原位杂交操作流程

原位杂交操作流程

1、使用地高辛标记的核酸探针进行石蜡切片的RNA原位杂交第一天

1） 二甲苯于37℃脱蜡2次，每次15分钟;

2） 无水乙醇浸泡2次，每次3分钟;

3） 95%乙醇浸泡2次，每次3分钟;

4） PBS清洗3分钟；

5) 2％焦碳酸二乙酯室温下浸泡10分钟;

6） PBS清洗10分钟；

7） 加入胃蛋白酶25ul/ml，37℃孵育15分钟；

8） PBS清洗2次，每次3分钟;

9） 0。2N的HCl孵育30分钟；

10)PBS清洗2次，每次3分钟;

11）0。25％无水乙酸和0.1M三乙醇胺孵育10分钟；

12）PBS清洗2次，每次5分钟；

13）预杂交缓冲液孵育30分钟；

14）准备核酸探针混合物：使用预杂交缓冲液稀释探针，85℃加热5分钟，置于冰块中10分钟；

15）杂交；第二天

16）将玻片置于SSC中2次，每次5分钟以去除封片;

17）PBS清洗3分钟；

18）RNA酶A溶液中（或0.1—1ng/mlPBS中)，37℃孵育30分钟;

19）PBS清洗5分钟；

20）室温,2×SSC清洗10分钟；

21）37℃,1×SSC清洗10分钟；

22)37℃，0。5×SSC清洗10分钟；

23）缓冲液A孵育10分钟;

24）缓冲液A（1％正常绵羊血清和0。03％三重氢核X-100）孵育30分钟;

25)加入抗地高辛抗体（1/200的上述缓冲液,来自Boehringer Mannheim），37℃孵育3 小时；

26）缓冲液A清洗2次,每次10分钟；

27)缓冲液B清洗2次,每次5分钟;

28)制成NBT/BCIP暗处保存30—60分钟,显微镜下进行观察，如果背景尚佳，显色时间可延长到16小时;

29）停止缓冲液B的反应,用水进行简单的清洗；

30）固红，脱水以及封片进行核的复染。

2、使用地高辛标记的寡核苷酸探针进行石蜡切片的原位DNA杂交第一天

1） 二甲苯于37℃脱蜡2次，每次15分钟；

2） 无水乙醇浸泡2次，每次5分钟；

3) 95％乙醇浸泡2次，每次5分钟；

4) PBS清洗5分钟；

5） 2％焦碳酸二乙酯室温下浸泡10分钟；

6) PBS清洗5分钟；

7） 加入胃蛋白酶25ul/ml,37℃孵育10分钟；

8） PBS清洗2次,每次5分钟；

9） 0.2N的HCl孵育30分钟；

10)PBS清洗2次，每次5分钟；

11）0.25％无水乙酸和0。1M三乙醇胺孵育10分钟; 12）PBS清洗5分钟；

13)预杂交缓冲液孵育30分钟；

14)准备寡核苷酸探针混合物：使用预杂交缓冲液稀释探针;

15）杂交；第二天

16）将玻片置于SSC中以去除封片；

17）室温，2×SSC清洗10分钟；

18）37℃,1×SSC清洗10分钟；

19）37℃，0。5×SSC清洗10分钟；

20)缓冲液A孵育10分钟；

21）缓冲液A孵育30分钟；

22）加入抗地高辛抗体37℃孵育3小时;

23）缓冲液A清洗2次，每次5分钟；

24）缓冲液B清洗2次，每次5分钟；

25）制成NBT/BCIP暗处保存30-60分钟，显微镜下进行观察，如果背景尚佳，显色时间可长到16小时；

26）停止缓冲液B的反应，用水进行简单的清洗；

27）固红,脱水以及封片进行核的复染。

FISH步骤

1、脱蜡：

1)二甲苯脱蜡3次,每次5min;

2）100%酒精两次，每次2min；

3）移出酒精，斜置切片,标记末段向下，空气干燥。

2、蛋白酶处理：

1）每个染色缸40ml蛋白酶K消化溶液，配制方法如下：2×SSC 40ml倒人Facal管，在水浴槽中预热.将消化酶液加入管内,摇动直到酶溶解。

2) 37℃水浴槽中预热染色缸和蛋白酶K溶液.37℃孵育20min。

3） ×SSC在室温下漂洗切片3次，每次1min。

4）梯度酒精脱水（—20℃预冷）.

3、变性：

1）每一个立式染色缸配制40ml变性溶液;

2）78℃水浴槽中平衡预热混合液染色缸;

3)78℃孵育8min；

4） 即移入—20℃预冷70%酒精的染色缸内2min,再依次移入80%、90％和100%的-20℃预冷酒精内,每缸2min；

5）空气干燥。

4、杂交:

1)准备探针；

2)取一个较大的湿盒，交叉放置切片;

3)滴10μl探针在切片的组织上，加盖玻片；

4）盖上湿盒盖，37℃孵育12h～16h。

杂交后的水洗：

5)镊子小心去除盖玻片；

6)43℃预热杂交后水洗溶液40ml水洗切片15min;

7）2×SSC（37℃)洗两次,每次10min；

8)切片放人染色缸的1×PBS内待检测,勿使切片干燥. 检测:

9）从1×PBS中取出切片，除去过多的水分,避免标本干燥。把切片放入湿盒内,同时处理4张切片。

10）每张切片使用30μl～60μl罗丹明抗—地高辛抗体或FITC卵白素，室温下孵育20min；

11）去掉塑料盖膜，把切片放入含1×PBS的染色缸.1×PBS室温下洗3次，每次2min.

扩增：

12）从1×PBS中取出切片，斜置切片使液体排出;

13）每张切片滴30μl～60μl抗—卵白素抗体，加塑料盖膜，室温孵育20min；

14）去掉塑料盖膜，把切片放人含1×PBS的染色缸。1×PBS室温下洗3次，每次2min；

15）从1×PBS中取出切片，斜置切片使液体排出；

16）每张切片滴30μl～60μl抗-卵白素抗体，加塑料盖膜，室温孵育20min；

17）1×PBS室温下洗3次，每次2min。

5、细胞核染色：

1）张切片加10μl~20μl DAPI,覆盖盖玻片并在室温下孵育2～5ml；

2）尽可能快的在荧光显微镜下观察或封闭盒内保存在-20℃冰箱。切片在染色之后1h内可以在显微镜下观察.

地高辛标记寡核苷酸探针

1．组织处理

（1）冷冻切片：厚10～20μm，贴于事先经清洁处理及涂有粘附剂的切片上。切片保存于-80℃，在应用于杂交实验前，使迅速回升到室温，干燥，固定于3％多聚甲醛-PBS溶液中,pH7。4.PBS漂洗5min×3，孵育在2×SSc 10min。

（2）石蜡包埋切片：浸入二甲苯10min移除石蜡，以100%乙醇10min ×2，空气干燥10min,从高到低梯度乙醇（95％，80%,70%)1min/每个浓度。PBs 5min×3，孵育在2×SSc 10min.

(3)离心细胞涂片：将细胞先以4%多聚甲醛固定,应用离心沉淀法，将沉淀物涂于有粘附剂的载片上,应用PBS(含5mmol/l MgCl2）5min×3漂洗.在0。1mol/L三乙醇胺含0。25％（V/V）乙酸酐10min.在0.2mol/l

Tris –HCl 含（0。1mol/L甘氨酸）pH7。410min。孵育在2×SSc 10min。

2．探针准备35pmol的寡核苷酸（oligo —)探针，3’ 终末标记以地高辛—11–dUTP。

3．预杂交和杂交加约300μl预杂交液（配制法见附录）在每张载片上，室温孵育1h。如为鲱鱼精子DNA，在应用前须在沸水浴中加热10min，而对酵母tRNA可不用加热变性.

（1）应用预杂交液稀释地高辛标记的Oligo-探针，探针理想工作浓度根据于待测核苷酸含量和实践的结果。如对于检测大鼠垂体的前促黑激素（proopiomelanocortin，POMC）mRNA的Oligo –探针，其理想工作浓度为342ng/ml(0。342ng/μl）。

（2）预杂交后以2×SSC漂洗,以吸水纸拭干切片周围水份,加30μl杂交液在切片上，加硅化盖玻片，在37℃过夜。如探针大于36碱基则杂交温度为42℃.次日室温2×SSC液漂洗切片1h，1×SSC漂洗切片1h（室温)，0。5×SSc 37℃洗半小时，0.5×SSC室温漂洗半小时。

4．地高辛显示。

地高辛标记cRNA探针

1．组织前处理在组织制片中以冷冻切片（厚10~30μm）最佳。切片贴在预先清洁,高温处理并涂以粘附剂载玻片上,先在37℃预干燥4h，然后置于37℃烤箱中过夜.经过上述处理的切片如在—20℃可保存2～3周,在-70℃可保存数月之久，有报告可保存数年之久的。但仍以新鲜制片为好。如为石蜡包埋切片,应脱蜡经梯度酒精入水。一般不提倡浸入二甲苯溶液。但在细胞内mRNA含量高时应用二甲苯脱蜡后仍能显示。经水洗后入37℃烤箱4h或过夜，然后进行杂交前处理.

在烘烤及低温保存时，为防尘埃及空气中RNA酶的污染，宜用锡箔纸（foilpaper）包被，内加少许干燥剂（变色硅胶）。

下列步骤所需玻璃器皿均需消毒，操作者需戴手套.

（1）PBS洗2×3min.

（2）选择少数几张切片作为“RNA酶对照片”.

其它切片暂放于PBs 内。

RNA酶对照片处理方法：加RNA酶(100μg/ml）在预热37℃的溶液内.放在潮湿的盛有少许2×SSC塑料盒或蒸发皿内。在每张切片上覆以过量的RNA酶溶液,在37℃孵育30min后用2×SSC冲洗，2×3min，然后与其它保存在PBS的切片一起进行下列处理。

（3）蛋白酶K消化：将组织切片放在0。1mol/l Tris/50mmo/L EDTA pH8.0，内含蛋白酶K1μg/ml，孵育15～20min。消化时间应根据组织的种类，厚度反复试验调整。时间过短探针不易进入，过长影响细胞或组织的形态结构.

（4)0.1mol/L甘氨酸/PBs 5min终止蛋白激酶K反应。0.25%乙酸酐（0.1mol/l 三乙醇胺配制）10min.

(5）在4％多聚甲醛/PBS3min。

（6）以PBs 漂洗2×3min。

（7）浸入新鲜配制的0。25％乙酸酐（0.1mol/L三乙醇胺配制）10min,以封闭非特异性结合部位。

（8）2×SSC漂洗15min。

2．杂交以含cRNA探针（0。5ng/ml）的杂交液,按每张切片10～2μl的量覆盖切片。地高辛配基标记的cRNA核酸探针保存浓度为2.5ng/ml，用前稀释备用。覆以硅化盖玻片或塑料蜡膜，置于盛有少量2×SSC温盒内在42℃，16～18h或过夜。

3．显示

（1)用缓冲液1冲洗杂交后的载片2×3min.

（2）在缓冲液1中10min,室温以封闭非特异性结合部位.

（3）拭干切片周围的载片,注意保持切片湿润.加数滴抗地高辛抗血清（工作浓度1:500，以缓冲液1稀释），孵育2h，室温。

（4)缓冲液1漂洗3×3min。

（5）浸入缓冲液210min室温.

(6）浸入底物中孵育10～30min（或更长时间，视需要而定），底物内含显色BCIP/NBT,室温。最好用锡箔纸包裹反应盒,使显色在黑暗中进行。定期取出切片在显微镜下检测反应强度。根据反应强度决定延长或终止反应。反应颜色为紫蓝色.

(7）将切片浸入缓冲液3以终止反应。

（8）复染，可用1％伊红、1%苏木精、1%亮绿或5%的焦宁（又称派咯宁丫）（pyronin 丫）10~30s.

(9）流水洗5～10min，直至水无色为止。

（10）在切片未干前,以PBS/甘油封固切片，如要永久保存,可以用DPX在盖片四周封固。为去除水份，在封固前可进行梯度酒精脱水，透明，DPX封固，但每步时间仅需几秒钟,时间过长易致褪色。