原位杂交原理及具体操作

荧光原位杂交技术（FISH）的基本原理及应用

我接触“FISH”也是刚刚两年多的时间，作为一个“初学者”刚开始接触“FISH”可能跟大多数人一样满脑子的疑惑：“FISH”是做什么的?有什么临床作用呢?那些红红绿绿的点都是些什么意思?……今天让我们慢慢的去揭开FISH的不太神秘的面纱。

1.FISH的前世今生

在FISH技术问世之前，基于20世纪60年代，放射性核素探针的原位杂交方法，检测间期染色体和分裂期染色体上特定DNA和RNA序列的方法，该方法存在操做比较麻烦、分辨率有限、探针不稳定、放射性同位素的危害较高等问题，故目前弃之不用。20世纪80年代用非放射性半抗原如生物素进行核酸标记的技术逐渐开展后，探针也开始使用这种非放射性标记方法。随后FISH技术逐渐开展起来，1986年以后该技术被应用于分析细胞分裂期染色体铺片的DNA序列。相对于放射性来说，FISH具有稳定性好、操作安全、结果迅速、空间定位准确、干扰信号少、一张玻片可以标记多种颜色探针等优点。这些优点逐渐使FISH成为一种研究分子细胞遗传学很好的方法。

FISH即染色体荧光原位杂交(Flourescence in situ

hybridization,FISH)是通过荧光素标记的DNA探针与样本细胞核内的DNA靶序列杂交，从而获得细胞核内染色体或基因状态的信息。FISH是将传统的细胞遗传学同DNA技术相结合，开创了一门新的学科——分子细胞遗传学。（如下图所示)

2.FISH信号解读-红红绿绿是什么

目前临床上用于FISH检测的探针的荧光素大都是绿色的和橙红色标记，可大致分为：染色体计数(着丝粒)探针(centromere-enumeration probes，CEP)，位点特异性识别探针(locus-specific

identifier probes，LSI)，染色体涂染(paint，WCP)探针。其中CEP和LSI探针中的计数探针、融合探针及分离重排探针，在血液病诊断与预后分型中最为常用。比如骨髓增生异常综合征(MDS)中8号染色体数目会增加;又或者多发性骨髓瘤(MM)中IGH基因的结构重排和AML-M3中的PML/RARA融合基因。检测的结果可以是扩增、缺失、融合、断裂等。

酵母双杂交系统

1．原理

酵母双杂交系统的建立得力于对真核细胞调控转录起始过程的认识。研究发现，许多真核生物的转录激活因子都是由两个可以分开的、功能上相互独立的结构域(domain)组成的。例如，酵母的转录激活因子GAL4，在N端有一个由147个氨基酸组成的DNA结合域(DNA binding domain,BD)，C端有一个由113个氨基酸组成的转录激活域(transcription activation domain,AD)。GAL4分子的DNA结合域可以和上游激活序列(upstream activating sequence，UAS)结合，而转录激活域则能激活UAS下游的基因进行转录。但是，单独的DNA结合域不能激活基因转录，单独的转录激活域也不能激活UAS的下游基因，它们之间只有通过某种方式结合在一起才具有完整的转录激活因子的功能。

2．试验流程

酵母双杂交系统正是利用了GAL4的功能特点，通过两个杂交蛋白在酵母细胞中的相互结合及对报告基因的转录激活来捕获新的蛋白质，其大致步骤为:

2．1、视已知蛋白的cDNA序列为诱饵(bait)，将其与DNA结合域融合，构建成诱饵质粒。

2．2、将待筛选蛋白的cDNA序列与转录激活域融合，构建成文库质粒。

2．3、将这两个质粒共转化于酵母细胞中。

2．4、酵母细胞中，已分离的DNA结合域和转录激活域不会相互作用，但诱饵蛋白若能与待筛选的未知蛋白特异性地相互作用，则可激活报告基因的转录；反之，则不能。利用4种报告基因的表达，便可捕捉到新的蛋白质。

3．特点

优点

蛋白--蛋白相互作用是细胞进行一切代谢活动的基础。酵母双杂交系统的建立为研究这一问题提供了有利的手段和方法。

缺点

尽管该系统己被证实为一种非常有效的方法，但它也有自身的缺点和问题。1、它并非对所有蛋白质都适用，这是由其原理所决定的。双杂交系统要求两种杂交体蛋白都是融合蛋白，都必须能进入细胞核内。因为融合蛋白相互作用激活报告基因转录是在细胞核内发生的。2、假阳性的发生较为频繁。所谓假阳性，即指未能与诱饵蛋白发生作用而被误认为是阳性反应的蛋白。而且部分假阳性原因不清，可能与酵母中其他蛋白质的作用有关。3、在酵母菌株中大量表达外源蛋白将产生毒性作用，从而影响菌株生长和报告基因的表达。

荧光原位杂交（FISH）

1.样品处理与固定(约4h，可提前准备)

（1）用纯水清洗样品数次，加1×PBS，涡旋悬浮样品，离心（2000r/min）5min

弃去上清液；

（2）在样品中加入4%多聚甲醛（终浓度4%），置于4℃固定3小时左右；

（3）离心（12000r/min）5min，弃去上清液；

（4）加1×PBS摇匀清洗3次，离心（10000r/min）5min弃去上清液；

（5）加0.5mL1×PBS和0.5mL乙醇，重悬样品，-20℃可保存6个月。2.载玻片涂层处理（约2.5h，可提前准备）

（1）将载玻片用盐酸乙醇溶液中（1份盐酸2份乙醇）浸洗10min，然后用自

来水水充分清洗，再用纯水清洗2-3遍，100%乙醇中贮存备用；

（2）拿出玻片晾干后，滴一滴poly-L-lysine（0.1mg/mL）溶液于载玻片上，覆

盖样品孔，室温放置10-30min分钟；

（3）吸去多余的溶液，用无菌水冲洗表面数次；

（4）接种前至少室温干燥1小时或过夜晾干。3.透化与脱水（约1h）

现配proteinasekbuffer：50mL1MTris/HCl0.5mL0.5MEDTA1mL

5MNaCl1mL10%SDS2.5mL

ddH2Oto50mLpro.k(20mg/mL)25μL

（1）取适量固定后样品于载玻片上（可提前超声破碎），放入46℃孵育箱中烘

干10分钟；

（2）将样品浸入蛋白酶k缓冲液中，37℃，20min，然后浸入灭菌水中清洗3

次，每次1min。

（3）再依次浸入50%、80%、100%乙醇中脱水，每次3min，最后在空气中晾

干。4.杂交（约2h）

（1）加9μL杂交缓冲液到载玻片的样品上，尽量让样品全被覆盖；

（2）（此步之后，保证样品充分避光）在杂交缓冲液上加1μL探针（终浓度5ng/μL）；

（3）将载玻片水平放在有2×SSC的湿盒中，盖盖，然后一起放入46℃孵育箱

中，杂交1.5小时；

（4）将冲洗缓冲液预热到48℃，备用。5.冲洗（约1h）

简述原位杂交的原理及应用

1. 原位杂交的原理

原位杂交是一种基因组杂交技术，它可以用来研究基因组的组成、结构和功能。原位杂交的原理是通过将一组标记有探针的DNA片段与目标DNA样品进行杂交反应，然后使用适当的探针检测方法来识别和定位目标DNA序列。原位杂交的基本原理包括以下几个步骤：

1. DNA探针制备：3’-OH末端标记方法和末端标记方法是两种常用的DNA探针标记方法。常用的标记有生物素、荧光物质等。

2. DNA杂交反应：将标记好的DNA探针与目标DNA样品进行杂交反应。杂交反应的温度、时间以及混合物的浓度需要根据具体实验目的进行优化。

3. 杂交后的探针检测：可以使用放射性同位素标记、荧光染料标记等方法对杂交后的DNA探针进行检测，以确定杂交反应是否成功。

4. 观察和分析：通过显微镜等工具观察杂交结果，并对杂交位点进行定位和分析，获取目标DNA序列的位置和数量。

2. 原位杂交的应用

2.1. 基因组结构研究

原位杂交技术可以用来研究基因组的结构，包括基因的数量、排列、序列和重组等信息。通过特定的探针标记和杂交反应，可以对基因组进行定位和分析，帮助了解基因组的组成和结构。

2.2. 染色体显带分析

原位杂交被广泛应用于染色体显带分析领域。通过核酸探针的杂交，可以识别和鉴定染色体上的特定DNA序列，从而确定染色体的结构和功能。这对于检测染色体异常和疾病的相关基因有着重要意义。

2.3. 基因定位和图谱构建

原位杂交可用于基因定位和构建基因图谱。通过使用特定的探针标记和杂交方法，可以将目标基因定位到染色体上的特定区域，并确定其在染色体上的位置。这为进一步研究基因的功能和相互作用提供了基础。 2.4. 个体识别和物种鉴定

原位杂交技术可用于个体识别和物种鉴定。通过探针的杂交反应，可以确定个体或物种特定基因的存在与否，从而进行个体识别和物种鉴定的工作。

2.5. 植物杂交育种

原位杂交可以应用于植物杂交育种领域。通过对目标植物基因组的杂交分析，可以鉴定合适的亲本植物并进行精确的杂交操作。这有助于提高植物育种的效率和精准性。