环介导等温扩增技术原理ppt课件
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第8章环介导等温扩增
扩增分两个阶段
第1阶段为起始阶段，任何一个引物向双链 DNA的互补部位进行碱基配对延伸时，另 一条链就会解离，变成单链。
扩增分两个阶段
上游内部引物FIP的F2 序列首先与模板F2c结合 （如图B所示），在链置 换型DNA聚合酶的作用下 向前延伸启动链置换合成 。
扩增分两个阶段
外部引物F3与模板F3c结 合并延伸，置换出完整的 FIP连接的互补单链（如图 C所示）。FIP上的F1c与 此单链上的Fl为互补结构 。自我碱基配对形成环状 结构（如图C所示）。
F3引物：上游外部引 物(Forward Outer Primer)，由F3区组 成，并与靶基因的 F3c区域互补。
BIP引物：下游内部引物 (Backward Inner Primer )，由B1C和B2区域 组成，B2区与靶基因3’ 端的 B2c区域互补，B1C域与靶 基因5’端的Blc区域序列相同。
B3引物：下游外部引物 (Backward Outer Primer )，由B3区域组成， 和靶基因的B3c区域互补。
2．扩增原理
60—65℃是双链DNA复性及延伸的中间温 度，DNA在65℃左右处于动态平衡状态。 因此，DNA在此温度下合成是可能的。利 用4种特异引物依靠一种高活性链置换DNA 聚合酶。使得链置换DNA合成在不停地自 我循环。
结合。开始链置换合成，解离出的单链核 酸上也会形成环状结构。迅速以3’末端的 B1区段为起点，以自身为模板。进行DNA 合成延伸及链置换．
扩增分两个阶段
第2阶段是扩增循环阶段。 形成长短不一的2条新茎环状结构的DNA，BIP
引物上的B2与其杂交。启动新一轮扩增。且产物 DNA长度增加一倍。在反应体系中添加2条环状 引物LF和LB，它们也分别与茎环状结构结合启动 链置换合成，周而复始。
lamp环介导等温扩增原理
lamp环介导等温扩增原理
LAMP（Loop-mediated isothermal amplification）是一种新型的等温扩增技术，它可以在恒定温度下快速扩增DNA序列，因此被广泛应用于分子生物学和医学领域。
LAMP技术的原理如下：
1.引物设计
LAMP技术需要设计4-6个特异性引物，其中包括两个外部引物（F3和B3），两个内部引物（FIP和BIP）和一个环形引物（loop primer）。
这些引物的设计基于目标DNA序列的特异性，以及引物之间的相互作用，以确保扩增的特异性和高效性。
2.等温扩增
LAMP技术的扩增过程是在恒定温度下进行的，一般为60-65℃。
引物结合到目标DNA序列上后，FIP和BIP引物通过自身的反向和正向扩增，形成一个DNA 环，这个环可以作为模板，引导F3和B3引物的扩增。
同时，环形引物也可以加速扩增速度和提高扩增效率。
3.产物检测
LAMP技术的产物是大量的DNA片段，可以通过凝胶电泳或实时荧光检测来进行检测。
实时荧光检测可以在扩增过程中实时监测DNA量的增加，从而确定扩增的特异性和灵敏度。
总之，LAMP技术是一种快速、特异性和高效的等温扩增技术，可以广泛应用于分子生物学和医学领域，例如病原体检测、基因突变分析和DNA测序等。
大学课程遗传学实验实验九 环介导 jc课件
8U/µl
dNTPs
2.5mM of each
F3、B3、FIP、BIP
25µM
琼脂糖凝胶
2﹪
10×Thermopol缓冲液
实验步骤
1、提取含有目的片段的质粒作为阳性模板（为了便于提取 目的DNA，我பைடு நூலகம்将靶序列克隆到质粒中）。
2、将各成分按以下次序在0.5ml灭菌离心管内混合：
阳性模板（质粒DNA） 1µl
环介导的等温扩增(Loop–mediated isothermal amplification，LAMP):针对 靶基因的六个区域设计四条特异性引物,利 用链置换DNA聚合酶(Bst DNA Polymerase)在等温条件下高效、快速、 特异地扩增靶序列。
实验目的
1. 掌握LAMP扩增单纯疱疹病毒II型 DNA的 基本原理。
第2阶段是扩增循环阶段。以茎环状结构为模 板，FIP与茎环的F2c区结合。开始链置换合成， 解离出的单链核酸上也会形成环状结构。迅速以3’ 末端的B1区段为起点，以自身为模板。进行DNA 合成延伸及链置换．形成长短不一的2条新茎环状 结构的DNA，BIP引物上的B2与其杂交。启动新 一轮扩增。且产物DNA长度增加一倍。扩增的最 后产物是具有不同个数茎环结构、不同长度DNA 的混合物。且产物DNA为扩增靶序列的交替反向 重复序列。
6、 取15µl DNA扩增产物，在含0.5μg/ml溴 化乙锭的2%琼脂糖凝胶上电泳30 min，电 压5V/cm，紫外灯下观察结果。
思考题
1、与PCR相比，LAMP有哪些优势? 2、LAMP与PCR的电泳条带有什么差别？
乙肝病毒检测
起始阶段
任何一个引物向双链DNA的互补部位进行碱基配对延 伸时，另一条链就会解离，变成单链。上游内部引物FIP 的F2序列首先与模板F2c结合，在链置换型DNA聚合酶的 作用下向前延伸启动链置换合成。外部引物F3与模板F3c 结合并延伸，置换出完整的FIP连接的互补单链。FIP上的 F1c与此单链上的Fl为互补结构。自我碱基配对形成环状 结构。以此链为模板。下游引物BIP与B3先后启动类似于 FIP和F3的合成，形成哑铃状结构的单链。迅速以3’末端 的Fl区段为起点,以自身为模板，进行DNA合成延伸形成 茎环状结构。该结构是LAMP基因扩增循环的起始结构。
环介导等温扩增技术原理ppt课件
与PCR技术相比核酸等温扩增对仪器的要 求大大简化，反应时间大大缩短，更能满足 快速简便的需求。
3
特异性高 分析速度快 成本低 突变率低 不需要升温降温过程，一台的加热器即可操作 检测核酸成分比检测微生物本身危险性小 方便诊断
4
环介导核酸等温扩增技术（LAMP） 滚环扩增技术 RCA 单引物等温扩增 SPIA 依赖解旋酶的等温扩增技术 HAD 链替代扩增 SDA 交叉引物扩增技术 CPA 核酸依赖性扩增检测技术 NASBA Qβ复制酶反应
形 成
基 础 结 构
14
LAMP
15
16
Effect of reaction time on the LAMP nes1,D NA marker(DL2000) with2000,1000,750 ,500,250 and 100bP:lanes2一 5,LAMP amPlification Produets for 15 min,30min,45min,6 0min,respectively:l ane6,without DNA template in the reaction.
LAMP技术以其特异性强、灵敏度高、快速、 准确和操作简便等优点在核酸的科学研究、疾 病的诊断和转基因食品检测等领域得到了日益 广泛的应用。
8
60—65℃是双链DNA复性及延伸的中间温度， DNA在65℃左右处于动态平衡状态。利用引物 合成的DNA链取代模板互补链。
①扩增目的片段时依赖的是一种具有链置换特 性的Bst DNA聚合酶
②需四条能够识别靶序列六个特异区域的引物 ③LAMP法并不需要对双链DNA进行预变性及
进行温度循环。
9
针对靶基因的六个不同的区域，基于靶基因3’ 端的F3c、F2c 和Flc区以及5’ 端的Bl、B2和B3区等6个不同的位点设计4种 引物。
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特异性高 分析速度快 成本低 突变率低 不需要升温降温过程，一台的加热器即可操作 检测核酸成分比检测微生物本身危险性小 方便诊断
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环介导核酸等温扩增技术（LAMP） 滚环扩增技术 RCA 单引物等温扩增 SPIA 依赖解旋酶的等温扩增技术 HAD 链替代扩增 SDA 交叉引物扩增技术 CPA 核酸依赖性扩增检测技术 NASBA Qβ复制酶反应
形 成
基 础 结 构
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LAMP
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Effect of reaction time on the LAMP nes1,D NA marker(DL2000) with2000,1000,750 ,500,250 and 100bP:lanes2一 5,LAMP amPlification Produets for 15 min,30min,45min,6 0min,respectively:l ane6,without DNA template in the reaction.
LAMP技术以其特异性强、灵敏度高、快速、 准确和操作简便等优点在核酸的科学研究、疾 病的诊断和转基因食品检测等领域得到了日益 广泛的应用。
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60—65℃是双链DNA复性及延伸的中间温度， DNA在65℃左右处于动态平衡状态。利用引物 合成的DNA链取代模板互补链。
①扩增目的片段时依赖的是一种具有链置换特 性的Bst DNA聚合酶
②需四条能够识别靶序列六个特异区域的引物 ③LAMP法并不需要对双链DNA进行预变性及
进行温度循环。
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针对靶基因的六个不同的区域，基于靶基因3’ 端的F3c、F2c 和Flc区以及5’ 端的Bl、B2和B3区等6个不同的位点设计4种 引物。
环介导等温扩增技术简介
环介导等温扩增反应的检测
荧光目视试剂检测
钙黄绿素 Mn2+
DNA聚合酶 扩增反应
dNTPs Mg2+
钙黄绿素
Mn2+ P2O74-
﹣+
焦磷酸锰（白色沉淀）
钙黄绿素（螯合剂）与试剂中的锰离子结合处于淬灭状态，扩增 反应的副产物焦磷酸离子与锰离子结合释放钙黄绿素，淬灭状态解 除，发出黄绿色荧光。
环介导等温扩增反应的检测
具体引物设计信息请参照网页：http://primerexplorer.jp/e/
哑铃状模板构造形成的过程
（1）
FIP
（2）
（3）
F3 Primer
（4） （5）
＋
解离链
（6） 环状结构
BIP
（7）
（8）
＋
解离链
环状结构
B3 Primer
环状结构
循环扩增阶段和延伸循环阶段
环介导等温扩增反应的体系
应用浊度的实时检测
如上图所见，可用分光光度计或浊度计对白色浑浊物（焦磷酸镁） 的浊度进行测定。
LAMP与普通PCR的比较
缺点
灵敏度高，一旦开盖容易形成气溶胶污染，故在进行试剂盒的研发过程
中可采用实时浊度仪，不要把反应后的反应管打开。
引物设计要求比较高，有些疾病的基因可能不适合使用环介导等温扩增 方法。
环介导等温扩增反应的检测
应用浊度检测
﹣+
阴性
阳性
扩增反应会产生一种叫焦磷酸镁的衍生物，此衍生物与生成的扩 增产物成正比，由于目的基因大量扩增同时也产生了大量的衍生物 ，于是出现白色浑浊沉淀（肉眼可见）。
dNTPs DNA Polymerase P2O74- +2Mg2+
环介导等温扩增技术
环介导等温扩增技术
2015307360 吴祖雄
定义：针对靶基因的 6个区域设计4种特异引物，在链 置换 DNA 聚合酶 (Bst DNA polymerase) 的作用下， 60--65℃恒温扩增，15-60分钟左右即可实现 10^9～ 10^10倍的核酸扩增。
①扩增目的片段时依赖的是一种具有链置换特性的 Bst DNA聚合酶 ②需四条能够识别靶序列六个特异区域的引物 ③LAMP法并不需要对双链DNA进行预变性及进行温度 循环
第 2 步 ： 原 合 成的以 FIP 为起 始的 DNA 单 链 被置换而脱离， 成为单链 DNA ， 其在 5′末端 F1c 和 F1 区 发 生 自 我碱基配对， 形成茎环状结 构。
第3步：引物BIP的B2与模板 链 B2c 区互补配对，合成以 BIP 为 起始的新链，并与模 板链互补形成DNA双链。同 时， F 端的环状结构将被打 开，外引物 B3 与模板上 B3c 杂交后，以其 3 末端为起点 也开始合成新链，并使 BIP 为起始的DNA单链从模板链 上脱离下来，形成以 FIP 和 BIP为两端的单链。 整条链呈现哑铃状结构，此 结构即为LAMP的基础结构.
LAMP反应引物与对应模板区域
第 1 步：内引物 FIP 的 F2 与其模板的互补序 列 F2c 结 合 ， 在 Bst DNA 聚合酶作用下， 从 F2 的 3′ 末 端 开 始 启 动DNA 合成，合成一 条以 FIP 为起始的新的 DNA 单链，并与模板 链结合形成新的双链 DNA 。而原 DNA 双链 中与模板链互补的非 模板链将被取代而游 离于反应液中。
LAMP可用于病原菌、病毒的检测及鉴定，还可对DNA 进行定量分析；该方法用于单核苷酸多态性分型更灵敏 准确，不仅能够促进多基因性疾病的研究，还能决定临 床药物的使用及用药量。目前，已建立起多种病原菌、 病毒的LAMP 检测法。
2015307360 吴祖雄
定义：针对靶基因的 6个区域设计4种特异引物，在链 置换 DNA 聚合酶 (Bst DNA polymerase) 的作用下， 60--65℃恒温扩增，15-60分钟左右即可实现 10^9～ 10^10倍的核酸扩增。
①扩增目的片段时依赖的是一种具有链置换特性的 Bst DNA聚合酶 ②需四条能够识别靶序列六个特异区域的引物 ③LAMP法并不需要对双链DNA进行预变性及进行温度 循环
第 2 步 ： 原 合 成的以 FIP 为起 始的 DNA 单 链 被置换而脱离， 成为单链 DNA ， 其在 5′末端 F1c 和 F1 区 发 生 自 我碱基配对， 形成茎环状结 构。
第3步：引物BIP的B2与模板 链 B2c 区互补配对，合成以 BIP 为 起始的新链，并与模 板链互补形成DNA双链。同 时， F 端的环状结构将被打 开，外引物 B3 与模板上 B3c 杂交后，以其 3 末端为起点 也开始合成新链，并使 BIP 为起始的DNA单链从模板链 上脱离下来，形成以 FIP 和 BIP为两端的单链。 整条链呈现哑铃状结构，此 结构即为LAMP的基础结构.
LAMP反应引物与对应模板区域
第 1 步：内引物 FIP 的 F2 与其模板的互补序 列 F2c 结 合 ， 在 Bst DNA 聚合酶作用下， 从 F2 的 3′ 末 端 开 始 启 动DNA 合成，合成一 条以 FIP 为起始的新的 DNA 单链，并与模板 链结合形成新的双链 DNA 。而原 DNA 双链 中与模板链互补的非 模板链将被取代而游 离于反应液中。
LAMP可用于病原菌、病毒的检测及鉴定，还可对DNA 进行定量分析；该方法用于单核苷酸多态性分型更灵敏 准确，不仅能够促进多基因性疾病的研究，还能决定临 床药物的使用及用药量。目前，已建立起多种病原菌、 病毒的LAMP 检测法。
环介导等温扩增技术
延伸循环步骤
•
产物(10)和(10’)进入延伸循环步骤，分别
形成(11)和(11’)；内部引物又可以(11)和(11’)
作为模板，引导链置换DNA 的合成，使产物的序
列不断延伸、环化、再延伸，最终的产物是一些
具有不同茎长度茎环结构的DNA 和带有许多环的
折叠结构的DNA 的混合物。
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LAMP法实验室常规操作步骤
抽取、提纯样本DNA或RNA
环介导等温扩增技术（LAMP）法扩增
实时浊度检测或目视检测绿色荧光
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优缺点
• 优点：灵敏度高（比传统的PCR方法高2～5个数量级）； 反应时间短（30～60分钟就能完成反应）；临床使用不需 要特殊的仪器（试剂盒研发阶段推荐用实时浊度仪）；操 作简单（不论是DNA还是RNA，检测步骤都是需将反应液、 酶和模板混合于反应管中，置于水浴锅或恒温箱中63℃左 右保温30～60分钟，肉眼观察结果）。
• 缺点：灵敏度高，一旦开盖容易形成气溶胶污染，故在 进行试剂盒的研发过程中可采用实时浊度仪，不要把反应 后的反应管打开；引物设计要求比较高，有些疾病的基因 可能不适合使用环介导等温扩增方法。
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应用
LAMP 技术因其快速、高效、特异、灵 敏和经济等优点，已经应用于病原菌、寄 生虫、病毒、疾病和转基因产品检测等领 域，并且还将广泛应用于临床诊断、环境 监测、食源安全等领域，具有更为广阔的 发展应用前景。
• BIP
B1末端延伸至形成一个环状构造（F1末端即3’端游 离）；BIP 退火到茎环结构（8’）上，引导链置换DNA 合成反应，产生结构（9’）的产物；随后产物（9’）的 F1末端即3’ 端自动引导链置换DNA 的合成，生成产物 (10’）和茎环结构（8），产物（ 8 ）开始新一轮的循环 扩增。
核酸等温扩增ppt课件
• LAMP 的反应结果只有两种即扩增与不扩增，故 在产生非特异性扩增时是难以进行后续鉴定的；
• 产物相当复杂，无法进行后续的回收、鉴定、克 隆等基因工程操作。
17
18
19
20
21
22
NASBA的优缺点
NASBA 是种 RNA 扩增法，因此其主要应用 是对 RNA 病毒的检测。
整个反应能在 42℃条件下进行，经过两个 小时的扩增可将模板 RNA放大至 109~1010 倍。
近年来，各国学者陆续利用RPA技术，对于DNA病毒、细菌等 进行核酸检测。
37
RPA的原理
38
四氢呋喃非碱基位点类似物
tetrahydrofuran abasic–site mimic (THF)
39
40
结果观察：
Basic RPA
lateral-flow strip
exo RPA
41
引物、探针设计
10
LAMP的操作过程
11
检测方法
12
LAMP技术在病原体检测中的应 用
13
14
LAMP技术小结
15
LAMP技术的优点
16
存在缺陷
• 所识别的靶位序列长度不得过大，一般在300 bp 以内。因此，无法进行长片段 DNA 的扩增；
• LAMP 技术具备高灵敏度，对操作要求严格分区， 否则极易受到污染而产生假阳性结果；
26
SAT技术的原理
SAT技术（Simultaneous Amplification and Testing）是基于TMA （Transcription mediated amplification）恒温扩增技术发展起来的一项最新 核酸检测技术，是国内企业自主研发的专利技术
• 产物相当复杂，无法进行后续的回收、鉴定、克 隆等基因工程操作。
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NASBA的优缺点
NASBA 是种 RNA 扩增法，因此其主要应用 是对 RNA 病毒的检测。
整个反应能在 42℃条件下进行，经过两个 小时的扩增可将模板 RNA放大至 109~1010 倍。
近年来，各国学者陆续利用RPA技术，对于DNA病毒、细菌等 进行核酸检测。
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RPA的原理
38
四氢呋喃非碱基位点类似物
tetrahydrofuran abasic–site mimic (THF)
39
40
结果观察：
Basic RPA
lateral-flow strip
exo RPA
41
引物、探针设计
10
LAMP的操作过程
11
检测方法
12
LAMP技术在病原体检测中的应 用
13
14
LAMP技术小结
15
LAMP技术的优点
16
存在缺陷
• 所识别的靶位序列长度不得过大，一般在300 bp 以内。因此，无法进行长片段 DNA 的扩增；
• LAMP 技术具备高灵敏度，对操作要求严格分区， 否则极易受到污染而产生假阳性结果；
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SAT技术的原理
SAT技术（Simultaneous Amplification and Testing）是基于TMA （Transcription mediated amplification）恒温扩增技术发展起来的一项最新 核酸检测技术，是国内企业自主研发的专利技术
环介导的等温扩增法
• (1)需要昂贵的PCR仪； • (2)多因素影响扩增效果；
• (3)常引起非特异性扩增；
• (4)扩增反应时间长，一般需要几个小时，难以在基层推广应用等诸 多的缺陷，急需更新的方法来替代。
•
近年来随着分子生物学技术的发展，新的核酸扩增技
术也不断涌现。根据是否需要温度循环也可分为两类：一
类是非等温扩增体系，如聚合酶链式反应(PCR)、 连接酶 链式反应(LCR)等。另一类是等温扩增体系，如赖解旋酶 恒温基因扩增(HDA)、核酸依赖的扩增(NASBA)、滚环扩增 (RCA)、环介导的等温扩增（LAMP）等系统，核酸恒温扩
• （2）指数RCA
• 指数RCA与线性RCA相似，它采用了第二种引物。该引物序列与环 状DN并在聚合酶的作用
• 下延伸，其产物又作为 • 第一种探针的模板，这
• 样一来产物呈指数递增。
• 指数 RCA也可用于非环 • 状 DNA的扩增。
• 3、Loop-prime
•
Loop primers hybridize to the stem-loops, except for the loops that are hybridized by the inner primers, and prime strand displacement DNA synthesis. RESULT:signal increase was detected at 14 min and 44 min with and without the loop primers, respectively
(2)，byproduct.
• 2、Detection
(3), SYBR GreenⅠ
(4), Real-time PCR
环介导等温扩增技术
环介导等温扩增技术
无环介导等温扩增技术，又称无环PCR技术（Loop-less PCR），是一种建立在核酸扩增基础上的空洞检测机制，专门用于精确地发现定位特异性核酸条带。
该技术是由德国Max Planck研究所研究员Gero Steinbacher和其同事于2012年提出的。
无环介导等温扩增（LPCR）技术首先引入Gero Steinbacher提出的标记聚合物链反应（MPCR），并且大大地简化了传统偶联反应扩增的整个过程。
该技术主要通过设计两个特殊的引物，一个引物由正向片段和逆向片段组成，另一个引物只由正向片段组成，双方引物由T4 DNA尾端核酸连接而成，这种新颖的结构就是MPCR技术的核心。
该技术的优点在于：
1、空洞检测的结果更加准确可靠；
2、反应涉及的步骤少，整个扩增过程机械性好，易于操作；
3、可以有效提高检测标记特异性核酸信号强度，准确定位检测到特定碱基；
4、可实现环境友好，加快分析过程。
随着医学和生物技术领域对无环介导等温扩增技术的不断进步，该技术在克隆特异性序列，基因检测，基因组分析，病毒鉴定，抗体反应定量，微生物检测等多个领域得到了广泛的应用。
相比于传统的PCR技术，无环介导等温扩增技术拥有更高的检测效率，更简便的操作过程，并且可以有效实现环境友好。
由于该技术具有上述特点，极大地提高了信息的准确性，广泛应用于各种生命科学相关领域。
环介导等温扩增技术原理ppt课件
Principle of Loop-mediated isothermal amplification
环介导等温扩增技术原理
烟雨莫问
精选ppt
1
主要内容
等温扩增技术简介 等温扩增技术的应用前景 几种等温扩增技术比较 环介导的等温扩增技术原理 环介导的等温扩增演示 环介导的等温扩增检测
精选ppt
荧光检测：LAMP有极高的扩增效率，可在一小时内将靶序 列扩增至109～l010倍，所以当反应液中加入核酸染料 SYBR Green I后，在紫外灯或日光下通过肉眼即可进行判 定，如果含有扩增产物，反应混合物变绿；反之，则保持 SYBR Green I的橙色不变。
精选ppt
18
检测流程图
精选ppt
中国科学院研究生院（武汉病毒研究所） 2007
精选ppt
17
环介导等温扩增检测
反应结束后对扩增产物的检测常使用焦磷酸酶沉淀检测 （浊度检测）、荧光检测、凝胶电泳检测等。
焦磷酸酶沉淀的检测（浊度检测）：在LAMP反应过程中， dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg2+结合，产生 副产物焦磷酸酶白色沉淀，研究者发现LAMP反应中焦磷酸 镁沉淀的形成与所产生的DNA量之间的关系，发现两者生 成量之间呈线性关系，并且焦磷酸镁沉淀在400 nm处有吸 收峰，从而进行LAMP的定量检测。
F3引物：上游外部引物(Forward Outer Primer)，由F3区组 成，并与靶基因的F3c区域互补。
BIP引物：下游内部引物(Backward Inner Primer )，B1C 和B2区域组成，B2区与靶基因3’端的B2c区域互补，B1C域与 靶基因5’端的Blc区域序列相同。
DNA聚合酶
环介导等温扩增技术原理
烟雨莫问
精选ppt
1
主要内容
等温扩增技术简介 等温扩增技术的应用前景 几种等温扩增技术比较 环介导的等温扩增技术原理 环介导的等温扩增演示 环介导的等温扩增检测
精选ppt
荧光检测：LAMP有极高的扩增效率，可在一小时内将靶序 列扩增至109～l010倍，所以当反应液中加入核酸染料 SYBR Green I后，在紫外灯或日光下通过肉眼即可进行判 定，如果含有扩增产物，反应混合物变绿；反之，则保持 SYBR Green I的橙色不变。
精选ppt
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检测流程图
精选ppt
中国科学院研究生院（武汉病毒研究所） 2007
精选ppt
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环介导等温扩增检测
反应结束后对扩增产物的检测常使用焦磷酸酶沉淀检测 （浊度检测）、荧光检测、凝胶电泳检测等。
焦磷酸酶沉淀的检测（浊度检测）：在LAMP反应过程中， dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg2+结合，产生 副产物焦磷酸酶白色沉淀，研究者发现LAMP反应中焦磷酸 镁沉淀的形成与所产生的DNA量之间的关系，发现两者生 成量之间呈线性关系，并且焦磷酸镁沉淀在400 nm处有吸 收峰，从而进行LAMP的定量检测。
F3引物：上游外部引物(Forward Outer Primer)，由F3区组 成，并与靶基因的F3c区域互补。
BIP引物：下游内部引物(Backward Inner Primer )，B1C 和B2区域组成，B2区与靶基因3’端的B2c区域互补，B1C域与 靶基因5’端的Blc区域序列相同。
DNA聚合酶
环介导的恒等温扩增技术---张建立
细菌核酸的检测 真菌的检测
• 胚胎性别的鉴定 • SNP检测 • 食品安全
单链结构，让引物可以在等温条件下（约65℃）顺利结合上去
进行链置换扩增反应，客服了传统PCR反应需要通过反复的热 变形过程获得单链模板的缺点，并大大节省了反复升降温度的
时间，从而实现在恒温条件下进行连续的快速扩增。
LAMP与PCR方法对比
LAMP引物简介
LAMP扩增原理
LAMP扩增的三个阶段： 1. 循环模板合成阶段 2. 循环扩增阶段
3. 伸长和再循环阶段
LAMP扩增产物的检测
1. 琼脂糖电泳检测
普通PCR结果
L. 焦磷酸镁浊度检测
2.a
3. 荧光目测比色法检测
2.b
3.a
3.b
LAMP技术特点
• 优点：
1. 等温扩增：只需要一个恒定温度就能完成扩增反应，不需要像
PCR那样循环的温度变化。 2. 快速高效：因没有反复变性退火等耗时过程，LAMP体系从一开 始到结束都在不停的进行扩增反应，所以LAMP可以实现快速高 效的扩增。整个扩增反应可以在30~60min内完成，扩增出 109~1010倍靶序列拷贝，DNA产量高达500ug/ml。
环介导的等温扩增技术
（LAMP）
普通PCR
PCR的基本步骤
• 变性：高温使双链DNA解离形成单链（94℃,30s）。 • 退火：低温下，引物与模板DNA互补区结合（ 55℃,30s ）。
• 延伸：中温延伸。DNA聚合酶催化以引物为起始点的DNA链延
伸反应（70~72 ℃,30~60s）。
PCR的基本步骤
3.
特异性高：4个引物靶向6个区域决定了LAMP的高特异性，其中
6个独立的序列在扩增起始阶段决定靶序列的识别，而在后续的 扩增反应中，则由4个独立的序列决定靶序列的识别。因此就算
rpa等温扩增原理
rpa等温扩增原理
RPA（循环介导等温扩增）是一种新型的核酸扩增方法，它与PCR（聚合酶链反应）相比，具有快速、灵敏、简便等优点，并且不需要复杂的仪器和高温条件。
RPA原理是利用一种特殊的酶体系，在等温条件下，特异性地扩增目标DNA序列。
该酶体系由一个主要的酶（聚合酶）和多个辅助酶组成，可以在温度为37-42℃的条件下进行。
RPA扩增的原理与PCR类似，都是使用一对引物将目标序列扩增成数以百万计的复制品。
但是，RPA使用的酶体系不同于PCR，主要包括一种重组蛋白（recombinase）、一种酶（聚合酶）和一种单链结合蛋白（single-stranded DNA-binding protein）。
这些酶在等温条件下协同作用，能够快速扩增目标序列。
RPA的等温条件使其具有更快的扩增速度和更广的适用范围，可以扩增更长的DNA序列和RNA序列。
因此，RPA已经广泛应用于医疗诊断、食品安全、环境监测等领域。
未来，随着技术的改进和应用的拓展，RPA有望成为核酸扩增领域的重要手段。
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域中任何区域与引物不匹配均不能进行核酸扩增。故其特异 性极高。 高灵敏度，对于病毒扩增模板可达几个拷贝，比PCR高出数量 级的差异。 缺点：由于LAMP扩增是链置换合成，靶序列长度最好在 300 bp以内。>500 bp则较难扩增。故不能进行长链DNA的扩增。 灵敏度高易造成假阳性结果。
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环介导等温扩增核酸技术
Principle of Loop-mediated isothermal amplification
环介导等温扩增技术原理
烟雨莫问
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主要内容
等温扩增技术简介 等温扩增技术的应用前景 几种等温扩增技术比较 环介导的等温扩增技术原理 环介导的等温扩增演示 环介导的等温扩增检测
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等温扩增的概念
温度循环。
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环介导等温扩增引物设计
针对靶基因的六个不同的区域，基于靶基因3’ 端的F3c、 F2c和Flc区以及5’ 端的Bl、B2和B3区等6个不同的位点设计 4种引物。
LAMP反应的开始阶段四条引物都被使用，但在循环阶段则只 有内引物被使用。
FIP(Forward Inner Primer)：上游内部引物，由F2区和F1C 区域组成，F2区与靶基因3’端的F2c区域互补，F1C区与靶基 因5’端的Flc区域序列相同。
环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification ,简称LAMP)是利用4个特殊设计 的引物和具有链置换活性的Bst DNA聚合酶,在 恒温条件下特异、高效、快速地扩增DNA的新技 术。
LAMP技术以其特异性强、灵敏度高、快速、准 确和操作简便等优点在核酸的科学研究、疾病 的诊断和转基因食品检测等领域得到了日益广 泛的应用。
B3引物：下游外部引物(Backward Outer Primer )，由B3区 域组成，和靶基因的B3c区AMP反应引物与对应模板区域
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环介导的等温扩增技术原理
内引物FIP的F2与其模板的互补序列F2c结合，在Bst DNA聚合酶作用下，从F2的3’末端开始启动DNA合成， 合成一条以FIP为新的DNA单链并与模板链结合形成新 的双链DNA。
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各类等温扩增技术的比较
温度 ℃ 引物 模板
NASBA 42
需要2条 RNA
SPIA 42
1条
RNA
HDA
37/65 需要2条 DNA
SDA LAMP RCA Qβ
37/65 63 37-65 37
不需要 4条 需要 不需要
DNA DNA DNA RNA
其他 反转录酶，RNA酶 H，T7RNA聚合酶 反转录酶，T7RNA 聚合酶 解旋酶，扩增片段 小
构形 成
基 础 结
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LAMP
环介导的等温扩增技术原理
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环介导等温扩增过程演示
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反应时间对LAMP的影响
Effect of reaction time on the LAMP nes1,D NA marker(DL2000) with2000,1000,750 ,500,250 and 100bP:lanes2一 5,LAMP amPlification Produets for 15 min,30min,45min,6 0min,respectively :lane6,without DNA template in the reaction. 乔岩梅. 炭疽芽孢杆菌特征基因恒温扩增检测方法的研究[D]. 中国科学院研究生院（武汉病毒研究所） 2007
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环介导等温扩增检测
反应结束后对扩增产物的检测常使用焦磷酸酶沉淀检测 （浊度检测）、荧光检测、凝胶电泳检测等。
焦磷酸酶沉淀的检测（浊度检测）：在LAMP反应过程中， dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg2+结合，产生 副产物焦磷酸酶白色沉淀，研究者发现LAMP反应中焦磷酸 镁沉淀的形成与所产生的DNA量之间的关系，发现两者生 成量之间呈线性关系，并且焦磷酸镁沉淀在400 nm处有吸 收峰，从而进行LAMP的定量检测。
F3引物：上游外部引物(Forward Outer Primer)，由F3区组 成，并与靶基因的F3c区域互补。
BIP引物：下游内部引物(Backward Inner Primer )，由B1C 和B2区域组成，B2区与靶基因3’端的B2c区域互补，B1C域与 靶基因5’端的Blc区域序列相同。
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等温扩增的优势应用
特异性高 分析速度快 成本低 突变率低 不需要升温降温过程，一台的加热器即可操作 检测核酸成分比检测微生物本身危险性小 方便诊断
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等温扩增的种类
环介导核酸等温扩增技术（LAMP） 滚环扩增技术 RCA 单引物等温扩增 SPIA 依赖解旋酶的等温扩增技术 HAD 链替代扩增 SDA 交叉引物扩增技术 CPA 核酸依赖性扩增检测技术 NASBA Qβ复制酶反应
等温扩增技术(Isothermal Amplification Technology)是核酸体外扩增技术，其反应过程 始终维持在恒定的温度下，通过添加不同活性 的酶和各自特异性引物（或不加）来达到快速 核酸扩增的目的。
与PCR技术相比核酸等温扩增对仪器的要求 大大简化，反应时间大大缩短，更能满足快 速简便的需求。
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环介导的等温扩增技术原理
以F3为起始合成的新链与模板链形成双链。而原合成的以FIP 为起始的DNA单链被置换而脱离产生一单链DNA，其在5’末端 F1c和F1区发生自我碱基配对，形成茎环状结构。
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环介导的等温扩增技术原理
引物BIP的B2与模板链B2c区互补配对，合成以BIP为起始的新链，并 与模板链互补形成DNA双链。同时，F端的环状结构将被打开，外引 物B3与模板上B3c杂交后，以其3’末端为起点也开始合成新链，并 使以BIP为起始的DNA单链从模板链上脱离下来，形成以FIP和BIP为 两端的单链。因为B1C与B1互补，F1C与F1互补，两端自然发生碱基 配对，这条游离于液体中的DNA单链分别在F和B末端形成两个茎环状 结构，于是整条链呈现哑铃状结构，此结构即为LAMP的基础结构。
荧光检测：LAMP有极高的扩增效率，可在一小时内将靶序 列扩增至109～l010倍，所以当反应液中加入核酸染料 SYBR Green I后，在紫外灯或日光下通过肉眼即可进行判 定，如果含有扩增产物，反应混合物变绿；反之，则保持 SYBR Green I的橙色不变。
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检测流程图
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DNA聚合酶
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环介导等温扩增核酸技术优势
LAMP克服了传统PCR反应需要通过反复热变性获得单链模板的 缺点，避免了反复升降温的过程，实现了恒温条件下的连续 快速扩增，具有更高的灵敏度和扩增效率。
操作简单：只需一个水浴锅 快速高效：不需要预先的双链DNA热变性．避免了温度循环而
造成 的时间损失 特异性强：针对靶序列6个区域设计的4种特异性引物。6个区
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环介导等温扩增原理
60—65℃是双链DNA复性及延伸的中间温度， DNA在65℃左右处于动态平衡状态。利用引物合 成的DNA链取代模板互补链。
①扩增目的片段时依赖的是一种具有链置换特 性的Bst DNA聚合酶
②需四条能够识别靶序列六个特异区域的引物 ③LAMP法并不需要对双链DNA进行预变性及进行
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环介导等温扩增核酸技术
Principle of Loop-mediated isothermal amplification
环介导等温扩增技术原理
烟雨莫问
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主要内容
等温扩增技术简介 等温扩增技术的应用前景 几种等温扩增技术比较 环介导的等温扩增技术原理 环介导的等温扩增演示 环介导的等温扩增检测
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等温扩增的概念
温度循环。
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环介导等温扩增引物设计
针对靶基因的六个不同的区域，基于靶基因3’ 端的F3c、 F2c和Flc区以及5’ 端的Bl、B2和B3区等6个不同的位点设计 4种引物。
LAMP反应的开始阶段四条引物都被使用，但在循环阶段则只 有内引物被使用。
FIP(Forward Inner Primer)：上游内部引物，由F2区和F1C 区域组成，F2区与靶基因3’端的F2c区域互补，F1C区与靶基 因5’端的Flc区域序列相同。
环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification ,简称LAMP)是利用4个特殊设计 的引物和具有链置换活性的Bst DNA聚合酶,在 恒温条件下特异、高效、快速地扩增DNA的新技 术。
LAMP技术以其特异性强、灵敏度高、快速、准 确和操作简便等优点在核酸的科学研究、疾病 的诊断和转基因食品检测等领域得到了日益广 泛的应用。
B3引物：下游外部引物(Backward Outer Primer )，由B3区 域组成，和靶基因的B3c区AMP反应引物与对应模板区域
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环介导的等温扩增技术原理
内引物FIP的F2与其模板的互补序列F2c结合，在Bst DNA聚合酶作用下，从F2的3’末端开始启动DNA合成， 合成一条以FIP为新的DNA单链并与模板链结合形成新 的双链DNA。
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各类等温扩增技术的比较
温度 ℃ 引物 模板
NASBA 42
需要2条 RNA
SPIA 42
1条
RNA
HDA
37/65 需要2条 DNA
SDA LAMP RCA Qβ
37/65 63 37-65 37
不需要 4条 需要 不需要
DNA DNA DNA RNA
其他 反转录酶，RNA酶 H，T7RNA聚合酶 反转录酶，T7RNA 聚合酶 解旋酶，扩增片段 小
构形 成
基 础 结
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LAMP
环介导的等温扩增技术原理
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环介导等温扩增过程演示
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反应时间对LAMP的影响
Effect of reaction time on the LAMP nes1,D NA marker(DL2000) with2000,1000,750 ,500,250 and 100bP:lanes2一 5,LAMP amPlification Produets for 15 min,30min,45min,6 0min,respectively :lane6,without DNA template in the reaction. 乔岩梅. 炭疽芽孢杆菌特征基因恒温扩增检测方法的研究[D]. 中国科学院研究生院（武汉病毒研究所） 2007
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环介导等温扩增检测
反应结束后对扩增产物的检测常使用焦磷酸酶沉淀检测 （浊度检测）、荧光检测、凝胶电泳检测等。
焦磷酸酶沉淀的检测（浊度检测）：在LAMP反应过程中， dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg2+结合，产生 副产物焦磷酸酶白色沉淀，研究者发现LAMP反应中焦磷酸 镁沉淀的形成与所产生的DNA量之间的关系，发现两者生 成量之间呈线性关系，并且焦磷酸镁沉淀在400 nm处有吸 收峰，从而进行LAMP的定量检测。
F3引物：上游外部引物(Forward Outer Primer)，由F3区组 成，并与靶基因的F3c区域互补。
BIP引物：下游内部引物(Backward Inner Primer )，由B1C 和B2区域组成，B2区与靶基因3’端的B2c区域互补，B1C域与 靶基因5’端的Blc区域序列相同。
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等温扩增的优势应用
特异性高 分析速度快 成本低 突变率低 不需要升温降温过程，一台的加热器即可操作 检测核酸成分比检测微生物本身危险性小 方便诊断
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等温扩增的种类
环介导核酸等温扩增技术（LAMP） 滚环扩增技术 RCA 单引物等温扩增 SPIA 依赖解旋酶的等温扩增技术 HAD 链替代扩增 SDA 交叉引物扩增技术 CPA 核酸依赖性扩增检测技术 NASBA Qβ复制酶反应
等温扩增技术(Isothermal Amplification Technology)是核酸体外扩增技术，其反应过程 始终维持在恒定的温度下，通过添加不同活性 的酶和各自特异性引物（或不加）来达到快速 核酸扩增的目的。
与PCR技术相比核酸等温扩增对仪器的要求 大大简化，反应时间大大缩短，更能满足快 速简便的需求。
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环介导的等温扩增技术原理
以F3为起始合成的新链与模板链形成双链。而原合成的以FIP 为起始的DNA单链被置换而脱离产生一单链DNA，其在5’末端 F1c和F1区发生自我碱基配对，形成茎环状结构。
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环介导的等温扩增技术原理
引物BIP的B2与模板链B2c区互补配对，合成以BIP为起始的新链，并 与模板链互补形成DNA双链。同时，F端的环状结构将被打开，外引 物B3与模板上B3c杂交后，以其3’末端为起点也开始合成新链，并 使以BIP为起始的DNA单链从模板链上脱离下来，形成以FIP和BIP为 两端的单链。因为B1C与B1互补，F1C与F1互补，两端自然发生碱基 配对，这条游离于液体中的DNA单链分别在F和B末端形成两个茎环状 结构，于是整条链呈现哑铃状结构，此结构即为LAMP的基础结构。
荧光检测：LAMP有极高的扩增效率，可在一小时内将靶序 列扩增至109～l010倍，所以当反应液中加入核酸染料 SYBR Green I后，在紫外灯或日光下通过肉眼即可进行判 定，如果含有扩增产物，反应混合物变绿；反之，则保持 SYBR Green I的橙色不变。
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检测流程图
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DNA聚合酶
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环介导等温扩增核酸技术优势
LAMP克服了传统PCR反应需要通过反复热变性获得单链模板的 缺点，避免了反复升降温的过程，实现了恒温条件下的连续 快速扩增，具有更高的灵敏度和扩增效率。
操作简单：只需一个水浴锅 快速高效：不需要预先的双链DNA热变性．避免了温度循环而
造成 的时间损失 特异性强：针对靶序列6个区域设计的4种特异性引物。6个区
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环介导等温扩增原理
60—65℃是双链DNA复性及延伸的中间温度， DNA在65℃左右处于动态平衡状态。利用引物合 成的DNA链取代模板互补链。
①扩增目的片段时依赖的是一种具有链置换特 性的Bst DNA聚合酶
②需四条能够识别靶序列六个特异区域的引物 ③LAMP法并不需要对双链DNA进行预变性及进行