肠球菌、溶血性链球菌和粪链球菌检验培养基

溶血性链球菌及检验一、生物学特性1、形态与染色链球菌呈球形或椭圆形，直径0.6-1.0μm，呈链状排列，长短不一，从4-8个至20-30个菌细胞组成不等，链的长短与细菌的种类及生长环境有关。

在液体培养基中易呈长链，固体培养基中常呈短链，由于链球菌能产生脱链酶，所以正常情况下链球菌的链不能无限制的延长。

多数菌株在血清肉汤中培养2-4h易形成透明质酸的荚膜，继续培养后消失。

该菌不形成芽胞，无鞭毛，易被普通的碱性染料着色，革兰氏阳性，老龄培养或被中性粒细胞吞噬后，转为革兰氏阴性。

2、培养特征需氧或兼性厌氧菌，营养要求较高，普通培养基上生长不良，需补充血清、血液、腹水，大多数菌株需核黄素、维生素B6、烟酸等生长因子。

最适生长温度为37℃，在20-42℃能生长，最适pH为7.4-7.6。

在血清肉汤中易成长链，管底呈絮状或颗粒状沉淀生长。

在血平板上形成灰白色、半透明、表面光滑、边缘整齐、直径0.5-0.75mm的细小菌落，不同菌株溶血不一。

3、生化反应分解葡萄糖，产酸不产气，对乳糖、甘露醇、水杨苷、山梨醇、棉子糖、蕈糖、七叶苷的分解能力因不同菌株而异。

一般不分解菊糖，不被胆汁溶解，触酶阴性。

4、抗原结构链球菌的抗原构造较复杂，主要有三种：（1）核蛋白抗原或称P抗原，无特异性，各种链球菌均相同。

（2）多糖抗原或称C抗原，系群特异性抗原，是细胞壁的多糖组分，可用稀盐酸等提取。

（3）蛋白质抗原或称表面抗原，具有型特异性，位于C抗原外层，其中可分为M、T、R、S四种不同性质的抗原成分，与致病性有关的是M抗原。

5、分类根据链球菌在血液培养基上生长繁殖后是否溶血及其溶血性质分为三类。

（1）α-溶血性链球菌：菌落周围有1-2mm宽的草绿色溶血环，也称甲型溶血，这类链球菌多为条件致病菌。

（2）β-溶血性链球菌：菌落周围形成一个2-4mm宽、界限分明、完全透明的无色溶血环，也称乙型溶血，因而这类菌亦称为溶血性链球菌，该菌的致病力强，常引起人类和动物的多种疾病。

肠球菌属标准操作规程1.概述肠球菌属于1984年从链球菌属划出，单独成为一个菌属，包括粪肠球菌、屎肠球菌、鸟肠球菌、坚韧肠球菌、铅黄肠球菌、蒙氏肠球菌、海氏肠球菌、鹑鸡肠球菌和病臭肠球菌等18个种和1个变异株。

临床上常见的菌株为粪肠球菌。

2.标本类型血液、尿液、痰、穿刺液、脓液等标本。

3.鉴定3.1 形态与染色革兰阳性球菌，单个、成双或短链状排列。

3.2 培养特性在血琼脂平板上形成较小、灰白色，有a 溶血或β溶血环的菌落。

在麦康凯琼脂平板上形成较小、干燥、粉红色菌落。

3.3 生化反应触酶试验阴性，分解甘露醇、山梨醇、胆汁七叶苷试验阳性、在含6.5%氯化钠的肉汤中生长，多数菌株PYR试验阳性，对杆菌肽耐药。

3.4 鉴别要点3.4.1 本菌特征革兰阳性球菌，触酶试验阴性，在65g/L 氯化钠中生长，胆汁、七叶苷试验阳性，45℃中生长。

3.4.2与屎肠球菌的鉴别：粪肠球菌不分解阿拉伯糖，而屎肠球菌能分解阿拉伯糖3.4.3 与链球菌属和乳球菌属的鉴别：见表5-353.4.4 粪肠球菌与其他各主要菌种间的鉴别：见表5-36操作步骤3.5.1 触酶试验阳性参见触酶试验标准操作规程3.5.2 鉴定从血平板上挑取纯菌落，用微生物鉴定仪或传统生化反应进行细菌鉴定。

4.药敏参见《药物敏感性试验标准操作规程》及CLSI M100-S20最新版本文件.5.质量控制参见《质量控制程序》6.检验结果解释与分析在β-内酰胺酶阴性球菌肠球菌中，氨苄西林药敏试验结果可预测阿莫西林-克拉维酸、氨苄西林-舒巴坦、哌拉西林和哌拉西林-他唑巴坦等敏感性。

青霉素药敏试验可预测氨苄西林、阿莫西林、阿莫西林-克拉维酸、氨苄西林-舒巴坦、哌拉西林和哌拉西林-他唑巴坦等药敏结果。

粪肠球菌中氨苄西林药敏结果可以预测亚胺培南的药敏结果。

对于血培养和脑脊液中分离到的肠球菌，需做β-内酰胺酶检测，β-内酰胺酶阳性，则对青霉素、羧基青霉素和脲基青霉素均耐药。

葡萄糖肉浸液肉汤Dextrose Meat Infusion Broth 用途：用于溶血性链球菌的增菌培养匹克氏肉汤基础APick’s Broth BaseA用途：用于溶血性链球菌的增菌培养肉浸液肉汤培养基Meat Infusion Broth用途：用于溶血性链球菌、蜡样芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌的增菌培养（GB标准）叠氮钠葡萄糖肉汤Azide Dextrose Broth 用途：用于链球菌的增菌培养乙基紫叠氮钠肉汤用途：用于链球菌的增菌培养KF链球菌琼脂KF Streptococcus Agar 用途：用于链球菌的选择性分离及计数（GB、SN标准）肠球菌琼脂(胆盐－七叶苷－叠氮钠琼脂)Enterococcus Agar(Bile Esculin Azide Agar) 用途：用于食品和水中肠球菌的计数CATC琼脂CATC Agar 用途：用于食品和饮料肠球菌的分离培养胆盐七叶苷琼脂Bile Esculin Agar用途：用于肠球菌和肠道致病菌的分离培养哥伦比亚血琼脂基础Columbia Blood Agar Base 用途：营养非常丰富，用于各种细菌的基础培养基LIM培养基LIM Medium 用途：用于链球菌的分离培养（Japan方法）BETA-SSA琼脂BETA-SSA Agar用途：用于链球菌的选择性分离培养粪肠球菌琼脂Enterococcus faecalis Agar 用途：用于粪肠球菌的选择性分离缓冲蛋白胨水Buffered Peptone Water 用途：用于阪崎杆菌前增菌培养（GB2008标准）胆汁液态培养基Bile broth用途：用于粪链球菌的胆汁耐受试验。

M-肠道菌琼脂M-Enterococcus Agar用途：用于水中或其它物质中肠球菌分离培养和计数（滤膜法或划线法）THB培养基THB Medium 用途：用于链球菌增菌培养PS琼脂PS Agar 用途：用于消化球菌的培养肠球菌肉汤Enterococcus Broth 用途：用于肠球菌增菌培养脑心浸液肉汤（BHI）Brain Heart Infusion Broth 用途：用于细菌的增菌培养脑心浸萃液肉汤Brain Heart Infusion Broth 用途：用于营养苛求细菌的增菌培养脑心浸液琼脂（BHIA）Brain Heart infusion Agar 用途：用于营养苛求细菌的增菌培养Pfizer肠球菌选择性琼脂（PSE琼脂）Pfizer Enterococcus Selective Agar 用途：用于粪链球菌的选择性分离和计数（SN标准）MEI培养基MEI Medium 用途：用于一步滤膜法显色检测或计数水中的肠球菌。

中华人民共和国国家标准食品卫生微生物学检验溶血性链球菌检验1 主题内容与适用范围本标准规定了食品中溶血性链球菌的检验方法。

本标准适用于食品和食物中毒样品中溶血性链球的检验。

2 引用标准GB 4789.28 食品卫生微生物学检验染色法、培养基和试剂3 设备和材料3．1 温箱：36±1℃。

3．2 水浴：36±1℃。

3．3 显微镜。

3．4 离心机。

3．5 试管架。

3．6 灭菌平皿。

3．7 灭菌小试管。

3．8 载玻片。

3．9 灭菌吸管：1 mL、10 mL。

3．10 灭菌镊子。

3．11 均质器。

3．12 酒精灯。

3．13 接种环。

4 培养基和试剂4．1 葡萄糖肉浸液肉汤：按GB 4789.28 中4.1 规定，在肉浸液肉汤内加入1%葡萄糖。

4．2 肉浸液肉汤：按GB 4789.28 中4.1 规定。

4．3 匹克氏肉汤：按GB 4789.28 中4.62 规定。

4．4 血琼脂平板：按GB 4789.28 中4.6 规定。

4．5 人血浆。

4．6 0.25%氯化钙。

4．7 灭菌生理盐水。

4．8 杆菌肽药敏纸片（含 0.04 单位）。

5 检验程序6 操作步骤6．1 样品处理称取 25 g 固体检样；称取25 mL 液体检样，加入 225 mL 灭菌生理盐水，研成匀浆制成混悬液。

6．2 一般培养将上述混悬液吸取 5 mL，接种于 50 mL 葡萄糖肉浸液肉汤；或直接划线接种于血平板，如检样污染严重，可同时按上述量接种匹克氏肉汤，经 36±1℃培养 24 h，挑起乙型溶血圆形突起的细小菌落，在血平板上分纯，然后观察溶血情况及革兰氏染色，并进行链激酶试验及杆菌肽敏感试验。

6．3 形态与染色本菌呈球形或卵圆形，直径 0.5～1 μm，链状排列，链长短不一，短者4～8个细胞组成，长者 20～30 个，链的长短常与细菌的种类及生长环境有关；液体培养中易呈长链；在固体培养基中常呈短链，不形成芽孢，无鞭毛，不能运动。

一、实训目的1. 熟悉肠球菌属的生物学特性。

2. 掌握肠球菌属的分离、鉴定和药敏试验方法。

3. 培养微生物检验的基本技能和实验操作规范。

二、实训时间2023年4月15日三、实训地点微生物实验室四、实训材料1. 标本：尿液、脓汁、胆汁、分泌物或血液等。

2. 培养基：营养肉汤、血琼脂平板、叠氮胆汁七叶苷琼脂、麦康凯琼脂等。

3. 鉴定试剂：革兰染色液、触酶试剂、胆汁七叶苷试剂、6.5%NaCl耐受试验试剂等。

4. 药敏纸片：青霉素、氨苄西林、万古霉素、庆大霉素等。

5. 仪器设备：显微镜、恒温培养箱、高压蒸汽灭菌器、移液器等。

五、实训方法1. 标本采集与处理采集尿液、脓汁、胆汁、分泌物或血液等标本，按照无菌操作原则进行采集。

将标本接种于营养肉汤中，37℃恒温培养24小时。

2. 初步分离取培养后的肉汤，采用涂片、染色、镜检等方法进行初步分离。

观察菌落形态，选择可疑菌落进行进一步鉴定。

3. 鉴定（1）挑取可疑菌落，进行革兰染色、镜检，观察菌落形态。

肠球菌属为革兰阳性球菌，呈短链排列，卵圆形。

（2）进行触酶试验、胆汁七叶苷试验和6.5%NaCl耐受试验。

肠球菌属对触酶、胆汁七叶苷和6.5%NaCl具有耐受性。

（3）将可疑菌落接种于血琼脂平板，37℃恒温培养24小时。

观察菌落形态，判断溶血情况。

肠球菌属在血平板上为溶血或不溶血。

（4）对具有临床意义的肠球菌进行生化试验，如糖发酵试验、吲哚试验等，以鉴定到种。

4. 药敏试验将鉴定后的肠球菌接种于麦康凯琼脂平板，贴上青霉素、氨苄西林、万古霉素、庆大霉素等药敏纸片，37℃恒温培养24小时。

观察抑菌圈大小，判断菌种对药物的敏感性。

六、实训结果1. 标本采集与处理：成功采集到尿液、脓汁、胆汁、分泌物或血液等标本，并进行了接种培养。

2. 初步分离：从培养后的肉汤中分离出可疑菌落，进行革兰染色、镜检，形态符合肠球菌属。

3. 鉴定：经触酶试验、胆汁七叶苷试验和6.5%NaCl耐受试验，确定为肠球菌属。

《医学微生物学》三大常规的微生物学检查从临床标本中分离细菌的目的是为疾病的病原学做诊断，或查找与疾病相关的微生物，以及对抗生素的敏感性，这对于临床诊断、治疗、预后和进行流行病学调查是很有价值的。

因此，对临床标本的处理和检测应掌握以下原则。

1．临床标本的正确采集和处理对于疾病的正确诊断关系很大。

病人标本一般应在应用抗菌药物前采集。

对血液、脑脊液或穿刺液等标本，应严格按照无菌技术进行采集；对鼻咽拭子、肛拭子、粪便等标本，虽无须严格无菌操作，但也应尽量避免杂菌混入。

2．采集容器上应贴好送检号及病人姓名的标签，连同检验单一起尽早送检验室。

若路途较远，应冷藏保存送检；对脑膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌等特殊标本，送检时应35℃～37℃保温。

3．人体很多部位与外界相通，存在有正常菌群，但不致病，故在涂片检查或分离培养时，应区别标本中是常居菌群的污染还是致病菌。

另外，对某些无菌的部位，如血液、骨髓、脑脊液等，如检查出细菌应视为致病菌，但必须要排除采样及操作中的污染。

4．根据标本来源和可能存在的病原菌，选定各种分离培养基和孵育环境。

如痰标本一般选用血平板，用于化脓性链球菌、无乳链球菌、肺炎链球菌、白喉棒状杆菌等的分离。

【血液标本检查】正常人的血液是无菌的。

当细菌侵入血流并在其中生长繁殖，产生毒素等，可引起菌血症或败血症。

细菌学检验对其诊断和治疗具有极其重要的意义。

一、标本采集l．标本采集必须严格遵守无菌操作，即应去除皮肤上的细菌，又应注意空气中的细菌。

穿刺部位以碘酒、酒精棉球消毒，用干燥的灭菌注射器抽取血液，立即注入选定的液体培养基瓶内，充分混匀以防凝固。

2．采血一般应在治疗前，并在高热、寒战时作培养。

伤寒在发病一周内即菌血症期间采血；化脓性脑膜炎，鼠疫应在发热1～2d内采血；亚急性细菌性心内膜炎也宜于发热高峰采血或多次采血，且每隔1～2h采血一次，连续3～4次，可获较高的阳性率。

3．采血量应相当于培养液的1／10，通常是50ml培养液采血5ml，这样可使存在于血液中的补体、抗体、调理素、溶菌酶等抑制因子被稀释，使之减弱或失去抑制作用。

链球菌属及其检验「微生物检验」链球菌属(Streptococcus)细菌，呈链状排列的革兰阳性球菌，个别种成双排列。

广泛分布于自然界、人及动物肠道和健康人鼻咽部，大多数不致病，致病菌可引起各种化脓性炎症、猩红热、新生儿败血症、细菌性心内膜炎以及风湿热、肾小球肾炎等超敏反应性疾病。

下面是yjbys店铺为大家带来的关于链球菌属细菌的知识，欢迎阅读。

⒈分类链球菌的分类方法尚未统一。

常用下列两种方法。

⑴根据溶血现象：分为3类。

①甲型溶血性链球菌(α-hemolytic streptococcus)：菌落周围有1～2mm宽的草绿色溶血环，称甲型溶血或α溶血，该类菌又称草绿色链球菌，为条件致病菌。

②乙型溶血性链球菌(β-hemolytic streptococcus)：菌落周围有2～4mm宽的透明溶血环，称乙型溶血或β溶血，该类菌又称溶血性链球菌，致病性强，常引起人和动物多种疾病。

③丙型链球菌(γ-streptococcus)：菌落周围无溶血环，因而又称不溶血性链球菌，一般不致病。

⑵根据抗原结构：按链球菌细胞壁中多糖抗原不同，可分成A、B、C、D …等20个群。

同群链球菌间，因表面蛋白质抗原不同又分若干型。

如A群根据其M抗原不同，可分成约100个型;B群分4个型。

对人致病的链球菌菌株，主要是 A群，多数呈现乙型溶血。

⒉细菌特性⑴链球菌① 形态染色球形或椭圆形，直径0.5～1.0μm，链状排列，链的长短与细菌的种类和生长环境有关，在液体培养基中形成的链较长。

无芽胞，无鞭毛。

多数菌株在培养早期(2～4h)形成透明质酸的荚膜。

革兰染色阳性。

②分离培养要求较高，培养基中需加入血液或血清、葡萄糖、氨基酸、维生素等物质。

多数菌株兼性厌氧，少数为专性厌氧。

在液体培养基中呈沉淀生长，在血平板上，37℃18～24h后可形成灰白色、圆形、凸起、光滑、直径为0.5mm～0.75mm的细小菌落，菌落周围出现不同类型的溶血环。

③生化反应触酶阴性、一般不分解菊糖，不被胆汁溶解，这两特性可用来鉴别甲型溶血性链球菌和肺炎链球菌。

链球菌及肠球菌鉴定试剂使用说明书 3.4【原理】：本试剂盒用于体外标本中细菌（链球菌及肠球菌）的鉴别培养。

【试剂盒组成】：① 10或20个鉴定板(培养基) ② 10或20张结果记录单。

③操作说明书1份【本试剂盒所需显色试剂及配制方法】： VPⅠ：5% α-萘酚无水乙醇溶液。

VPⅡ：40% KOH水溶液。

【贮存及效期】：2-8℃贮存，效期见外标签。

【操作】：1.菌落的选择●根据革兰氏染色，触酶等确定菌株属链球菌科。

记录溶血类型（这组成第22个测试结果）。

●挑取单个菌落在哥伦比亚羊血琼脂平板上均匀涂抹整个表面。

(如疑为肺炎链球菌应涂2个平板最合适)●根据菌株生长条件在厌氧或好氧条件下于35-37℃培养18-24小时。

注：一般菌在培善24小时后可产生足够大的菌落。

有些菌落太小应培养48小时后才选择菌落。

对营养苛求菌(在48小时后只产生小菌落)，应将培养菌落种于1ml增菌培养基中，置35-37℃培养5小时。

用整个培养物注入哥伦比亚羊血琼脂平板上。

2.接种●取出试验板条，平衡于室温。

在鉴定试条伸出的边沿处标上菌株编号。

●取无菌蒸馏水3ml，将培养18-24小时的目的菌洗脱下来,制成菌悬液，使其浊度相当于4号McFarland标准浊度。

●将调制好的菌悬液按每孔100ul，加入试验板条中。

除VP孔外，每孔滴加液体石蜡2滴覆盖。

（为防止VP孔蒸干，可在未加试剂的三个孔中各加蒸馏水100-200ul）●盖上盖子，放35～37℃孵育18～24小时，取出按判读标准判读自然发生的结果和加入反应试剂后出现的结果（滴加VP试剂于相应孔中观察），并记录在记录单上。

●将反应结果输入计算机BIO-KONT STREP软件得到鉴定结果。

使用后的所有的玻璃管、玻璃片、吸头、试条及试验纸条等均须高压灭菌处理。

【质量控制】：为保证试验条的质量试验板条启封后应保持干燥，尽量无菌操作。

BIO-KONT STREP试剂盒的质量检查推荐用以下菌株进行。