细胞消化实验步骤

动物细胞传代培养一、【实验目的】1、掌握消化法细胞传代培养的原理2、了解细胞传代培养所需专用设备、试剂3、学习细胞传代培养操作二、【实验原理】动物细胞原代培养成功，细胞生长增殖形成单层细胞后，会进一步扩展汇合，覆盖整个培养瓶底，细胞会因生存空间不足或密度过大，发生接触抑制，并引起营养物质枯竭和代谢产物积累，发生细胞中毒，影响正常生长。

这时需要进行分离培养，细胞由原培养瓶按1：2或1：3稀释后传到新的培养瓶的过程称之为传代。

80%汇合或刚汇合细胞是理想的传代阶段。

消化法细胞传代培养，是用一定含量的胰蛋白酶来进行消化，使贴壁的单层细胞脱离下来，形成分散的细胞悬液，然后用新鲜的培养液进行稀释、分装和培养。

三、【实验仪器及试剂】仪器：改良吸管、加样器、培养瓶（玻璃、塑料）、抽滤装置、超纯水器、倒置显微镜、二氧化碳培养箱试剂：PE液、0.25%胰蛋白酶液、MEM+10%小牛血清液其中，二氧化碳培养箱用于开放或半开放培养，使细胞代谢产生的CO2及时溢出至培养箱中，再通过稳定调节箱中5%的CO2，与培养基中的NaHCO3处于动态平衡状态，使PH保持稳定。

四、【实验内容及步骤】（1）内容成纤维细胞传代培养6天，细胞汇合长满培养瓶底，刚传代好的细胞，圆球型亮圈，呈流动状态，传代培养1天，细胞贴壁，数量还不太多，上皮细胞培养至细胞汇合长满培养瓶底。

1、用酒精棉球擦拭培养用液瓶盖，打开瓶盖在酒精灯火焰上一过，盖上瓶盖，但不必拧紧2、将培养瓶内的旧培养液倒入烧杯中（注意瓶盖在酒精灯火焰附近），旧培养液倒掉后，镜下观察细胞十分干净、清晰3、从布袋中取出已消毒的吸管，插入加样器，注意吸管的刻度面向上，加样器的柄面偏左侧，以便于操作时观察。

4、将吸管过火焰（竖向横向各过一到两次），吸取PE液5ml从侧面加入瓶内，平放轻摇40下，放置2~5分钟将PE液倒出PE液的作用：络合、吸收、去除维持组织完整性的钙、镁离子，促进细胞分离，钙、镁离子有抑制胰酶的消化作用，因此用PE液去除，将残余未倒尽的血清除尽，因为血清也会抑制胰酶的消化作用；洗去未倒尽的死细胞。

1.PI染液的配制;(工作液0.05mg/ml)
7ml（PI工作液0.05mg/ml）：
10% 柠檬酸钠70ul
10% NP40 70ul
10mg/ml RNaseA 70ul
10mg/ml PI（Propidium Iodide water 配制）35ul
Water 6755ul
实验步骤：（成功步骤）
1.去上清，PBS洗，消化细胞（胰酶+EDTA）后，加入1.5尖底的EP管中。

2000rpm 离
心10min，用枪头弃上清，不要吸干，留一点液体。

2.PBS洗1次2000rpm离心10min ，用枪头弃上清，留下大约80ul（注意：细胞消化后
不可吹打过度，减少细胞破碎；以后的吹打也要注意，尤其是固定后的细胞容易破碎）；
3.70%乙醇（用PBS配）（预冷-20度）1ml加入EP管中，固定（用20微的枪把细胞一点一点加到70%的酒精里，刚加进去就立刻用枪使劲吹打，这样不会成团，肉眼可以看到）
4. 4℃固定过夜固定12h
5. 2000rpm 10min离心收集沉淀，用枪头弃上清，不要吸干，留一点液体。

6. PBS洗1次用枪头弃上清，不要吸干，留一点液体。

2000rpm 10min离心。

7.500ul (如果细胞很少，就300ul) PI染液（工作液）37度or RT or 4度避光染30min
8. 用300目筛网过滤细胞悬液，将液体移入流式分析专用管中。

9. 用流式细胞仪分析细胞周期。

技师为了减少对流式细胞仪的损伤，就会选择高速流（一般的检测用低速流，误差小），检测的质量就会大大下降，数据的说服力就下降了！。

一样品消化步骤1，锥形瓶洗涤洗涤精刷洗锥形瓶，放于酸缸中泡酸12小时以上（过夜）。

2，取样及预消化细胞：与管中加入约2ml浓硝酸，放置3小时之后转移至锥形瓶中，再加入3ml浓硝酸，封口过夜（注意：转移时要用少量浓硝酸冲洗管内壁两次）。

上清液：直接用移液枪吸取适量液体（体积根据情况而定）与锥形瓶之，加入5ml浓硝酸，封口过夜。

3，消化和赶酸1)每个锥形瓶中加入2ml 30％的双氧水；2)在电热板加热到150－180度（后来根据实际情况提高到200度左右），采用逐渐升温的方式：先在100度左右加热，然后提高到150度左右加热，最后定在200度左右，在实验过程中视情况而升降温；3)根据消化的情况：如果呈褐色，滴加硝酸继续氧化；如果呈草黄色，按滴依次滴加双氧水赶出氮化物；4)在锥形瓶中剩下0.5 ml（目测大约仅仅覆盖瓶底一层，）,停止赶酸，冷却，封口。

等待定容。

5)定容：取样品溶液，用2%硝酸和1%盐酸的混酸溶液在天平上定容到3g。

（其中也有定容到5g的）6)视实验需要对各个样品进行稀释。

4、清洗锥形瓶二标准溶液配制1, 金的标准溶液：HAuCl4的硝酸溶液准备多组浓度梯度的金溶液,；0.5ppb, 1ppb, 5ppb, 10ppb, 50ppb, 100ppb, 500ppb, 1ppm（部分测试中需要用到200ppb浓度）配置浓度梯度：1）配制1ppm溶液：5ml 混酸溶液，加入10μl标液（1mg/ml），然后加混酸定容到10g；2）取1ppm的溶液配制其他浓度：用混酸定容到5g（200ppb的配制：取3，单标溶液：Bi配制500ml的Bi的混酸溶液。

元素浓度为10ppb。

附注：储存液Bi：10ppm；取0.5ml Bi溶液用混酸溶液定容到500ml。

细胞培养中消化的定义细胞培养中的消化是指利用消化酶将细胞培养基中的胶原蛋白和其他细胞外基质降解为可溶性小分子物质的过程。

消化在细胞培养中起着至关重要的作用，它能够为细胞提供必需的营养物质，促进细胞的生长和繁殖。

下面将为大家介绍细胞培养中消化的具体含义及其实施方法。

在细胞培养的过程中，消化是一个必须进行的步骤，因为许多培养基中的组分是以胶原形式存在的，而细胞无法直接利用这些胶原蛋白。

因此，借助特定的消化酶，可以将这些不可利用的胶原蛋白降解为可以被细胞吸收利用的小分子物质，为细胞提供能量和营养。

消化酶在细胞培养中具有重要的作用。

常用的消化酶有胰蛋白酶、胶原酶等。

这些消化酶能够识别特定的化学结构，并通过切割或酶解胶原蛋白的肽键来降解胶原蛋白。

通过消化酶的作用，细胞可以充分利用培养基中的胶原蛋白和其他细胞外基质，以便获取所需的营养物质。

实施细胞培养中的消化通常有以下几个步骤：首先，将培养基中的消化酶加入到细胞培养体系中。

可以根据实验的需要选择合适的消化酶和浓度。

通常，消化酶在细胞培养体系中的浓度应该适度，过高的浓度可能对细胞造成损伤。

其次，进行适当的消化时间。

消化时间的长短可以根据实验目的和细胞类型进行调整。

一般来说，消化时间过短可能导致未能完全消化，影响细胞的生长和繁殖；而过长的消化时间则可能导致细胞过度消化，影响细胞的活力。

细胞培养中消化的最后一步是停止消化的过程。

这一步骤是非常关键的，因为消化酶的过度作用可能会对细胞产生不利影响。

通常采用添加特定抑制剂的方法来停止消化，如加入抑制剂或使用抑制剂处理培养体系。

细胞培养中的消化对于细胞培养的成功至关重要。

通过适当的消化步骤，可以将不利于细胞生长的胶原蛋白和其他细胞外基质转化为细胞所需的营养物质。

因此，在进行细胞培养实验时，我们应该高度重视消化步骤的实施，确保细胞能够获得最佳的生长环境。

同时，我们也应该根据实验的需要和细胞的特性，选择合适的消化酶和控制消化的时间和方法，以保证实验结果的准确性和可靠性。

细胞消化步骤细胞消化呀，这可是个很重要的事儿呢！就好像我们做饭要掌握好火候和步骤一样。

首先呢，得把细胞培养皿拿出来，这就好比厨师要先找到合适的锅。

然后呢，得小心地把培养液吸掉，可别太粗鲁啦，不然细胞宝宝们会不高兴的。

这就像我们洗菜，得轻轻柔柔的，不能把菜叶子弄破了。

接下来，就该加入消化液啦！这消化液就像是神奇的魔法药水，能让细胞们松开彼此的手。

但是可不能加太多或太少哦，这就跟放盐一样，多了咸，少了没味道。

加完消化液后，就得把培养皿放到培养箱里孵育一会儿啦。

这时候呀，细胞们就在里面慢慢发生变化呢，就像面团在发酵一样。

等过了一会儿，就得去看看细胞消化得怎么样啦。

如果看到细胞都变圆了，还飘起来一些，那就差不多啦。

这就像蒸馒头，看到馒头变得白白胖胖的，就知道差不多熟了。

然后呢，再加入适量的培养液终止消化。

这就好比做菜的时候，该加调料了，得恰到好处，不然味道就不对啦。

接着，就可以把细胞混悬液吸出来啦，转移到新的管子或培养皿里。

这就像把做好的菜盛出来一样。

在整个过程中，一定要轻手轻脚的，就像对待宝贝一样对待细胞们。

要是太粗鲁了，细胞们可是会“抗议”的哦！你想想，要是有人对你很粗暴，你会开心吗？细胞们也是有感觉的呀！而且呀，做细胞消化可不能着急，得有耐心。

就像炖汤，得小火慢慢炖，才能炖出美味的汤来。

要是火太大，汤就烧干啦，细胞也会被你搞坏的哟！还有哦，每次做细胞消化都要认真仔细，就像做一件很重要的事情一样。

不能马虎，不能偷懒。

不然细胞养不好，实验可就没法进行下去啦！总之呢，细胞消化虽然看起来简单，但是里面的学问可大着呢！只有认真对待，才能让细胞们茁壮成长，为我们的科学研究做出贡献呀！这可绝对不是开玩笑的哟！。

消化系统实验观察不同食物在消化液中的消化作用消化是机体吸收和利用食物营养的重要过程，而消化液则是消化系统中起关键作用的物质。

本实验旨在观察不同食物在消化液中的消化作用，以增进对消化系统的认识。

实验材料和仪器：1. 消化液：包括唾液酶、胃液和小肠液2. 食物：面包、苹果和肉丝3. 试管和试管架4. 恒温水浴5. 显微镜和载玻片6. 秒表实验步骤：1. 准备消化液和食物：分别取适量的唾液、胃液和小肠液，将其放入不同的试管中；将面包切成小块，苹果切成薄片，肉丝切成细丝备用。

2. 观察唾液对面包的消化：将一小块面包放入试管中的唾液中，放入恒温水浴中，并记录时间。

结果：在观察的过程中可以发现，面包逐渐变软，质地发生改变。

解释：唾液中含有唾液酶，它能够分解面包中的淀粉质，将其转化为糖类物质，从而改变了食物的性状。

3. 观察胃液对肉丝的消化：将一部分肉丝放入试管中的胃液中，放入恒温水浴中，并记录时间。

结果：在观察的过程中可以观察到，肉丝表面变得模糊，有些部分变色。

解释：胃液中含有胃蛋白酶，它可以将肉丝中的蛋白质分解为氨基酸，进而改变了食物的结构和颜色。

4. 观察小肠液对苹果的消化：将一片苹果放入试管中的小肠液中，放入恒温水浴中，并记录时间。

结果：在观察的过程中可以发现，苹果变得更加透明，柔软。

解释：小肠液中含有胰蛋白酶和葡萄糖酶等消化酶，它们能够将苹果中的淀粉质和蔗糖分解为葡萄糖等单糖，使食物发生改变。

5. 利用显微镜观察消化结果：将各组实验样品取出，放在载玻片上进行观察，记录所见。

观察结果：在显微镜下观察到，面包、肉丝、苹果等食物在消化液作用下发生了结构和组织的变化，如细胞壁被破坏、细胞结构变得模糊等。

实验结论：通过以上实验观察，可以得出以下结论：1. 唾液酶能够在消化过程中分解淀粉质，将其转化为糖类物质。

2. 胃液中的胃蛋白酶可以将蛋白质分解为氨基酸。

3. 小肠液中的消化酶可以将多糖分解为单糖，从而增加食物的可吸收性和消化效率。

HePG2细胞和L-02细胞的传代：HePG2细胞属人肝肿瘤的恒生细胞株，L-02细胞则是人胎肝细胞株，二者所使用的培养基可以是一样的，即最常见的DMEM。

一干使用低糖的。

细胞长满培养瓶时既要传代。

使用胰酶消化即可。

用D-Hank's液配制成0.25%的胰酶。

使用前37度预热，细胞经PBS 清洗两遍后，每个中号培养瓶加0.7ml的胰酶，胰酶的量可根据自己培养瓶的大小而定，原则就是能够盖满瓶底。

加入胰酶以后，为使酶的活性最大，将培养瓶盖拧紧后放回培养箱中，3分钟左右即用含血清的培养基终止消化。

如果在室温情况下消化，时间相应加长，可以在显微镜下观察，当细胞界限已十分清楚，即已分离为单个细胞，且有少量细胞漂起，则要终止消化了。

16HBE细胞株的传代方法：镜下观察细胞生长融合达70-80%，准备传代。

常规开紫外照射超净台20分钟，同时把含10%胎牛血清的MEM培养基、0。

25%胰酶、PBS放置37度培养箱中孵育。

20分钟后开始传代。

先弃掉旧培养液，加PBS洗一次，然后加0。

25%胰酶2ml消化（指25乘25cm大小的培养瓶）细胞，镜下观察细胞，细胞突起回缩，细胞变圆，然后将培养瓶放置37度二氧化碳培养箱中孵育3分钟左右（当然时间是随机的，比如：新配的胰酶作用时间短一些，配制时间长的胰酶作用时间会长一些，当然要不断地镜下观察），待细胞大部分消化下来（大部分细胞呈流沙状脱离瓶壁），加4ml含10%胎牛血清的MEM培养基终止消化。

反复吹打瓶壁上残留的细胞，并将已消化下来的细胞吹打均匀，然后吸入离心管中1000转离心1分钟，然后弃掉上清，用手指将离心管中的细胞弹打均匀，加新培养基，吹打均匀，分至3个新的培养瓶中，补足培养液。

将培养瓶平放，小心移入37度二氧化碳培养箱中培养过夜。

次日观察。

胃癌细胞AGS和SGC-7901的培养：细胞传代时不能长的太满,70%-80%就可以传了.实验前先把紫外灯打开照30分钟,然后再把鼓风机开10分钟,同时把培养液和胰酶放入37度水浴箱中,千万记住不要盖上水浴箱的盖子.传代时,我一般把培养瓶口过一下火,就直接把培养液到去,再用0.25%的胰酶(不含EDTA)消化.等细胞变圆,细胞间空隙加大就直接把培养液到去,不用离心,然后再吹打,虽说要轻柔,但很难吹打成单细胞悬液,所以稍用力也没有关系.虽然操作不规范,但节省时间,细胞也没有被污染.AAV-293细胞的传代:AAV-293细胞较喜欢成团生长,比较娇嫩,怕冷,传代时不要一次从二氧化碳培养箱拿出很多瓶,一次只要拿2-3瓶出来传就可以了,否则细胞很容易死掉.细胞在50-60%传代,细胞生长状态最好.用D-Hank's液配制成0.25%的胰酶消化半分钟左右,弃去胰酶.观察培养瓶是否有针孔样缝隙,如有就可以加入培养液吹打细胞.消化过久,对细胞损害很大,而且成团很难吹打成单个细胞.然后加入含有10%小牛血清的DMEM.轻轻放入二氧化碳培养箱中培养.肺癌细胞（人类），其中绝大部分都是贴壁细胞，具体如：（１）Ａ５４９（肺腺癌）（２）ＮＣＩＨ４４６（小肺细胞癌）（３）８０１（非小肺细胞癌）（４）ＮＣＩＨ４６０（大细胞肺癌）在消化传代过程中，步骤基本一致：吸去旧的培养液－＞用Ｈａｎｋｓ＇（１Ｘ）清洗一两次－＞加入一定量的消化液（Ｔｒｐｓｉｎ－ＥＤＴＡ）－＞置显微镜下观察，待细胞大部分变圆时，回到超静台－＞吸去消化液－＞加入一定量的新培养液－＞反复吹打细胞－＞再置显微镜下观察，直到细胞全部悬浮起来－＞吸出一部分加入新的培养瓶中－＞最后再补充加入一定量新的培养液（ＲＰＭＩ１６４０ｗｉｔｈ１０％ＦＢＳ）．注意：吹细胞时尽量多吹边角儿，此处细胞生长的多．另外吸出细胞前要混匀．另注：消化液的配制方法：Trpsin-EDTA(1X)--0.25% Trpsin with EDTA-4Naprepared with 2.5g Trpsin(1:250) and 0.38g EDTA-4Na/L in HBSS.小鼠前脂肪细胞（3T3-L1）：吸弃原培养液-->PBS洗一两次-->加入400ul0.125％胰酶（原代最好加0.05% EDTA）消化-->转动培养盘，保证整个盘面都被trypsin液润过->吸弃trypsin后37度消化3min-->以完全培液（DMEM+10% FCS＋1/1000Biotin+1/1000泛酸钙-->吸打（枪的吸力调至最小），1：10接种，前后左右摇晃培养盘，细胞均匀后放入培养箱继续培养（10%CO2 ,37度）MDBK（牛肾细胞）类型：贴壁细胞来源：购自武汉病毒所细胞保存中心由四川农业大学动物生物技术中心繁殖保存传代步骤：弃去旧的生长液-->用无钙镁水(CMF)冲洗贴壁细胞数次(视细胞瓶的大小,3--5次)-->剩少许CMF,滴入ATV 2--3滴-->摇匀细胞瓶中的液体,使ATV均匀的分布到瓶里的没个地方-->放入37度二氧化碳温箱中3--5min消化-->弃去ATV,加入生长液,拍打吸吹下细胞-->镜下观察-->分瓶-->作好记号,放入37度二氧化碳温箱生长细胞特点:该细胞生长力强,而且快速一般24h就可以张到80%,48h不传就会变的很老,所以该细胞传时要勤点;我感觉MDBK还是很好传的,比以前我传的ST、Vero细胞等要好传一些，且不那么容易死亡，所以是我的一个比较好的选择！该细胞适合接种疱疹病毒（如：伪狂犬病毒）！BHK-21：弃除旧的培养液后---用缓冲液冲洗一遍----用0.22%的胰酶消化液消化约两分钟左右可以看到细胞像沙子一样脱落-------赶紧倒掉胰酶加入含10%的牛血清培养液终止消化。

细胞周期测定实验具体步骤及详细说明
体外培养细胞生长、分裂繁殖的能力，可用分裂指数来表示。

它与生长曲线有一定的联系，如随着分裂指数的不断提高，细胞也就进入了指数生长期。

分裂指数指细胞群体中分裂细胞所占的百分比，它是测定细胞周期的一个重要指标，也是不同实验研究选择细胞的重要依据。

具体步骤
一、消化细胞，将细胞悬液接至内含盖玻片的培养皿中。

二、CO2培养箱中培养48小时，使细胞长在盖片上。

三、取出盖片，按下列顺序操作：
PBS漂洗3分钟→甲醇：冰醋酸=3：1固定液中固定30分钟→Giemsa液染色10分钟→自来水冲洗。

四、盖片晾干后反扣在载玻片上，镜检。

五、计算
分裂指数=分裂细胞数/总细胞数×100%
操作时动作要轻，以免使盖片上的细胞脱落。

Giemsa染液配制
称Giemsa粉末0.5 g，加几滴甘油研磨，再加入甘油（使加入的甘油总量为33 ml）。

56℃中保温90-120分钟。

加入33 ml甲醇，置棕色瓶中保存，此为Giemsa原液。

使用时按要求用PBS稀释。

一般稀释10倍。

Transwell实验具体步骤及方法
1.取对数生长期的细胞，常规消化（可以无血清饥饿12~24h，去除血清对cell
侵袭能力的影响）
2.用含1%FBS的培养基重悬细胞，调整细胞密度为（2~5）*10 5/ml，细胞要
多一点
3.取100ul细胞悬液接种于transwell小室的上室，下室加入600ul含10%FBS
的培养基（避免小室下面产生气泡）
4.培养细胞24h/48h，后取出小室置烧杯内涮洗；24孔板中加入800ul甲醇/孔。

5.吸干上室液体，4%多聚甲醛室温固定10~30min，
另一24孔板中加入800ul染色液/孔
涮洗后，吸干上室固定液，移入0.1%结晶紫染色液，室温染色20min （结晶紫：常规工作液浓度0.1%）
6.小室用流动水轻轻冲洗浸泡3次进行脱色染色
7.吸干上室液体，用棉签（棉花扯松一点再擦）轻轻擦掉上室底部膜表面未迁
移细胞
8.显微镜下随机观察5个视野细胞，并进行照相
9.数据处理。

原代细胞培养酶消化法原代细胞培养是指从组织或器官中分离出来的一次性细胞，而不是从已经分离出来的细胞线进行培养。

在实验室中，原代细胞培养是一项重要的技术，可以用于许多生物医学研究的领域。

原代细胞培养酶消化法是一种利用酶进行细胞的分离和培养的方法。

下面将从步骤、特点、注意事项三个层面来介绍原代细胞培养酶消化法。

一、步骤1. 细胞的分离和取样选择样品后，先用温暖的磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗样品，去除血液和杂质，然后将组织切成小块。

可选择合适的工具进行，比如利器、组织分离剂、机械搅拌、离心等。

注意切割时要干净、快速，避免氧化、变质。

然后将分离的组织块放在消化酶中，浸泡时间根据组织不同而有所不同，一般为30-60分钟。

2. 细胞的过滤和沉淀为了防止组织块在培养灌流系统中堵塞，需要用网筛或过滤纱布过滤，去除固态组织块，得到单个的细胞。

过滤后，可用离心仪或站立离心管离心，使组织细胞沉淀到培养底物上，需要注意碎片和杂质清理干净，否则容易影响细胞生长。

3. 培养液的添加和培养条件的调节将细胞块放入消化液中，待单个细胞离体后离心沉淀，用PBS进行洗涤，将细胞在含血清控制的培养基中进行细胞培养。

在培养的过程中要注意细胞的黏附，可在内壁涂覆一层明胶质量。

温度也是一个非常重要的因素，应维持在36-37°C，CO2含量建议为5-10％。

4. 细胞的鉴定和分化可通过视觉或细胞染色等方法鉴定细胞的纯度和活性，晶体紫和格林盏染色法非常常用。

也可尝试不加血清的培养方法，探究不加血清对细胞生长和分化所产生的影响。

需要注意的是，在细胞分化的过程中要防止细胞的聚集和过多的细胞死亡。

二、特点1. 可以获取真正的原生细胞，避免不同细胞互相干扰的情况发生。

2. 让细胞在一个天然环境中良好的生长，适合生物医学研究领域的多个应用方向。

3. 原代细胞培养在研究中的可重复性更高，结果也更可靠。

三、注意事项1. 在取样和分离细胞的过程中，需要降低不必要的交叉污染。