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新型抗菌蛋白内溶素在大肠杆菌中的融合表达与纯化李佳;刘伟;王华;严成其;王欣;陈剑平【期刊名称】《浙江农业学报》【年(卷),期】2014(000)002【摘要】抗菌蛋白E17G是一种通过基因改造获得的高效杀菌蛋白。
为高效表达抗菌蛋白E17G并减少E17G的抗菌活性对大肠杆菌宿主菌的致死作用，将E17G 基因克隆到原核表达载体pGEX-6P-1中，构建的重组原核表达载体pGEX-6P-1-E17G在低温下经IPTG诱导，E17G蛋白在大肠杆菌BL21中以GST-E17G融合蛋白的形式表达，采用GST亲和层析纯化和收集GST-E17G融合蛋白。
SDS-PAGE和Western blotting检测结果显示，GST-E17G能在大肠杆菌中正确表达，为进一步研究E17G抗菌蛋白的生物学活性奠定了基础。
【总页数】5页(P393-397)【作者】李佳;刘伟;王华;严成其;王欣;陈剑平【作者单位】浙江师范大学化学与生命科学学院，浙江金华 321004; 浙江省农业科学院病毒学与生物技术研究所，浙江杭州 310021;浙江省农业科学院植物保护与微生物研究所，浙江杭州 310021;浙江省农业科学院作物与核技术利用研究所，浙江杭州310021;浙江省农业科学院病毒学与生物技术研究所，浙江杭州310021;浙江省农业科学院植物保护与微生物研究所，浙江杭州 310021;浙江省农业科学院病毒学与生物技术研究所，浙江杭州 310021【正文语种】中文【中图分类】Q786【相关文献】1.新型抗菌蛋白天蚕素-人溶菌酶在大肠杆菌中的表达条件优化及纯化 [J], 卢雪梅;金小宝;朱家勇2.鸡β-防御素-2(Gal-2)基因在大肠杆菌中的融合表达与纯化 [J], 王海英3.鸡β-防御素-1基因(Gal-1)在大肠杆菌中的融合表达与纯化 [J], 张辉华;毕英佐;曹永长;马静云;杜礼琴4.牙龈卟啉单胞菌血凝集素黏附结构域ha2基因在大肠杆菌中的融合表达和纯化[J], 曾凤娇; 杨琳; 刘建国; 田源; 陈靖; 白国辉5.鸡β-防御素-1基因在大肠杆菌中的融合表达及其初步纯化与抗菌活性测定 [J], 吴静; 史玉颖; 李玉峰; 马秀丽; 黄兵; 宋敏训因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
GST-gAD在大肠杆菌中的优化表达及其生物活性测定王静;肖彬;尹东;罗志军【期刊名称】《南昌大学学报（医学版）》【年(卷),期】2008(048)003【摘要】目的探讨可溶性重组脂联素球状结构域融合蛋白(GST-gAD)在大肠杆菌中的优化表达及其抑制人乳腺癌细胞MDA-MB-231增殖的生物学活性.方法用含有GST-gAD基因的原核表达载体pGEX-KG-gAD转化E.coli JM109,同理空载质粒pGEX-KG作为内对照同时转化E.coli JM109;将影响融合蛋白表达的4个因素,温度、IPTG浓度、细菌密度OD600和诱导时问进行正交设计.确定其优化表达条件,用亲和层析法纯化GST-gAD;用MTT法检测GST-gAD对MDA-MB-231增殖的影响.结果 GST-gAD最佳表达条件为温度32℃,IPTG的浓度1.0 mmol/L,诱导前细菌密度OD6001.0,诱导表达时间1.5 h.GST-gAD浓度高于0.5μmol/L时对MDA-MB231细胞的生长具有明显的抑制作用.结论通过正交设计确定了可溶性GST-gAD融合蛋白在大肠杆菌中表达的优化条件并且当重组融合蛋白在大于0.5μmol/L时对MDA-MD231细胞的生长具有明显的抑制作用.【总页数】4页(P12-15)【作者】王静;肖彬;尹东;罗志军【作者单位】南昌大学研究生院医学部2005级,南昌,330006;南昌大学第二附属医院分子医学重点实验室,南昌,330006;南昌大学第二附属医院分子医学重点实验室,南昌,330006;美国波士顿大学医学院糖尿病研究中心,美国,波士顿,02138【正文语种】中文【中图分类】R378.2+1【相关文献】1.人胸腺肽β4基因在大肠杆菌中的克隆、表达、纯化及促血管生成生物活性研究[J], 贾琪;华子春2.人可溶性增殖诱导配体在大肠杆菌中的表达、纯化及生物活性鉴定 [J], 岳园园;水燕;管政兵;张双全3.人胰高糖素样肽-1及其突变体在大肠杆菌BL21中的表达与生物活性研究 [J], 窦文芳;张莲芬;雷楗勇;张立操;陈蕴;金坚4.牛乳铁蛋白活性多肽LfcinB在大肠杆菌中的串联表达、纯化及生物活性分析 [J], 刘珂杭;宗西翠;张慧丹;完颜杨珂;陈玉清5.人睫状神经营养因子在大肠杆菌和毕赤酵母中的表达和生物活性测定 [J], 张惠堂;颜志强;蔡兴锋;杨胜利;龚毅因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
收稿日期:2005-01-17 修回日期:2005-04-19*通讯作者(corresponding author):xiaozhongpeng@文章编号:1001-6325(2005)07-0653-04研究论文HRV 143C 蛋白酶在大肠杆菌的融合表达及活性检测文中伟,狄文娜,董秀华,阴 彬,强伯勤,袁建刚,彭小忠*(中国医学科学院中国协和医科大学基础医学研究所医学分子生物学国家重点实验室,北京100005)摘要:目的人鼻病毒3C 蛋白酶具有酶切物异性强且在低温下仍保持较强酶活性的特点而被用作工具酶。
为大量获得3C 蛋白酶,以融合形式在大肠杆菌中高效表达3C 蛋白酶。
方法将编码HRV 143C 蛋白酶的cDNA 克隆到pGEX4T -1载体,在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,经一步GS T 亲和层析纯化获得GS T -3C,再通过体外酶切实验对GS T -3C 和Thrombin 的酶切活性进行比较。
结果每升培养产物可获得纯度\90%的重组融合蛋白约50mg,重组GS T -3C 在4e 低温下具有比Thrombin 更高的酶活性。
结论GS T -3C 蛋白酶不仅可以应用于融合蛋白的酶切,而且为引入3C 蛋白酶识别位点的串联亲和纯化(TAP)系统提供又一种酶切工具。
关键词:人鼻病毒;3C 蛋白酶;表达;纯化中图分类号:R3 文献标识码:AExpression of HRV 143C protease in E.coli and its cleavageactivity analysisWE N Zhong -wei,DI Wen -na,Dong Xiu -hua,Yin Bing,QIANG Bo -qing,YUAN Jian -gang,PENG Xiao -zhong(National Laboratory of M edical Molecular Biology,Institute of Basic Medical Sciences,CA MS &P UMC,Beijing 100005,China)Abstract:Objective Application of human rhinovirus 143C protease as a too-l enzyme for more stringent sequence specificity and efficient cleavage at low te mperature.Methods To obtain large quantities of 3C protease,the protease was expressed in E.coli by fusion form.A cDNA encoding HRV 143C protease was cloned into pG EX 4T -1vector and expressed in E.coli BL21(DE3).Through one step GST affinity chromatography purification,GST -3C was ob -tained.We then compared cleavage activity of GST -3C with Thrombin by cleaving respectively substrates containing the corresponding recognition sequence.Re sults More A purity of over 90%and a level of approximately 50mg/L of E.coli culture were obtained,and GST -3C possessed the higher biological activity than Thrombin at low temperature.Conclusion The recombinant GST -3C protease can be not only applied to the cleavage of fusion proteins,but also be used as a too-l enzyme in TAP system containing 3C rec ognition sequence.Key words:hu man rhinovirus;3C protease;expression;pur i fication 蛋白质融合表达是获得具生物学活性重组蛋白的一个十分重要的手段。
43卷 6期2003年12月微生物学报Acta Microbiologica SinicaVol .43December No .62003基金项目:国家“863计划”(2002A2104101);国家自然科学基金(30370048)＊通讯作者。
Tel :86-571-86971287;Fax :86-571-86971634;E -mail :minhang @z ju .edu .cn作者简介:夏 颖(1977-),女,安徽宿州人,博士研究生,从事环境微生物研究。
E -mail :xiaying7702@sohu .com 收稿日期:2003-01-28,修回日期:2003-07-31一株多环芳烃降解菌的鉴定及GST 基因克隆和序列分析夏 颖 闵 航＊(浙江大学生命科学学院 杭州 310029)摘 要:由石油污染土壤中分离到一株能以多环芳烃(菲、芴、萘)为唯一碳源的细菌,经形态观察、生理生化(Biolog -GN )和G +C mol %分析,鉴定该菌为少动鞘氨醇单胞菌(Sphingo monas paucimo bilis )。
与16S rDNA 序列同源性的比较进一步确证了鉴定结果。
经菲诱导后的细菌谷胱甘肽S -转移酶(Glutathione S -transferase ,GST )酶活明显高于未诱导前,表明谷胱甘肽S -转移酶可能与多环芳烃的降解有关。
根据该酶基因的同源性序列设计引物,PCR 扩增出编码谷胱甘肽S -转移酶基因片段,进一步证实在该菌中有GST 的存在。
测序后基于编码GST 的基因所进行的系统发育分析表明,该多环芳烃降解菌与其它多环芳烃降解菌在进化上亲缘关系较近。
关键词:鞘氨醇单胞菌,谷胱甘肽S -转移酶,系统发育中图分类号:X172 文献标识码:A 文章编号:0001-6209(2003)06-0691-07多环芳烃(Poly -aromatic hydr ocar bons ,PAHs )是一类广泛分布的化学污染物,因其潜在的毒性、致癌性及致畸致变作用引起了人们的极大关注[1]。
㊃论 著㊃[收稿日期]2023-01-11[基金项目]邢台市重点研发计划项目(2021Z C 111)[作者简介]薛云(1987-),女,河北邢台人,河北省邢台市第三医院主管检验师,医学学士,从事病原微生物研究㊂*通信作者㊂E -m a i l :37044209@q q.c o m N G -T e s t C A R B A5在血培养肠杆菌科细菌碳青霉烯酶检测中的优势及其检测效能薛 云,刘向芹,张 凯*(河北省邢台市第三医院检验科,河北邢台054000) [摘要] 目的探讨N G -T e s tC A R B A5在血培养肠杆菌科细菌碳青霉烯酶含量检测的应用价值㊂方法收集我院临床标本中分离培养的已知基因型别的62株肠杆菌目细菌,包含耐碳青霉烯肠杆菌科细菌38株和对碳青霉烯敏感的肠杆菌科细菌24株,分别采用N G -T e s tC A R B A5试剂盒㊁C a r b aN P 和m C I M 试验检测待测菌株的主要碳青霉烯酶,并采用P C R 法对碳青霉烯酶基因表型进行测序确认和K a p p a 一致性检验;再从38株耐碳青霉烯菌株中随机取出20株菌株进行模拟血培养,并对其进行N G -T e s tC A R B A5试剂盒㊁C a r b aN P 法和m C I M 法检测和K a p p a 一致性检验分析㊂结果38株耐碳青霉烯肠杆菌科细菌菌株的耐药药物均为美罗培南和/或亚胺培南,P C R 扩增测序结果表明,分别有33株菌株携带有耐药基因,5株菌株未携带常见耐药基因㊂N G -T e s tC A R B A515m i n内检测到K P C ㊁N D M ㊁I M P ㊁K P C +N D M 以及N D M+I M P 的敏感度和特异度均为100%㊂C a r b aN P 法和m C I M 法的敏感度分别为93.94%㊁96.97%,特异度分别为80.00%㊁100.00%,与基因测序结果一致性K a p pa 值分别为0.857㊁0.902(P <0.05)㊂20株耐碳青霉烯肠杆菌科细菌模拟血培养,大肠杆菌㊁阴沟肠杆菌㊁肺炎克雷伯菌㊁产酸克雷伯菌分别有6株㊁5株㊁4株㊁5株,N G -T e s tC A R B A5敏感度和特异度均为100.0%,与基因测序结果一致性K a p p a 值为1.000;C a rb aN P 法和m C I M 法的敏感度分别为87.50%㊁93.75%,特异度均为100%,与基因测序结果一致性K a p p a 值分别为0.812㊁0.898(P <0.05)㊂结论N G -T e s tC A R B A5检测过程简单㊁高效,检测结果准确度高,大大简化了临床上检测碳青霉烯酶的复杂流程,有助于增强院内感染控制和及时指导临床治疗㊂[关键词] 碳青霉烯酶;N G -T e s tC A R B A5;C a r b aN P 试验 d o i :10.3969/j .i s s n .1007-3205.2023.11.017 [中图分类号] R 37-33 [文献标志码] A [文章编号] 1007-3205(2023)11-1334-06A d v a n t a g e s a n d e f f i c a c y o fN G -T e s t C A RB A5i n t h e d e t e c t i o no f c a r b a pe n e m a s e i nb l o o d c u l t u r e d e n t e r o b a c t e r i a c e a e b a c t e r i aX U EY u n ,L I U X i a n g -qi n ,Z H A N G K a i *(D e p a r t m e n t o f C l i n i c a lL a b ,t h eT h i r d H o s p i t a l o f X i n g t a i C i t y ,H e b e iP r o v i n c e ,X i n gt a i 054000,C h i n a )[A b s t r a c t ] O b je c t i v e T oe x p l o r et h ea p p l i c a t i o n v a l u eof N G -T e s t C A R B A 5i nt h e d e t e c t i o no fc a r b a pe n e m a s ec o n t e n t i nb l o o dc u l t u r e de n t e r o b a c t e r i a c e a eb a c t e r i a .M e t h o d s A t o t a lo f62s t r a i n so fe n t e r o b a c t e r i a c e a eb a c t e r i a w i t h k n o w n g e n et y p e s w e r ec o l l e c t e df r o m c l i n i c a l s p e c i m e n s o f o u r h o s p i t a l ,i n c l u d i ng 38s t r a i n s o f c a r b a p e n e mr e s i s t a n t e n t e r o b a c t e r i a c e a e b a c t e r i a a n d24s t r a i n so f c a r b a pe n e m s e n s i t i v ee n t e r o b a c t e r i a c e a eb a c t e r i a .N G -T e s tC A R B A5k i t ,C a r b aN Pa n dm C I Mt e s t sw e r e u s e d t o d e t e c t t h em a j o r c a r b a pe n e m a s e s of t h e s t r a i n s t ob e t e s t e d ,a n dP C R w a s u s e d t os e q u e n c e t h e c a r b a p e n e m a s eg e n e ph e n o t y p e s f o r c o n fi r m a t i o na n d K a p p a c o n s i s t e n c y t e s t .T h e n20s t r a i n sw e r er a n d o m l y s e l e c t e df r o m 38c a r b a pe n e m r e s i s t a n t s t r a i n sf o r s i m u l a t e db l o o dc u l t u r e ,a n dt e s t e dw i t h N G -T e s tC A R B A5k i t ,C a r b aN P m e t h o da n dm C I M m e t h o da n dK a p p ac o n s i s t e n c y t e s t .R e s u l t s T h ed r u g r e s i s t a n c eo f 38c a rb a p e n e m ㊃4331㊃第44卷第11期2023年11月河北医科大学学报J O U R N A L O F H E B E I M E D I C A L U N I V E R S I T YV o l .44 N o .11 N o v . 2023r e s i s t a n tE n t e r o b a c t e r i a c e a es t r a i n s w e r e m e r o p e n e m a n d/o r i m i p e n e m.P C Ra m p l i f i c a t i o na n d s e q u e n c i n g r e s u l t ss h o w e dt h a t33s t r a i n sc a r r i e dd r u g r e s i s t a n c e g e n e s,a n d5s t r a i n sd i dn o tc a r r y c o mm o nd r u g re s i s t a n c e g e n e s.T h es e n s i t i v i t y a n ds p e c if i c i t y o fN G-T e s tC A R B A5i nd e t e c t i n g K P C,N D M,I M P,K P C+N D M a n d N D M+I M P w i t h i n15m i n w e r e100%.T h e s e n s i t i v i t y o fC a r b aN P m e t h o da n d m C I M m e t h o dw a s93.94%a n d96.97%,r e s p e c t i v e l y,a n d t h e s p e c i f i c i t y w a s80.00%a n d100.00%,r e s p e c t i v e l y.T h eK a p p av a l u e sw e r e0.857a n d0.902 (P<0.05),w h i c h w e r ec o n s i s t e n t w i t ht h er e s u l t so f g e n es e q u e n c i n g.T w e n t y c a r b a p e n e m r e s i s t a n tE n t e r o b a c t e r i a c e a eb a c t e r i aw e r e c u l t u r e d i n s i m u l a t e db l o o d.T h e r ew e r e6,5,4a n d5 s t r a i n s o f E s c h e r i c h i a c o l i,E n t e r o b a c t e r c l o a c a e,K l e b s i e l l a p n e u m o n i a e a n d K l e b s i e l l a a c i d o g e n e s,r e s p e c t i v e l y.T h e s e n s i t i v i t y a n d s p e c i f i c i t y o fN G-T e s t C A R B A5w e r e100.0%,a n d t h eK a p p av a l u e w a s1.000,w h i c h w e r ec o n s i s t e n tw i t ht h er e s u l t so f g e n es e q u e n c i n g.T h e s e n s i t i v i t y o fC a r b aN P m e t h o da n d m C I M m e t h o dw e r e87.50%a n d93.75%r e s p e c t i v e l y,a n d t h e s p e c i f i c i t y w a s100%.T h e K a p p av a l u e s w e r e0.812a n d0.898(P<0.05),w h i c h w e r e c o n s i s t e n tw i t ht h er e s u l t so f g e n es e q u e n c i n g.C o n c l u s i o n T h ed e t e c t i o n p r o c e s so fN G-T e s t C A R B A5i ss i m p l e,e f f i c i e n ta n da c c u r a t e,w h i c h g r e a t l y s i m p l i f i e st h ec o m p l e x p r o c e s so f c l i n i c a l d e t e c t i o n o f c a r b a p e n e m a s e,a n d i s h e l p f u l t o e n h a n c e h o s p i t a l i n f e c t i o n c o n t r o l a n d t i m e l y g u i d e c l i n i c a l t r e a t m e n t.[K e y w o r d s]c a r b a p e n e m a s e;N G-T e s tC A R B A5;C a r b aN P t e s t全身性血流感染作为一种较为严重的感染性疾病,具有病情发展迅速和预后差等临床特征,其中产碳青霉烯酶肠杆菌科细菌(c a r b a p e n e m p r o d u c i n g e n t e r o b a c t e r a l e s,C P E)数量不断增加[1]㊂碳青霉烯酶编码基因主要位于细菌的质粒㊁转座子等基因元件上,这种基因水平转移的传播方式大大增加了C P E的致病率和病死率[2]㊂因此,快速对C P E菌株进行确认与鉴定具有重要临床意义㊂目前临床上确认和鉴定C P E菌株的主要方法包括C a r b aN P试验和碳青霉烯灭活试验(M o d i f i e d C a r b a p e n e m I n a c t i v a t i o n M e t h o d,m C I M)等,较传统的H o d g e 试验操作时间已明显缩短[3-4];N G-T e s tC A R B A5是一种已经商品化的胶体金试剂,可以快速有效检测C P E[5]㊂本研究以聚合酶链式反应(p o l y m e r a s e c h a i n r e a c t i o n,P C R)扩增碳青霉烯酶耐药基因结果作为金标准,通过采用三种检测方法对C P E菌株的五种主要碳青霉烯酶基因(K P C㊁N D M㊁V I M㊁I M P㊁O X A)进行检测,并对比检出能力和临床应用价值,以期为临床诊断㊁治疗C P E提供有效参考依据㊂1资料与方法1.1菌株来源收集我院自2021年1月 2022年10月临床标本中分离培养的已知基因型别的62株肠杆菌目细菌,包含耐碳青霉烯肠杆菌科细菌38株和对碳青霉烯敏感的肠杆菌科细菌24株,38株耐碳青霉烯肠杆菌科细菌的亚胺培南和美罗培南最小抑菌浓度均ȡ4n g/L㊂经鉴定,共包含肺炎克雷伯杆菌13株,阴沟肠杆菌11株,大肠杆菌8株,产酸克雷伯杆菌6株㊂38株不敏感菌株标本来源共包括痰液标本22株,血液标本4株,脓液标本3株,穿刺液1株,引流液2株,尿液标本6株㊂24株敏感菌株标本来源共包括痰液标本14株,血液标本2株,脓液标本2株,引流液1株,尿液标本5株㊂本研究中患者知情同意,且已获得医院伦理委员会批准㊂1.2菌株鉴定与药敏试验方法采用质谱仪(生产厂家:布鲁克公司,型号:MA L D T-T O F)鉴定所有菌株;采用V I T E K2c o m p a c t药敏卡进行药敏实验检查,药敏试验过程和药敏结果均参照美国临床实验室标准委员会进行㊂1.3碳青霉烯酶基因检测细菌D N A抽提试剂盒提取D N A,并根据特异性引物进行P C R扩增㊂所有操作均按照说明书进行,然后对细菌碳青霉烯酶主要基因(K P C㊁N D M㊁V I M㊁I M P㊁O X A)进行筛查㊂P C R的反应体系的总体积是25.0μL,包括D N A模板1.0μL(100m g/L)㊁去离子水9.5μL㊁M i x12.5μL以及引物各1.0μL(10μm o l/L)㊂P C R反应条件为:94ħ5m i n完成预变性;94ħ45s完成循环,55ħ45s完成退火,共36个循环, 72ħ延伸10m i n㊂采用2%琼脂糖凝胶电泳进行P C R产物凝胶成像及观察㊂见表1㊂㊃5331㊃河北医科大学学报第44卷第11期表1P C R引物序列T a b l e1P C R p r i m e r s e q u e n c e基因正向引物序列(5'~3')反向引物序列(5'~3')目标片段长度(b p) b l aK P C G T A T C G C C G T C T A G T T C T G C G G T C G T G T T T C C C T T T A G C C638b l a I M P T G A G C A A G T T A T C T G T A T T C T T A G T T G C T T G G T T T T G A T G740b l aV I M T T A T G G A G C A G C A A C C G A T G T C A A A A G T C C C G C T C C A A C G A920b l aO X A-48G C G T G G T A A G G A T G A A C A C C A T C A A G T T C A A C C C A A C C G438b l aN D M-1G G T T T G G C G A T C T G G T T T T C C G G A A T G G C T C A T C A C G A T C6211.4模拟血培养实验取健康成年人血10m L,加入细菌接种物103C F U/m L,混匀后注入树脂需氧血培养瓶中,于全自动血培养仪中孵育24h㊂从血培养阳瓶中抽出试样300μL,接种于20m LL B肉汤中,继续在37ħ振荡培养箱中孵育2h,然后采用离心机于4000r/m i n转速下离心15m i n后将细菌颗粒收集㊂将细菌颗粒沉淀重新悬浮于1.5m L去离子水中,接种在体积为100μL/孔的12个孔板中㊂配置N G-T e s tC A R B A5㊁C a r b aN P和m C I M 的a液和b液,不稀释加入孔内,37ħ孵育2h,由两位工作人员读取结果㊂1.5 N G-T e s tC A R B A5试验将约150μL提取滴入无菌离心管中,然后加入一环细菌样本,混合振荡10s后吸取100μL加入到检测卡盒中标记 S 的样本孔,室温放置15m i n后读取结果㊂1.6 C a r b aN P试验准备E P管A(对照管)㊁E P 管B(试验管),加入100μL细菌蛋白抽提液;将血平皿上35ħ培养的待测菌株分别接种于A㊁B管,涡旋震荡5s,分别加入100μL检测液A(p H7.8酚红硫酸锌溶液)㊁100μL检测液B(6g/L亚胺培南+p H7.8酚红硫酸锌溶液),37ħ孵育,每30m i n 观察颜色变化,直至孵育2h,其中颜色由红色变成黄色或者橙色则判为阳性,表示待测菌为产碳青霉烯酶㊂见图1㊂1.7 m C I M试验皿上待测菌株接种于T S B肉汤中,涡旋震荡10s,每管放入一张无菌纸片(含10μg 美罗培南),35ħ孵育4h㊂生理盐水制备0.5麦氏浊度的大肠埃希菌A T C C25922菌悬液,将菌液均匀涂布在MH A平板上;取出无菌纸片,贴于试管内壁,挤去纸片多余水分,取出无菌纸片后贴于MH A 平板上,倒置平板,35ħ孵育18~24h,量取抑菌圈直径㊂结果判断:抑菌圈直径为6~15mm或16~ 18mm但抑菌圈内散步菌落,表示碳青霉烯酶阳性;抑菌圈直径ȡ19mm则表示阴性㊂见图2㊂1.8统计学方法应用S P S S22.0统计软件分析数据㊂以P C R和基因测序结果为 金标准 ,分别计算N G-T e s tC A R B A5㊁C a r b aN P以及m C I M实验检测产碳青霉烯酶肠杆菌科细菌的准确度㊁敏感度㊁特异度㊂分别对以上3种实验与基因测序结果进行K a p p a一致性检验㊂P<0.05为差异有统计学意义㊂图1C a r b aN P试验检测结果F i g u r e1C a r b aN P t e s t r e s u l t s图2m C I M筛选产碳青霉烯酶菌株结果(阳性对照为A T C C1705;阴性对照为A T C C1706;1㊁2分别表示待测菌株结果为阳性)F i g u r e2S c r e e n i n g r e s u l t s o f c a r b a p e n e m a s e-p r o d u c i n g s t r a i n s b y m C I M(p o s i t i v e c o n t r o l w a sA T C C1705;A T C C1706 w a s t h en e g a t i v ec o n t r o l.1a n d2i n d i c a t e p o s i v i t i t y o ft h e s t r a i n t ob e t e s t e d r e s p e c t i v e l y)2结果2.1 N G-T e s tC A R B A5㊁C a r b aN P法和m C I M实㊃6331㊃河北医科大学学报第44卷第11期验结果38株耐碳青霉烯肠杆菌科细菌菌株的耐药药物为美罗培南和(或)亚胺培南,纸片法药敏测试结果和最小抑菌浓度值检测结果见表2㊂分别有33株菌株携带有耐药基因,5株菌株未携带常见耐药基因㊂N G-T e s t C A R B A515m i n内检测到K P C㊁N D M㊁I M P㊁K P C+N D M以及N D M+I M P 的敏感度和特异度均为100%㊂C a r b a N P法和m C I M法的敏感度分别为93.94%㊁96.97%,特异度分别为80.00%㊁100.00%,与基因测序结果一致性K a p p a值分别为0.857㊁0.902(P<0.05)㊂见表3㊂P C R扩增电泳图见图3㊂表238株耐碳青霉烯肠杆菌科细菌N G-T e s t C A R B A5㊁C a r b aN P法和m C I M实验结果T a b l e2E x p e r i m e n t a l r e s u l t s o f38s t r a i n s o f c a r b a p e n e mr e s i s t a n t E n t e r o b a c t e r i a c e a eb y N G-T e s t C A R B A5,C a r b aN Pm e t h o da n dm C I M组别细菌种类最小抑菌浓度(m g/L)亚胺培南美罗培南纸片法药敏(mm)亚胺培南美罗培南阳性菌株(33株)K P C(9株)肺炎克雷伯杆菌(9株)ȡ168~ȡ166~86~8N D M(20株)大肠杆菌(6株)4~ȡ164~ȡ167~186~17阴沟肠杆菌(10株)8~ȡ162~ȡ166~186~19肺炎克雷伯杆菌(2株)ȡ164~814~1810~16产酸克雷伯杆菌(2株)8~ȡ164~81512~16I M P(2株)产酸克雷伯杆菌(2株)ȡ162~516~1914~16K P C+N D M(2株)肺炎克雷伯杆菌(1株)ȡ162~416~1814~15产酸克雷伯杆菌(1株)851514阴性菌株(5株)大肠杆菌(2株)ɤ0.25~0.50ɤ0.25~8.0015~2510~25阴沟克雷伯杆菌(1株)ɤ0.25ɤ0.2568肺炎克雷伯杆菌(1株)851617产酸克雷伯杆菌(1株)ɤ0.25ɤ0.252015表3不同试验方法敏感度㊁特异度等比较T a b l e3C o m p a r i s o no f s e n s i t i v i t y a n d s p e c i f i c i t y o f d i f f e r e n t t e s tm e t h o d s(%)试验方法敏感度特异度阳性预测值阴性预测值N G-T e s tC A R B A5100.00100.00100.00100.00C a r b aN P93.94480.0096.8866.67m C I M96.97100.00100.00583.332.220株耐碳青霉烯肠杆菌科细菌模拟血培养N G-T e s tC A R B A5㊁C a r b aN P法和m C I M实验结果测序结果表明,15株阳性,5株阴性㊂其中1株P C R扩增阴性的大肠杆菌C a r b a N P法和m C I M 法结果为阳性,其余菌株的表型检测结果均与基因测序结果一致㊂N G-T e s tC A R B A5敏感度和特异度均为100.0%,与基因测序结果一致性K a p p a值为1.000;C a r b aN P法和m C I M法的敏感度分别为87.50%㊁93.75%,特异度均为100%,与基因测序结果一致性K a p p a值分别为0.812㊁0.898(P<0.05)㊂见表4~5㊁图3㊂表420株耐碳青霉烯肠杆菌科细菌N G-T e s t C A R B A5㊁C a r b aN P法和m C I M实验结果T a b l e4E x p e r i m e n t a l r e s u l t s o f20s t r a i n s o f c a r b a p e n e mr e s i s t a n t E n t e r o b a c t e r i a c e a eb y N G-T e s t C A R B A5,C a r b aN Pm e t h o da n dm C I M分组细菌种类模拟血培养:阳性菌株数/测试菌株数(例数,%) N G-T e s tC A R B A5C a r b aN P m C I M阳性菌株(15株)K P C(2株)肺炎克雷伯杆菌(2株)2(100)2(100)2(100) N D M(9株)大肠杆菌(4株)4(100)4(100)4(100)阴沟肠杆菌(4株)4(100)4(100)4(100)产酸克雷伯杆菌(1株)1(100)1(100)1(100) I M P(2株)产酸克雷伯杆菌(2株)2(100)2(100)2(100) K P C+N D M(2株)肺炎克雷伯杆菌(1株)1(100)1(100)1(100)产酸克雷伯杆菌(1株)1(100)1(100)1(100)阴性菌株(5株)大肠杆菌(2株)0(0)0(0)0(0)阴沟克雷伯杆菌(1株)0(0)0(0)0(0)肺炎克雷伯杆菌(1株)0(0)0(0)0(0)产酸克雷伯杆菌(1株)0(0)0(0)0(0)㊃7331㊃河北医科大学学报第44卷第11期表5不同试验方法敏感度㊁特异度等比较T a b l e5C o m p a r i s o no f s e n s i t i v i t y a n d s p e c i f i c i t y o f d i f f e r e n t t e s tm e t h o d s(%)试验方法敏感度特异度阳性预测值阴性预测值N G-T e s tC A R B A5100.00100.00100.00100.00C a r b aN P87.50100.00100.0066.67m C I M93.75100.00100.0080.00图3P C R扩增电泳图(1㊁2㊁3㊁4㊁5㊁6㊁7㊁8泳道分别代表D N A标志物㊁K P C基因阳性肺炎克雷伯菌A T C C B A A-1705㊁K P C基因扩增阴性肺炎克雷伯菌A T C C B A A-1706㊁K P C和N D M基因扩增阳性肺炎克雷伯菌㊁K P C基因阳性产酸克雷伯菌㊁N D M扩增阳性阴沟肠杆菌㊁K P C基因阴性大肠杆菌㊁I M P基因扩增阳性产酸克雷伯菌)F i g u r e3P C R a m p l i f i c a t i o ne l e c t r o p h o r e s i sd i a g r a m(L a n e 1,2,3,4,5,6,7a n d8r e p r e s e n t D N Am a r k e r s,K P C g e n e p o s i t i v e K l e b s i e l l a p n e u m o n i a e A T C C B A A-1705,K P C g e n e n e g a t i v e K l e b s i e l l a p n e u m o n i a e A T C C B A A-1706,K P C a n d N D M g e n e p o s i t i v e K l e b s i e l l a p n e u m o n i a e a n d K P C g e n e p o s i t i v e a c i d p r o d u c t i o n,K l e b s i e l l a,N D M a m p l i f i c a t i o n p o s i t i v eE n t e r o b a c t e rc l o a c a e,K P C g e n en e g a t i v eE s c h e r i c h i a c o l i,I M P g e n e a m p l i f i c a t i o n i n p o s i t i v eK l e b s i e l l a a c i d o g e n e s) 3讨论临床上对碳青霉烯酶进行迅速检测和鉴定对于预防和控制C P E所引起的多种感染具有重要临床意义,有利于有效切断院内传播和进一步感染[6-7]㊂我国耐药监测网监测数据显示,C P E比例高达97.4%,且其对碳青霉烯类抗生素药物美罗培南的耐药率已高达26.4%[8-9]㊂因此对C P E菌株以及碳青霉烯酶类型进行准确和快速检测,更有助于抗菌药物的合理选择和治疗㊂目前临床实验室开展了改良碳青霉烯灭活试验㊁C a r b aN P和m C I M等多种表型检测方法用于碳青霉烯酶检测[10]㊂C a r b a N P试验操作过程简单,一般在4~6h内可以得到阳性结果,但其检测O X A-48/-23等碳青霉烯酶的敏感度不是非常高,一般在73%~100%[11]㊂近年来,一些基于C a r b a N P试验的商品化试剂大大增加了便捷性,但对于O X A-48/-23型碳青霉烯酶的检测敏感度仍有待提高㊂研究报道m C I M检测碳青霉烯酶敏感度㊁特异度均超过90%[12],但m C I M的严重不足之处是临床试验周期长,且当产生金属β-内酰胺酶和丝氨酸酶菌株同时存在时,m C I M很容易得到假阴性结果[13]㊂有研究表明[14-15],N G-T e s tC A R B A5作为一种胶体金免疫层析法,其检测血培养阳性标本的敏感度可达95.8%~97.7%,特异度可达93.3%~ 96.1%,且一个N G-T e s tC A R B A5试剂盒即可快速检测K P C㊁O X A-48-l i k e㊁I M P㊁N D M和V I M等五种碳青霉烯酶,因此成为快速检测不同酶型碳青霉烯酶基因的关键手段㊂五种酶型作为肠杆菌目细菌中最为常见的碳青霉烯酶型,可有效区分金属β-内酰胺酶和丝氨酸β-内酰胺酶,非常有助于优化抗生素的管理过程,预防耐药现象蔓延,以及改善感染患者预后[16-17]㊂在本研究中,P C R测序检出有33株菌株携带有耐药基因,4株菌株未携带常见耐药基因㊂N G-T e s tC A R B A515m i n内检测到细菌碳青霉烯酶主要基因的敏感度和特异度均为100%㊂同时,测序结果表明,16株阳性,4株阴性㊂其中1株P C R扩增阴性的大肠杆菌C a r b aN P法和m C I M法结果为阳性,而N G-T e s tC A R B A5敏感度和特异度均为100.0%,与基因测序结果一致性K a p p a值为1.000;C a r b aN P法和m C I M法的敏感度分别为87.50%㊁93.75%,特异度均为100%,与前面文献报道结果类似[18]㊂因此N G-T e s tC A R B A5胶体金方法准确性高,操作简单,能快速进行酶型分型,非常有助于简化临床上的碳青霉烯酶检测常规工作流程,从而指导治疗方案优化和完善㊂本文检测菌株中仅涵盖了较为常见的几种青霉烯酶型,存在一定漏检其他碳青霉烯酶类型(如I M I㊁G I M等)可能㊂后续我们将继续收集产V I M型和O X A-48酶型的菌株,以㊃8331㊃河北医科大学学报第44卷第11期期进一步完善N G-T e s tC A R B A5胶体金方法检测碳青霉烯酶性能的全面评估㊂综上所述,N G-T e s tC A R B A5检测过程简单㊁高效,检测结果准确度高,大大简化了临床上检测碳青霉烯酶的复杂流程,适合于大范围初筛产碳青霉烯酶,有助于增强院内感染控制和及时指导临床治疗㊂[参考文献][1]周梦兰,杨启文,于淑颖,等.血流感染流行病学研究进展[J].中国感染与化疗杂志,2019,19(2):212-217.[2] T a mm aP D,A i t k e nS L,B o n o m oR A,e t a l.I n f e c t i o u s d i s e a s e ss o c i e t y o f A m e r i c a g u i d a n c eo nt h et r e a t m e n to fe x t e n d e d-s p e c t r u mβ-l a c t a m a s e p r o d u c i n g e n t e r o b a c t e r a l e s(E S B L-E),c a r b a p e n e m-R e s i s t a n t e n t e r o b a c t e r a l e s(C R E),a n dp s e u d o m o n a s a e r u g i n o s a w i t h d i f f i c u l t-t o-t r e a t r e s i s t a n c e(D T R-P.a e r u g i n o s a)[J].C l i n I n f e c t D i s,2021,72(7):e169-e183.[3] L a s k o M J,G i l l C M,A s e m p a T E,e t a l.E D T A-m o d i f i e dc a r b a p e n e mi n a c t i v a t i o n m e t h o d(e C I M)f o rde t e c t i n g I M PM e t a l l o-β-l 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e ss o c i e t y o fa m e r i c a g u i d a n c eo nt h et r e a t m e n to f A m p Cβ-l a c t a m a s e-p r o d u c i n g e n t e r o b a c t e r a l e s,c a r b a p e n e m-r e s i s t a n ta c i n e t ob ac t e rb a u m a n n i i,a n ds t e n o t r o p h o m o n a s m a l t o p h i l i ai n f e c t i o n s[J].C l i n I n f e c tD i s,2022,74(12):2089-2114.[17]任艳丽,王云英,蒋敏,等.不同碳青霉烯酶酶型肠杆菌科细菌感染的治疗策略研究[J].中国抗生素杂志,2021,46(4): 339-345.[18]d eO l i v e i r aS a n t o s I C,d aC o n c e içāoN e t oO C,d aC o s t aB S,e ta l.E v a l u a t i o n o f p h e n o t y p i c d e t e c t i o n o f c a rb a p e n e m a s e-p r o d u c i n g P s e u d o m o n a s s p p.f r o mc l i n i c a l i s o l a t e s[J].B r a z JM i c r o b i o l,2023,54(1):135-141.(本文编辑:刘斯静)㊃9331㊃薛云等 N G-T e s tC A R B A5在血培养肠杆菌科细菌碳青霉烯酶检测中的优势及其检测效能。
融合型乳酸片球菌素在大肠杆菌中的表达与纯化宋建民;孙爱友;魏东芝【摘要】为在大肠杆菌中高效表达乳酸片球菌素(PED),按照美国国立生物技术信息中心公布的PED基因序列设计合成引物,以乳酸片球菌基因组DNA为模板,用多聚酶链式反应扩增PED结构基因特异片段,构建编码组氨酸标记硫氧还原蛋白融合PED的重组表达质粒pET32c-PED,并转化大肠杆菌BL21(DE3).在异丙基硫代半乳糖苷诱导后融合蛋白以包涵体形式表达,表达量占菌体总蛋白的28%.经镍亲合层析纯化的融合蛋白用肠激酶裂解,再经超滤纯化,可得78%的收率.融合蛋白没有抗粪肠球菌细菌素活性,被分开的PED恢复了抑菌活性.%To effectively express pediocin PA-1 (PED)in Escherichia coli, the primers specific for PED coding sequence is designed and synthesized according to the National Center for Biotechnology Information.The gene fragment of PED is amplified from genomic DNA of pediococcus acidilacticii LH31 by polymeras chain reaction.The plasmid pET32c-PED, encoding PED fused with His-tagged thioredoxin protein,is constructed and introduced into escherichia coliBL21 (DE3)strain.The fusion protein is expressed in inclusion bodies counting 28％ of total cellular proteins in the strain after induction of isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) and purified by nickel-nitrilotriacetic acid (Ni-NTA) metal affinity chromatography.For the recovery of biologically active PED, the purified fusion protein is cleaved by enterokinase and the liberated PED is finally purified by ultrafiltration with a 78％ yield.The fusion protein,which does not have bactericidal activityagainst enterococcus faecalis, is cleaved by enterokinase and the cleaved PED recovers its own bactericidal activity.【期刊名称】《南京理工大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2011(035)002【总页数】5页(P268-272)【关键词】乳酸片球菌素;大肠杆菌;融合蛋白;表达;纯化【作者】宋建民;孙爱友;魏东芝【作者单位】华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室,上海200237;合肥学院生物与环境工程系,安徽合肥230022;华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室,上海200237;华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室,上海200237【正文语种】中文【中图分类】Q78细菌素(Bacteriocin)是某些细菌产生的一种蛋白类抗菌物质，具有高效、无毒、耐酸、耐高温、无残留、无抗药性，以及分子量小、含修饰氨基酸、结构复杂等特点，被认为是食品、化妆品等领域抑制病原菌和调节肠道菌群的好材料。
评估国产利奈唑胺对葡萄球菌和肠球菌体外抗菌活性于淑颖1，2，肖 盟1，杨文航1，程敬伟1，2，周梦兰1，2，陈新飞1，2，张 戈1，刘亚丽1，杨启文1，孙宏莉1，黄 勋3，伍众文4，黄文祥5，杨 青6，俞云松7，徐英春1摘要： 目的 以进口利奈唑胺（原研药）为对照，评估国产利奈唑胺（仿制药）的体外抗菌活性及与进口利奈唑胺的一致性。
方法 收集6所医院分离的甲氧西林耐药和敏感金黄色葡萄球菌（MRSA 、MSSA ），甲氧西林耐药和敏感凝固酶阴性葡萄球菌（MRCNS 、MSCNS ），万古霉素耐药肠球菌（VRE ）临床分离菌株，采用CLSI 推荐的微量肉汤稀释法进行抗菌药物敏感性试验。
结果 国产利奈唑胺对金黄色葡萄球菌、凝固酶阴性葡萄球菌及VRE 的MIC 50和MIC 90分别为2 mg/L 和4 mg/L 、1 mg/L 和2 mg/ L 及2 mg/L 和2 mg/L ，全部研究菌株对国产利奈唑胺呈现敏感。
国产和进口利奈唑胺仅在对MSSA 的MIC 50上相差一个稀释梯度，两者对其他葡萄球菌和VRE 的MIC 范围、MIC 50和MIC 90完全一致。
国产和进口利奈唑胺对全部研究菌株抗菌药物敏感性结果的分类一致率（CA ）和基本一致率（EA ）均高达100%，两者对全部研究菌株的MIC 值完全一致或相差不超过±1个稀释梯度。
除了MRCNS 对替考拉宁的敏感率为88.0%，葡萄球菌对替加环素、达托霉素、万古霉素和替考拉宁的敏感率均高达100%。
VRE 菌株对替加环素和达托霉素呈现100%敏感率，而对替考拉宁的敏感率仅为50.0%。
相比之下，全部菌株对左氧氟沙星的敏感率明显低于其他抗菌药物。
结论 国产利奈唑胺对多重耐药葡萄球菌及肠球菌具有极好的体外抗菌活性，且与进口利奈唑胺的体外抗菌活性高度一致。
关键词： 利奈唑胺； 药物敏感性试验； 耐甲氧西林葡萄球菌； 耐万古霉素肠球菌中图分类号：R978；R378 文献标识码：A 文章编号：1009-7708 ( 2019 ) 04-0400-05DOI: 10.16718/j.1009-7708.2019.04.012Evaluation of the in vitro antimicrobial activity of domestic linezolid against clinical Staphylococcus and Enterococcus isolatesYU Shuying, XIAO Meng, YANG Wenhang, CHENG Jingwei, ZHOU Menglan, CHEN Xinfei, ZHANG Ge, LIU Yali, YANG Qiwen, SUN Hongli, HUANG Xun, WU Zhongwen, HUANG Wenxiang, YANG Qing, YU Yunsong, XU Yingchun. （Department of Laboratory Medicine, Peking Union Medical College Hospital, Beijing Key Laboratory for Mechanisms Research and Precision Diagnosis of Invasive Fungal Diseases, Chinese Academy ofMedical Sciences, Beijing 100730, China ）Abstract: Objective To evaluate the in vitro antimicrobial activity of domestic linezolid (generic drug) and its consistency with imported linezolid (original drug). Methods MRSA, MSSA, MRCNS, MSCNS, and VRE strains were collected from six hospitals. The antimicrobial susceptibility testing was carried out using the microdilution method recommended by CLSI. Results The MIC 50 and MIC 90 values of domestic linezolid against Staphylococcus aureus , coagulase-negative Staphylococcus and VRE were 2 mg/L and 4 mg/L, 1 mg/L and 2 mg/L, and 2 mg/L and 2 mg/L, respectively. All the isolates were susceptible to the domestic linezolid. Only one dilution difference was found between domestic and imported linezolid in the MIC 50 value against MSSA. Other·论著·基金项目： 中国医学科学院医学与健康科技创新工程（2016-I2M-1-014）；北京协和医学院创新工程基金（2018-1002-01-02）。
