原位分子杂交的基本过程

荧光原位杂交 操作

荧光原位杂交（FISH）是一种基因组学的技术，它使用荧光探针将特定的DNA序列定位在染色体上。这种技术被广泛用于分析染色体的结构和功能，以及人类基因组变异和疾病的研究。本文将介绍荧光原位杂交操作的步骤。

步骤1：样品制备

FISH技术可以应用于不同种类的样本，如人类细胞、动植物组织等。对于人类细胞的样本，常用的方法是将细胞分离，制作成染色体悬液。

首先要通过荧光染色法把两种不同的染色体和特定的基因序列染成不同的颜色。这需要用到已知基因序列的探针，可以从已有的文献中获取。如果没有，可以通过设计和合成新的探针。

步骤2：制作探针

FISH探针是由一段DNA片段制成的。这个片段可用PCR方法从DNA中扩增出来，或者可以通过化学合成的方法制造。制造探针时需要注意，探针的长度和序列应该与目标序列相匹配，可以通过BLAST或其他基因数据库检索确认。

通常使用荧光染料标记探针，以便在镜头下观察到探针的定位。常用的标记分子有荧光素（FITC），荧光素同路胺（rhodamine）和锔（Cy3和Cy5）。这些分子的选择取决于探针和荧光显微镜系统的兼容性。

在制作FISH探针时，需要注意探针的特异性和灵敏度。为了达到这一目的，需要经过一系列的标记、纯化和探针肢解操作。

探针一般都是双链DNA，通过加入单链转化酶（S1）或DNA酶I，使双链DNA变成单链DNA，并标记在其5'-末端上。标记完成后，进行染色体裂解、脱氧核糖核苷酸（dNTP）和DNA聚合酶的反应来进行回收和标记探针，以免对染色体质量产生影响。对于高复杂度的基因组，可以使用克隆探针阵列，在单个染色体上定位多个序列。

步骤4：染色体固定和前处理

将样本固定在载玻片上，这可以是用乙醛和甲醛等固定剂进行固定。将载玻片上的样本通过逐步浸入水，逐步替换固定样本中的有机溶剂来除去样本中的RNA，然后用类碱/类酸（如乙酸/氯化锂，0.1M Na丙二酸缓冲pH 9.0）进行前处理，以增加荧光探针的穿透率，使其更好地结合DNA的目标序列。

原位核酸分子杂交技术

原位核酸分子杂交技术简称原位杂交(in situ hybridization ISH)是应用已知碱基顺序并

带有标记物的核酸探针与组织、细胞中待检测的核酸按碱基配对的原则进行特异性结合而形

成杂交体，然后再应用与标记物相应的检测系统，通过组织化学或免疫组织化学方法在被检测的核酸原位形成带颜色的杂交信号，在显微镜或电子显微镜下进行细胞内定位。这一技术

为研究单一细胞中DNA和编码各种蛋白质、多肽的相应mRNA的定位提供了手段，使从分子水

平研究细胞内基因表达及有关基因调控提供了有效的工具。可视为组织化学或免疫细胞化学

中革命性的突破。原位杂交技术已应用于基础研究如基因组图(Gene mapping),转基因检测,

基因表达定位(localization of gene expression),核DNA和RNA的mRNA的排列和运输

(arrangement and transport of mNA),复制(replication)和细胞的分类(Sorting of cells)。

临床研究应用在细胞遗传学(Cytogenetics),产前诊断(Prenatal diagnosis),肿瘤和传染性

疾病的诊断,生物学剂量测定(biological dosimetry)和病毒学的病原学诊断等。随着核酸探

针的制备,标记方法和基本操作方法的不断改进,新的技术不断涌现,相信在不久的将来,原位

杂交技术将会更广泛的被应用于各个学科,并不断为生命科学提供新的资料,开拓新的领域。第一节原位核酸分子杂交技术的发展

原位杂交1969年美国耶鲁大学Gall和Pardue首先创立的，他们用爪蟾核糖体基因探针与其

卵母细胞杂交，确定该基因定位于卵母细胞的核仁中。与此同时，BuongiornoNardelli

和Amaldi,John及其同事等相继利用同位素标记核酸探针进行了细胞或组织的基因定位。

Orth(1970)3H标记的兔乳头状瘤病毒cRNA探针与兔乳头状瘤组织的冰冻切片进行杂

原位杂交

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1 探针的设计与合成

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1) 根据实验室已有的p8基因cDNA全长序列，用premier primer5.0设计引物p81和p82，

以卤虫cDNA为模板，PCR扩增得到346bp的产物，用Takara胶回收试剂盒回收纯化。

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引物编号 引物序列 长度

p81 TGCGGACGAAACAGGAAG 18 bp

p82 GCTCAAACAGTGATGCCAGT 20 bp

2) 目的片段克隆

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a. 在无菌离心管中加入连接载体的各种成分，载体与片段的摩尔比控制在1:3-1:8，根据凝

胶电泳检测后的浓度及载体与片段分子大小来计算摩尔比。加入成分及比例如下：

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目的PCR片段 5 μl

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pGM-T载体（约50ng/uL） 1 μl

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10×T4 DNA Ligation Buffer 1 μl

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T4 DNA Ligase（3U/uL） 1 μl

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无菌去离子水 3 μl

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总体积 10 μl

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b. 轻轻弹动离心管以混合内容物，短暂离心。置于PCR仪中16℃过夜连接，反应结束后将

离心管置于冰上。

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c. 向铺好的含有氨苄青霉素的固体平板表面加入16 μl的IPTG（50mg/ml）、40 μl的X-gal

（20mg/ml），使用无菌的弯头玻璃棒将其均匀的涂开，避光置于37℃培养箱1-3小时，使

溶解X-gal的二甲基甲酰挥发干净。

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d. 将10 μl的连接产物加到100 μl DH5感受态细胞中，轻弹混匀，冰浴半小时，将离心管

置于42℃水浴90秒，取出管后立即置于冰浴上放置2-3分钟，其间不要摇动离心管。向离

心管加入500 μl 37℃预热的LB（不含抗生素）培养基，150rpm摇床37℃振荡培养45分钟。

目的是使质粒上相关的抗性标记基因表达，使菌体复苏。将菌液于4000g下离心10分钟，

去掉上清，加入100 μl培养液重溶并加入到配制好的LB固体培养基上，用无菌的弯头玻璃

棒轻轻将细胞均匀涂开。待平板表面干燥后，倒置平板，37℃培养12-16小时。

荧光原位杂交法 pcr-荧光对比

荧光原位杂交法（FISH）和PCR-荧光对比（PCR-FLP）都是分子生物学中常用的技术，可以用于基因定位、染色体结构和功能等方面的研究。本文将分别介绍这两种技术的基本原理、应用场景和优缺点。

一、荧光原位杂交法

1.基本原理

荧光原位杂交法是一种基于DNA序列互补碱基配对原理的技术，利用荧光探针对染色体上的特定区域进行标记，以便于观察和分析。该技术主要包括以下几个步骤：

（1）制备探针：将已知序列的DNA片段与荧光标记分子连接，生成荧光标记的DNA探针。

（2）加热解离：将待检样品中的DNA加热，使其解离成两条单链DNA。

（4）荧光显色：利用显微镜观察染色体上的荧光标记，并确定标记位置及数目。

2.应用场景

荧光原位杂交法可用于以下方面的研究：

（1）核型分析：检测染色体数目、大小和形态等信息。

（2）染色体重排：观察染色体间的换位、倒位等结构改变。

（3）基因定位：确定特定基因在染色体上的位置。

（4）肿瘤诊断：检测肿瘤细胞染色体的数目和结构变化。

3.优缺点

（1）高灵敏度：能够检测到细胞核中的单个分子。

（2）高特异性：探针与目标序列可以实现完全互补。

（3）数据可视化：能够直观地呈现染色体结构及荧光信号大小。

而其缺点主要包括：

（1）长时间实验：需要多个步骤和时间，且荧光信号非常容易被淬灭。

（2）需要DNA标记：需要荧光标记作为探针，费用较高。 二、PCR-荧光对比

PCR-荧光对比（PCR-FLP）是一种应用荧光标记测量PCR产物数量的技术，能够在短时间内准确、可靠地检测和测量DNA的含量和变异。具体操作过程如下：

（1）样品制备：将待测DNA标记荧光标记，与另一非标记探针PCR反应。