原位杂交操作流程

原位杂交操作流程

1、使用地高辛标记的核酸探针进行石蜡切片的RNA原位杂交第一天

1) 二甲苯于37°C脱蜡2次，每次15分钟；

2) 无水乙醇浸泡2次，每次3分钟；

3) 95%乙醇浸泡2次，每次3分钟；

4) PBS清洗3分钟；

5) 2%焦碳酸二乙酯室温下浸泡10分钟；

6) PBS清洗10分钟；

7) 加入胃蛋白酶25ul/ml,37°C孵育15分钟；

8) PBS清洗2次，每次3分钟；

9) 0.2N的HCl孵育30分钟；

10) PBS清洗2次，每次3分钟；

11) 0.25%无水乙酸和0.1M三乙醇胺孵育10分钟；

12) PBS清洗2次，每次5分钟；

13) 预杂交缓冲液孵育30分钟；

14) 准备核酸探针混合物：使用预杂交缓冲液稀释探针，85°C加热5分钟，置于冰块中10分钟；

15) 杂交；第二天

16) 将玻片置于SSC中2次，每次5分钟以去除封片；

17) PBS清洗3分钟；

18) RNA酶A溶液中(或0.1-1ng/mlPBS中)，37°C孵育30分钟；

19) PBS清洗5分钟；

20) 室温，2XSSC清洗10分钟；

21) 37°C，1XSSC清洗10分钟；

22) 37°C，0.5XSSC清洗10分钟；

23) 缓冲液A孵育10分钟；

24) 缓冲液A(1%正常绵羊血清和0.03%三重氢核X-100)孵育30分钟；

25) 加入抗地高辛抗体(1/200的上述缓冲液，来自BoehringerMannheim)，37°C孵育3小时；

26) 缓冲液A清洗2次，每次10分钟；

27) 缓冲液B清洗2次，每次5分钟；

28) 制成NBT/BCIP暗处保存30-60分钟，显微镜下进行观察，如果背景尚佳，显色时间可延长到16小时;

29) 停止缓冲液B的反应，用水进行简单的清洗；

30) 固红，脱水以及封片进行核的复染。

2、使用地高辛标记的寡核苷酸探针进行石蜡切片的原位DNA杂交第一天

1) 二甲苯于37C脱蜡2次，每次15分钟；

2) 无水乙醇浸泡2次，每次5分钟；

3) 95%乙醇浸泡2次，每次5分钟；

4) PBS清洗5分钟；

5) 2%焦碳酸二乙酯室温下浸泡10分钟；

6) PBS清洗5分钟；

7) 加入胃蛋白酶25ul/ml，37C孵育10分钟；

8) PBS清洗2次，每次5分钟；

9) 0.2N的HCl孵育30分钟； 10) PBS清洗2次，每次5分钟；

11) 0.25%无水乙酸和0.1M三乙醇胺孵育10分钟；

12）PBS清洗5分钟；

13）预杂交缓冲液孵育30分钟；

14）准备寡核苷酸探针混合物：使用预杂交缓冲液稀释探针；

15）杂交；第二天

16）将玻片置于SSC中以去除封片；

17）室温，2XSSC清洗10分钟；

18）37°C,1XSSC清洗10分钟；

19）37°C,0.5XSSC清洗10分钟；

20）缓冲液A孵育10分钟；

21）缓冲液A孵育30分钟；

22）加入抗地高辛抗体37C孵育3小时；

23）缓冲液A清洗2次，每次5分钟；

24）缓冲液B清洗2次，每次5分钟；

25）制成NBT/BCIP暗处保存30-60分钟，显微镜下进行观察，如果背景尚佳，显色时间可长到16小时；

26）停止缓冲液B的反应，用水进行简单的清洗；

27）固红，脱水以及封片进行核的复染。

FISH步骤

1、脱蜡：

1）二甲苯脱蜡3次，每次5min；

2）100％酒精两次，每次2min；

3）移出酒精，斜置切片，标记末段向下，空气干燥。

2、蛋白酶处理:

1）每个染色缸40ml蛋白酶K消化溶液，配制方法如下：2xSSC40ml倒人Facal管,在水浴槽中预热。将消化酶液加入管内，摇动直到酶溶解。

2）37C水浴槽中预热染色缸和蛋白酶K溶液。37C孵育20min。

3）xSSC在室温下漂洗切片3次，每次Imino

4）梯度酒精脱水（-20C预冷）

3、变性：

1）每一个立式染色缸配制40ml变性溶液；

2）78C水浴槽中平衡预热混合液染色缸；

3）78C孵育8min；

4）即移入-20C预冷70%酒精的染色缸内2min，再依次移入80%、90%和100%的-20C预冷酒精内，每缸

2min；

5）空气干燥。

4、杂交：

1）准备探针；

2）取一个较大的湿盒，交叉放置切片；

3）滴10gl探针在切片的组织上，加盖玻片；

4）盖上湿盒盖，37C孵育12h〜16h°

杂交后的水洗： 5）镊子小心去除盖玻片；

6）43C预热杂交后水洗溶液40ml水洗切片15min；

7）2xSSC（37°C）洗两次，每次10min；

8）切片放人染色缸的1xPBS内待检测，勿使切片干燥。

检测：

9）从lxPBS中取出切片，除去过多的水分，避免标本干燥。把切片放入湿盒内，同时处理4张切片。

10）每张切片使用30皿〜60皿罗丹明抗-地高辛抗体或FITC卵白素，室温下孵育20min；

11）去掉塑料盖膜，把切片放入含lxPBS的染色缸。lxPBS室温下洗3次，每次2min。扩增：

12）从lxPBS中取出切片，斜置切片使液体排出；

13）每张切片滴30皿〜60皿抗-卵白素抗体，加塑料盖膜，室温孵育20min；

14）去掉塑料盖膜，把切片放人含1xPBS的染色缸。1xPBS室温下洗3次，每次2min；

15）从1xPBS中取出切片，斜置切片使液体排出；

16）每张切片滴30皿〜60皿抗-卵白素抗体，加塑料盖膜，室温孵育20min；

17）1xPBS室温下洗3次，每次2min。

5、细胞核染色：

1）张切片加10皿〜20皿DAPI，覆盖盖玻片并在室温下孵育2〜5ml；

2）尽可能快的在荧光显微镜下观察或封闭盒内保存在-20°C冰箱。切片在染色之后1h内可以在显微镜下观察。

地高辛标记寡核苷酸探针

1．组织处理

（1）冷冻切片：厚10〜20um，贴于事先经清洁处理及涂有粘附剂的切片上。切片保存于-80C，在应用于杂交实验前，使迅速回升到室温，干燥，固定于3%多聚甲醛-PBS溶液中，pH7.4。PBS漂洗5minX3,孵育在2XSSc10min。

（2）石蜡包埋切片：浸入二甲苯10min移除石蜡，以100%乙醇10minX2，空气干燥10min，从高到低梯度乙醇（95%，80%，70%）1min/每个浓度°PBs5minX3，孵育在2XSSc10min。

（3）离心细胞涂片：将细胞先以4%多聚甲醛固定，应用离心沉淀法，将沉淀物涂于有粘附剂的载片上，应用PBS（含5mmol/lMgCl2）5minX3漂洗。在0.1mol/L三乙醇胺含0.25%（V/V）乙酸酐10min。在0.2mol/lTris-HCl含（0.1mol/L甘氨酸）pH7.410min。孵育在2XSSc10min。

2•探针准备35pmol的寡核苷酸（oligo-）探针，3'终末标记以地高辛-11-dUTP。

3. 预杂交和杂交加约300ul预杂交液（配制法见附录）在每张载片上，室温孵育1h。如为鲱鱼精子DNA，在应用前须在沸水浴中加热10min，而对酵母tRNA可不用加热变性。

（1）应用预杂交液稀释地高辛标记的Oligo-探针，探针理想工作浓度根据于待测核苷酸含量和实践的结果。如对于检测大鼠垂体的前促黑激素（proopiomelanocortin,POMC）mRNA的Oligo-探针，其理想工作浓度为342ng/ml（0.342ng/ul）o

（2）预杂交后以2XSSC漂洗，以吸水纸拭干切片周围水份，加30卩l杂交液在切片上，加硅化盖玻片，在37C过夜。如探针大于36碱基则杂交温度为42C。次日室温2XSSC液漂洗切片1h，1XSSC漂洗切片1h（室温），0.5XSSc37C洗半小时，0.5XSSC室温漂洗半小时。

4. 地高辛显示。 地高辛标记cRNA探针

1•组织前处理在组织制片中以冷冻切片（厚10〜30um）最佳。切片贴在预先清洁，高温处理并涂以粘附剂载玻片上，先在37C预干燥4h，然后置于37C烤箱中过夜。经过上述处理的切片如在-20C可保存2〜3周，在-70°C可保存数月之久，有报告可保存数年之久的。但仍以新鲜制片为好。如为石蜡包埋切片，应脱蜡经梯度酒精入水。一般不提倡浸入二甲苯溶液。但在细胞内mRNA含量高时应用二甲苯脱蜡后仍能显示。经水洗后入37C烤箱4h或过夜，然后进行杂交前处理。

在烘烤及低温保存时，为防尘埃及空气中RNA酶的污染，宜用锡箔纸(foilpaper)包被，内加少许干燥剂(变色硅胶)。

下列步骤所需玻璃器皿均需消毒，操作者需戴手套。

(1) PBS洗2X3min。

(2) 选择少数几张切片作为“RNA酶对照片”。其它切片暂放于PBs内。

RNA酶对照片处理方法：加RNA酶(100ug/ml)在预热37C的溶液内。放在潮湿的盛有少许2XSSC塑料盒或蒸发皿内。在每张切片上覆以过量的RNA酶溶液，在37C孵育30min后用2XSSC冲洗，2X3min，然后与其它保存在PBS的切片一起进行下列处理。

(3) 蛋白酶K消化：将组织切片放在O.lmol/lTris/50mmo/LEDTApH8.0，内含蛋白酶Klug/ml，孵育15〜20min。消化时间应根据组织的种类，厚度反复试验调整。时间过短探针不易进入，过长影响细胞或组织的形态结构。

(4) 0.1mol/L甘氨酸/PBs5min终止蛋白激酶K反应。0.25%乙酸酐(0.1mol/l三乙醇胺配制)lOmin。

(5) 在4%多聚甲醛/PBS3min。

(6) 以PBs漂洗2X3mino

(7) 浸入新鲜配制的0.25%乙酸酐(O.lmol/L三乙醇胺配制)lOmin，以封闭非特异性结合部位。

(8) 2XSSC漂洗15mino

2. 杂交以含cRNA探针(0.5ng/ml)的杂交液，按每张切片10〜2卩l的量覆盖切片。地高辛配基标记的cRNA核酸探针保存浓度为2.5ng/ml，用前稀释备用。覆以硅化盖玻片或塑料蜡膜，置于盛有少量2XSSC温盒内在42C，16〜18h或过夜。

3. 显示

(1) 用缓冲液1冲洗杂交后的载片2X3mino

(2) 在缓冲液1中10min，室温以封闭非特异性结合部位。

(3) 拭干切片周围的载片，注意保持切片湿润。加数滴抗地高辛抗血清(工作浓度1：500，以缓冲液1稀释)，孵育2h，室温。

(4) 缓冲液1漂洗3X3mino

(5) 浸入缓冲液210min室温。

(6) 浸入底物中孵育10〜30min(或更长时间，视需要而定)，底物内含显色BCIP/NBT，室温。最好用锡箔纸包裹反应盒，使显色在黑暗中进行。定期取出切片在显微镜下检测反应强度。根据反应强度决定延长或终止反应。反应颜色为紫蓝色。

(7) 将切片浸入缓冲液3以终止反应。

(8) 复染，可用1%伊红、1%苏木精、1%亮绿或5%的焦宁(又称派咯宁丫)(pyronin丫)10〜30s。

(9) 流水洗5〜10min，直至水无色为止。

(10) 在切片未干前，以PBS/甘油封固切片，如要永久保存，可以用DPX在盖片四周封固。为去除水份，在封固前可进行梯度酒精脱水，透明，DPX封固，但每步时间仅需几秒钟，时间过长易致褪色。