使用环介导等温扩增 方法。
环介导等温扩增反应的检测
应用浊度检测
﹣+
阴性
阳性
扩增反应会产生一种叫焦磷酸镁的衍生物，此衍生物与生成的扩 增产物成正比，由于目的基因大量扩增同时也产生了大量的衍生物 ，于是出现白色浑浊沉淀（肉眼可见）。
dNTPs DNA Polymerase P2O74- +2Mg2+

环介导等温扩增技术


１．ＬＡＭＰ法检测结果：应用实时荧光定量方法 检测，测定出的痰标本中细菌浓度分别以１×１０３拷 贝／ｍｌ和１×１０５拷贝／ｍｌ为界值，计算每个界值范 围内阳性结果的例数，具体数据见表１。
中社区获得性肺炎１７４例，慢性阻塞性肺疾病急性
加重６０例，支气管扩张伴感染４３例，慢性支气管炎
急性发作８例，医院获得性肺炎４例。人选患者均
测出病原菌１８５株，其中细菌１４４株，非典型病原菌 ４１株；革兰阴性杆菌１２２株，革兰阳性球菌２２株。 革兰阴性杆菌中致病菌依次为铜绿假单胞菌４０株 （２１．６％），流感嗜血杆菌３４株（１８．４％），肺炎克雷 伯菌２０株（１０．８％），嗜麦芽窄食单胞菌１２株 （６．５％），鲍曼不动杆菌１１株（５．９％），大肠埃希菌 ５株（２．７％）。非典型病原菌中肺炎支原体３９株
ｗｅｒｅ
ｃｏｍｐａｒｅｄ．Ｒｅｓｕｌｔｓ
Ｔｈｅ ｃｕｌｔｕｒｅ
ａ
ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ ｔｈｅ ２８９ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ４４（１５．２％）ｗｅｒｅ ｐｏｓｉｔｉｖｅ．Ｔｅｓｔｓ ｂｙ ｔｈｅ ｂａｃｔｅｒｉａ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ＞１×１０３ ｅｏｐｉｅｓ／ｍｌ ａｓ ｃｕｔｏｆｆ ｖａｌｕｅ．ｓｈｏｗｅｄ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｒｅｓｕｌｔｓ
痰标本中的细菌浓度（拷贝／ｍ１）＝模板浓度
（拷贝／斗１）×１００／０．６。以细菌浓度＞１×１０３拷贝／ ｍ１判定为阳性结果ｐ ｏ。 ４．统计学处理：结果数据均采用ＳＰＳＳ １７．０统 计软件分析。配对的计数资料之间两两比较采用
ＭｃＮｅｍａｒ
ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ＬＡＭＰ）技术，以其
特异度强、敏感度高、快速准确和操作简单、技术水 平要求相对较低及所需试验器材简单等优点被广泛 应用于生物学的各个领域，可被推广用于感染性疾

环介导等温扩增技术原理课堂PPT

形 成
基 础 结 构
13
LAMP
环介导的等温扩增技术原理
14
环介导等温扩增过程演示
15
反应时间对LAMP的影响
Effect of reaction time on the LAMP nes1,D NA marker(DL2000) with2000,1000,750 ,500,250 and 100bP:lanes2一 5,LAMP amPlification Produets for 15 min,30min,45min,6 0min,respectively :lane6,without DNA template in the reaction. 乔岩梅. 炭疽芽孢杆菌特征基因恒温扩增检测方法的研究[D]. 中国科学院研究生院（武汉病毒研究所） 2007
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各类等温扩增技术的比较
温度 ℃ 引物
模板
NASBA 42
需要2条 RNA
SPIA 42
1条
RNA
HDA
37/65 需要2条 DNA
SDA LAMP RCA Qβ
37/65 63 37-65 37
不需要 4条 需要 不需要
DNA DNA DNA RNA
其他 反转录酶，RNA酶 H，T7RNA聚合酶 反转录酶，T7RNA 聚合酶 解旋酶，扩增片段 小
F3引物：上游外部引物(Forward Outer Primer)，由F3区组 成，并与靶基因的F3c区域互补。
BIP引物：下游内部引物(Backward Inner Primer )，由B1C 和B2区域组成，B2区与靶基因3’端的B2c区域互补，B1C域与 靶基因5’端的Blc区域序列相同。
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环介导等温扩增原理

核酸等温扩增ppt课件

• LAMP 的反应结果只有两种即扩增与不扩增，故 在产生非特异性扩增时是难以进行后续鉴定的；
• 产物相当复杂，无法进行后续的回收、鉴定、克 隆等基因工程操作。
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NASBA的优缺点
NASBA 是种 RNA 扩增法，因此其主要应用 是对 RNA 病毒的检测。
整个反应能在 42℃条件下进行，经过两个 小时的扩增可将模板 RNA放大至 109~1010 倍。
近年来，各国学者陆续利用RPA技术，对于DNA病毒、细菌等 进行核酸检测。
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RPA的原理
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四氢呋喃非碱基位点类似物
tetrahydrofuran abasic–site mimic (THF)
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结果观察：

Basic RPA
lateral-flow strip
exo RPA
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引物、探针设计
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LAMP的操作过程
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检测方法
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LAMP技术在病原体检测中的应 用
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LAMP技术小结
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LAMP技术的优点
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存在缺陷
• 所识别的靶位序列长度不得过大，一般在300 bp 以内。因此，无法进行长片段 DNA 的扩增；
• LAMP 技术具备高灵敏度，对操作要求严格分区， 否则极易受到污染而产生假阳性结果；
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SAT技术的原理
SAT技术（Simultaneous Amplification and Testing）是基于TMA （Transcription mediated amplification）恒温扩增技术发展起来的一项最新 核酸检测技术，是国内企业自主研发的专利技术
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与PCR技术相比核酸等温扩增对仪器的要 求大大简化，反应时间大大缩短，更能满足 快速简便的需求。
等温扩增的优势应用
特异性高 分析速度快 成本低 突变率低 不需要升温降温过程，一台的加热器即可操作 检测核酸成分比检测微生物本身危险性小 方便诊断
等温扩增的种类
环介导核酸等温扩增技术（LAMP） 滚环扩增技术 RCA 单引物等温扩增 SPIA 依赖解旋酶的等温扩增技术 HAD 链替代扩增 SDA 交叉引物扩增技术 CPA 核酸依赖性扩增检测技术 NASBA Qβ复制酶反应
环介导等温扩增原理
60—65℃是双链DNA复性及延伸的中间温度， DNA在65℃左右处于动态平衡状态。利用引物 合成的DNA链取代模板互补链。
①扩增目的片段时依赖的是一种具有链置换特 性的Bst DNA聚合酶
②需四条能够识别靶序列六个特异区域的引物 ③LAMP法并不需要对双链DNA进行预变性及
环介导等温扩增核酸技术
环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification ,简称LAMP)是利用4个特殊设计 的引物和具有链置换活性的Bst DNA聚合酶,在 恒温条件下特异、高效、快速地扩增DNA的新 技术。
LAMP技术以其特异性强、灵敏度高、快速、 准确和操作简便等优点在核酸的科学研究、疾 病的诊断和转基因食品检测等领域得到了日益 广泛的应用。
F3引物：上游外部引物(Forward Outer Primer)，由F3区组成， 并与靶基因的F3c区域互补。
BIP引物：下游内部引物(Backward Inner Primer )，由B1C和 B2区域组成，B2区与靶基因3’端的B2c区域互补，B1C域与 靶基因5’端的Blc区域序列相同。
B3引物：下游外部引物(Backward Outer Primer )，由B3区 域组成，和靶基因的B3c区域互补。
环介导等温扩增引物设计
LAMP反应引物与对应模板区域
环介导的等温扩增技术原理
内引物FIP的F2与其模板的互补序列F2c结合，在Bst DNA聚合酶作用下，从F2的3’末端开始启动DNA合成， 合成一条以FIP为新的DNA单链并与模板链结合形成新 的双链DNA。
环介导的等温扩增技术原理
以F3为起始合成的新链与模板链形成双链。而原合成的以FIP 为起始的DNA单链被置换而脱离产生一单链DNA，其在5’末端 F1c和F1区发生自我碱基配对，形成茎环状结构。
环介导的等温扩增技术原理
引物BIP的B2与模板链B2c区互补配对，合成以BIP为起始的新链， 并与模板链互补形成DNA双链。同时，F端的环状结构将被打开， 外引物B3与模板上B3c杂交后，以其3’末端为起点也开始合成新链， 并使以BIP为起始的DNA单链从模板链上脱离下来，形成以FIP和 BIP为两端的单链。因为B1C与B1互补，F1C与F1互补，两端自然 发生碱基配对，这条游离于液体中的DNA单链分别在F和B末端形成 两个茎环状结构，于是整条链呈现哑铃状结构，此结构即为LAMP 的基础结构。
进行温度循环。
环介导等温扩增引物设计
针对靶基因的六个不同的区域，基于靶基因3’ 端的F3c、F2c 和Flc区以及5’ 端的Bl、B2和B3区等6个不同的位点设计4种 引物。
LAMP反应的开始阶段四条引物都被使用，但在循环阶段则 只有内引物被使用。
FIP(Forward Inner Primer)：上游内部引物，由F2区和F1C 区域组成，F2区与靶基因3’端的F2c区域互补，F1C区与靶基 因5’端的Flc区域序列相同。
形 成
基 础 结 构
LAMP
环介导的等温扩增技术原理
环介导等温扩增过程演示
反应时间对LAMP的影响
Effect of reaction time on the LAMP nes1,D NA marker(DL2000) with2000,1000,750 ,500,250 and 100bP:lanes2一 5,LAMP amPlification Produets for 15 min,30min,45min,6 0min,respectively:l ane6,without DNA template in the reaction.
DNA聚合酶
环介导等温扩增核酸技术优势
LAMP克服了传统PCR反应需要通过反复热变性获得单链模 板的缺点，避免了反复升降温的过程，实现了恒温条件下的 连续快速扩增，具有更高的灵敏度和扩增效率。
操作简单：只需一个水浴锅
快速高效：不需要预先的双链DNA热变性．避免了温度循环 而造成 的时间损失
各类等温扩增技术的比较
温度 ℃ 引物 模板
NASBA 42
需要2条 RNA
SPIA 42
1条
RNA
HDA
37/65 需要2条 DNA
SDA LAMP RCA Qβ
37/65 63 37-65 37
不需要 4条 需要 不需要
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱDNA DNA DNA RNA
其他 反转录酶，RNA酶 H，T7RNA聚合酶 反转录酶，T7RNA 聚合酶 解旋酶，扩增片段 小
特异性强：针对靶序列6个区域设计的4种特异性引物。6个区 域中任何区域与引物不匹配均不能进行核酸扩增。故其特异 性极高。
高灵敏度，对于病毒扩增模板可达几个拷贝，比PCR高出数 量级的差异。
缺点：由于LAMP扩增是链置换合成，靶序列长度最好在 300 bp以内。>500 bp则较难扩增。故不能进行长链DNA的 扩增。灵敏度高易造成假阳性结果。
环介导等温扩增技术 原理PPT讲座
主要内容
等温扩增技术简介 等温扩增技术的应用前景 几种等温扩增技术比较 环介导的等温扩增技术原理 环介导的等温扩增演示 环介导的等温扩增检测
等温扩增的概念
等温扩增技术(Isothermal Amplification Technology)是核酸体外扩增技术，其反应过程 始终维持在恒定的温度下，通过添加不同活性 的酶和各自特异性引物（或不加）来达到快速 核酸扩增的目的。