明胶和壳聚糖交联剂的使用

丝素蛋白-明胶-壳聚糖-羟基磷灰石多孔支架的制备及性能评估作者：谷明西王常成田丰德郝瑞胡安宁郭林来源：《丝绸》2023年第11期Preparation and performance evaluation of silk protein-gelatin-chitosan-hydroxyapatiteporous scaffolds摘要：文章以絲素蛋白（SF）、明胶（Gel）、壳聚糖（CS）和羟基磷灰石（Hap）为基础材料，通过真空冷冻干燥和化学交联制备了5组SF-CS-Gel-nHap多孔支架（Hap-1%、Hap-2%、Hap-3%、Hap-4%、Hap-5%）。

通过扫描电子显微镜、X射线衍射仪（XRD）、孔隙率、吸水膨胀率、生物降解率及力学性能研究，筛选出理化性能优越适合全层软骨缺损再生重建的复合支架。

随后将其与骨关节炎患者分离提取的软骨细胞共培养，通过细胞黏附率测定、细胞活死染色和CCK-8细胞活性增殖实验等方法评估多孔支架的生物性能，探索其用于修复全层软骨缺损的可行性。

结果显示，基于明胶、壳聚糖、丝素蛋白和纳米羟基磷灰石制备的SF-CS-Gel-2%Hap多孔复合支架不仅可以模拟天然骨软骨的细胞外基质（ECM），而且具有良好的生物相容性，能够为营养物质的转运和细胞黏附、增殖和立体生长提供良好的网状骨架，为全层软骨缺损的治疗提供新的选择。

关键词：组织工程;支架;全层软骨缺损;丝素蛋白;壳聚糖;明胶;羟基磷灰石中图分类号：TS102.1; Q813文献标志码：A文章编号： 10017003（2023）110001起始页码09篇页数引用页码：111101DOI： 10.3969/j.issn.1001-7003.2023.11.001（篇序）收稿日期：20230128;修回日期：20231011基金项目：作者简介：谷明西（1992），男，医学硕士，主要从事骨关节炎和组织工程方面的研究。

通信作者：郭林，教授，**************。

壳聚糖-明胶体系的温敏凝胶及其药物缓释性能王津;陈莉敏;蒋智清;林友文【摘要】用试管倒置法研究在甘油磷酸钠存在下,壳聚糖-明胶体系的温敏凝胶化性能.体系3组分的体积比V(壳聚糖)∶V(G)∶V(甘油磷酸钠)从10∶0.5∶1～10∶0.5∶2.5(体系pH值6.8),37℃下凝胶化时间由(1200±60)s降至150s;V(壳聚糖)∶V(G)∶V(甘油磷酸钠)体积比从10∶0.25∶2～10∶1.25∶2(体系pH值6.8),37℃下凝胶化时间从(300±10)s增至(690±30)s.固定三者体积配比,明胶浓度增大,37℃下凝胶化时间延长.pH值在6.8～7.2范围适合于体系凝胶化.调节体积配比及合适的pH值,可实现壳聚糖/明胶/甘油磷酸钠体系在37℃下快速凝胶化.以布洛芬为模型药物,24h载药温敏凝胶累积释放度为(79.28±2.0)％,而24h布洛芬原药累积释放度为(97.04±2.5)％,表明载药凝胶对药物具有缓释作用.【期刊名称】《功能材料》【年(卷),期】2013(044)009【总页数】4页(P1294-1297)【关键词】壳聚糖;明胶;温敏凝胶;布洛芬;缓释【作者】王津;陈莉敏;蒋智清;林友文【作者单位】福建医科大学药学院,福建福州350004;福建医科大学药学院,福建福州350004;福建医科大学药学院,福建福州350004;福建医科大学药学院,福建福州350004【正文语种】中文【中图分类】R9431 引言温度敏感性在体原位凝胶给药系统中目前已成为药剂学及生物材料领域研究的热点［1-5］，其特点是以液体给药后，在药用部位因温度变化刺激(体温37℃)而发生相转变，固化或形成凝胶，从而控制药物的释放。

可用于眼部给药、鼻腔给药、局部注射给药等［6，7］;也可作为组织修复植入给药，既是组织缺损的填充材料，又是药物释放载体［8-10］，使载入药物只在病变组织部位释放，不仅能有效利用药物获得最优治疗效果，而且不会在其它正常部位产生毒副作用。

pH响应型壳聚糖-明胶水凝胶的制备研究作者：刘伶俐钱洋来源：《赤峰学院学报·自然科学版》 2014年第7期刘伶俐，钱洋（安徽新华学院药学院，安徽合肥 230088）摘要：pH敏感型水凝胶是指水凝胶的体积随外界环境如pH值、离子强度变化而变化的一类高分子凝胶，可方便地调节和控制凝胶内药物的释放和扩散速率，目前常用于缓控释药物载体.本文利用明胶与壳聚糖为原料，采用化学交联法制备了一种pH响应性水凝胶，探讨原料用量、反应温度及交联剂用量对凝胶溶胀性能的影响，获得了一种对pH敏感的智能水凝胶.关键词：pH敏感型水凝胶；壳聚糖；明胶中图分类号：O648.17文献标识码：A文章编号：1673-260X（2014）04-0125-03水凝胶是一种以水为分散介质，通过共价键、氢键或范德华力等作用相互交联构成三维高分子网络结构的水凝胶.具有网状交联结构的水溶性高分子中引入一部分疏水基团和亲水残基，亲水残基与水分子结合，而疏水残基遇到水膨胀形成聚合物.水凝胶具有良好的生物相容性，与疏水聚合物相比，固定在水凝胶中的生物分子活性能够保持较长时间，同被固定化的酶或细胞相互作用弱很多，因此水凝胶在生物化学、医学等领域有许多用途[1-2].智能水凝胶是对外界环境微细的物理或化学变化并能产生相应响应的一类水凝胶，也被称为刺激响应性或响应性凝胶.其中pH敏感性水凝胶是指水凝胶的体积随外界环境pH值、离子强度变化而变化的一类高分子凝胶.这类凝胶中含有大量易水解或质子化的酸、碱基团，这些基团的解离受外界pH的影响，当外界pH变化时，这些基团的解离程度相应改变，造成内外离子浓度改变，这些基团的解离还会破坏凝胶内相应的氢键，使凝胶网络的交联点减少，造成凝胶网络结构发生变化，引起水凝胶溶胀度的变化[3-4].在药学领域中，根据pH敏感性水凝胶的这种性质可以方便地调节和控制凝胶内药物的释放和扩散速率，从而常用于药物缓控释制剂的研究[5-6].凝胶敏感性的研究始于20世纪70年代后期，大量的研究结果表明:环境的某些微小扰动，都可能导致水凝胶体积的显著变化.而pH敏感性凝胶在环境响应性高分子材料中独树一帜，占据着非常重要的地位，因此关于pH敏感性凝胶的研究非常迅速，特别是在药物控释中的应用[7-8].有研究者[9]制备了pH敏感牛血清白蛋白亲水微球，这种微球对于β-普萘洛尔在pH=1.0释放较快，在pH=6.8、1h后释放完；二氟尼柳在pH=1.0时释放量很少,在pH=6.8时释放量增加.另外还有人制备具有不同pH值响应性的P(HEMA-co-AA)和P(HEMA-co- DMAEMA)凝胶.选择非甾体消炎药双氯酚酸钠为模型药物，考察凝胶对模型药物的控释行为.对于P(HEMA-co-AA)凝胶，在模拟胃液中，凝胶收缩，药物释放速度较慢，前3h双氯酚酸钠的累积释放量小于5%.在模拟肠液中，凝胶溶胀，药物释放速度增快，26h后药物的累积释放量达97.5%[10].pH敏感水凝胶在药物载体材料方面有着许多巨大潜在的应用，因此关于其研究也成为了一个重要的方向.壳聚糖[11-12]无毒，具有很好的生物相容性、生物可降解性，明胶[13-14]作载体材料，无不良反应，无免疫原性，具生物可降解性.本文通过交联剂使壳聚糖和明胶发生交联反应，用以制备壳聚糖/明胶pH响应性水凝胶，并研究了该水凝胶的溶胀性能，为控制缓释载体材料的研究奠定一定的研究基础.1 材料与方法1.1 试剂及仪器试剂：壳聚糖，BR级，国药集团化学试剂有限公司；明胶，BR级，国药集团化学试剂有限公司；25%戊二醛（GA），BR级，国药集团化学试剂有限公司；柠檬酸，江苏强盛化工有限公司；36.5％浓盐酸；柠檬酸；令苯二甲酸氢钾；磷酸氢二钠；磷酸二氢钠；甘氨酸；氢氧化钠.恒温水浴锅(HSG-IB)，上海仪表(集团)供销公司；DF-101S型集热式恒温磁力搅拌器，巩义市予华仪器有限责任公司；电子天平（JJ500），常熟双杰测试仪器厂；RC-6智能溶出仪，天津市光学仪器厂；754紫外分光光度计，天津市拓普仪器有限公司；PHS-25pH计，上海虹益仪器仪表有限公司.1.2 实验方法1.2.1 不同pH值缓冲液的的制备配制一系列不同pH值、一定离子强度的缓冲溶液，pH=1.2（盐酸溶液），pH=3.0（邻苯二甲酸氢钾-HCL溶液），pH=5.0（磷酸氢二钠-柠檬色溶液），pH=7.4（磷酸盐溶液），pH=9.0（甘氨酸-氢氧化钠溶液），见表1.室温下，将凝胶置缓冲溶液中溶胀一定时间后取出，测定溶胀度[公式(1)].SR=Wt-W0/W0(1)SR—溶胀度；W0—凝胶溶胀前质量；Wt—凝胶溶胀后质量；1.2.2 不同质量比对水凝胶溶胀性能的影响分别称取0.5g、1g、1g的明胶和1.5g、1g、2g的壳聚糖按照1:1、1:2、1:3的比例分成三组进行试验.称取的明胶在试验之前应进行溶胀，即在20mL的蒸馏水中让其侵泡3到4小时，再把取得的壳聚糖在研钵中加入配置好的10％柠檬酸溶液50mL，使其充分溶解，再把溶胀后的明胶倒入其中，最后加入30mL的蒸馏水.最后加入一定量戊二醇，在50℃的水浴锅中进行搅拌反应，最后收集产物.然后置于pH值3.0的缓冲液中溶胀，分别记录不同时间明胶溶胀后的质量，研究不同质量比对水凝胶溶胀性能的影响.1.2.3 不同交联剂用量对水凝胶溶胀性能的影响固定壳聚糖-明胶混合溶液体积为100mL，按明胶：壳聚糖=l:1（质量比）的比例，按照上述实验步骤将戊二醛用量分别为5.00mL、6.25mL、7.25mL加入胶液中，保持恒温水浴锅温度为50℃制备一系列水凝胶，冷冻干燥，将制备好的一系列水凝胶置于pH值3.0的缓冲溶液中，记录不同时间明胶溶胀后的质量，研究不同交联剂用量对水凝胶溶胀性能的影响.1.2.4 反应温度对水凝胶溶胀行为的影响按明胶：壳聚糖=1:l(质量比)的比例，按照上述的实验步骤分别加入戊二醛用量6.25mL，反应温度为40℃、50℃、60℃制备一系列水凝胶，冷冻干燥，然后放入pH值3.0的缓冲溶液中溶胀，记录不同时间明胶溶胀后的质量，研究反应温度对交联凝胶溶胀性能的影响.1.2.5 水凝胶的pH响应性固定戊二醇体积为6.25mL，壳聚糖-明胶混合溶液的体积为100mL，明胶：壳聚糖=1:1，反应温度为50℃制备一系列水凝胶，冷冻干燥，然后置于pH值分别为1.2、3.0、5.0、7.4、9.0的缓冲液中，记录不同时间明胶溶胀后质量，观察其在不同pH值的缓冲液中的溶胀行为.2 结果与讨论2.1 不同质量比对水凝胶的溶胀性能的影响明胶-壳聚糖质量比分别为1:1、1:2、1:3，交联剂用量在6.25mL，反应温度为50℃制得的水凝胶在pH值为3的缓冲液中的溶胀行为，由实验测得的数据可得不同质量比对水凝胶溶胀度的影响曲线，如图1所示.由图1可以看出不同质量比的明胶-壳聚糖水凝胶在pH=3的缓冲液中的溶胀性能的差异显著，随着壳聚糖质量浓度的增加，水凝胶的溶胀行为减小.这是因为壳聚糖的质量浓度高时使凝胶结构变得更加密实，溶胀度因而下降，浓度较低时会导致凝胶内部结构松散，溶度能力大.同时溶胀大约在2~6小时内达到平衡.因此选用明胶和壳聚糖的质量比为1:1来制备水凝胶，其溶胀性能最佳.2.2 不同交联剂用量对水凝胶溶胀性能的影响保证壳聚糖-明胶质量比为1:1，反应温度为50℃，交联剂用量为6.25mL，制备的水凝胶在pH值为3的缓冲液中的溶胀行为，由实验测得的数据可得不同交联剂用量对水凝胶溶胀性能的影响.如图2.由图2所示，交联剂用量为6.25mL凝胶溶胀性能最佳.且在相对增大交联剂用量时，凝胶溶胀性能降低.这是由于交联度较小时，交联内部的交联密度比较低，凝胶内自由空间大，水凝胶的网络结构疏松，另外-COOH和-NH2都具较强的亲水作用，因此水凝胶网络内部可以容纳大量的水.交联剂质量浓度较高时，水凝胶交联密度增大，水凝胶网络结构变得紧密，网格变小，限制了亲水基团与水的相互作用.2.3 反应温度对水凝胶溶胀性能的影响按明胶:壳聚糖=1:l(质量比)的比例，分别加入戊二醛用量6.25mL，反应温度为40℃、50℃、60℃制备一系列水凝胶，冷冻干燥，然后放入pH值3.0的缓冲溶液中溶胀，记录不同时间明胶溶胀后的质量可得表3.由实验测得数据可得不同反应温度对水凝胶溶胀性能的影响，由图3可知反应温度对溶胀度的影响较小，大约在4小时左右基本达到溶胀平衡.且在反应温度为50℃时凝胶溶胀性能最佳，因此我们选用反应温度为50℃来制备水凝胶.在低温下，水渗透进入凝胶内部，以结合态水形式存在.随着温度的升高，水分子获得能量，凝胶内的亲水基团转变为分子内氢键，这样势必降低凝胶与水分子之间的亲合力，凝胶内部的水分子由结合态转变为自由态，从网络中释放出来.2.4 水凝胶的pH响应性固定戊二醇体积为6.25mL，壳聚糖-明胶混合溶液的体积为100mL，明胶：壳聚糖=1:1，反应温度为50℃制备一系列水凝胶，冷冻干燥，然后置于pH值分别为1.2、3.0、5.0、7.4、9.0的缓冲液中，记录不同时间明胶溶胀后质量.由实验数据可得不同pH水凝胶随时间变化的溶胀度，如图4所示.如图4所示，制备所得凝胶均表现出显著的pH响应性溶胀行为，即凝胶在低pH值有较大的溶胀度，在高pH值有较小的溶胀度.在pH值为1.2-5.0时，随pH值的增大，壳聚糖/明胶凝胶的溶胀度呈现先增加后减小的趋势；在pH值为5.0-9.0时，随pH值的增大，凝胶的溶胀度逐渐减小，但溶胀度的变化已经不很明显.在不同pH值缓冲液中，水凝胶的离子程度不同，所形成基团亲水性也有所不同.在酸性溶液中，壳聚糖-明胶水凝胶分子中的氨基质子化，其网络上产生电荷，会破获网络结构的氢键和静电吸引力，产生电子斥力，分子链充分伸展，致使凝胶溶胀.当体系为中性或碱性环境时，壳聚糖中的氨基质子化趋势减弱，结构收缩，溶胀度减小.3 结论利用明胶与壳聚糖为原料交联制备了一种pH响应性水凝胶，通过实验得到如下结论：3.1 明胶和壳聚糖的最佳质量比当明胶和壳聚糖的质量比为1:1时，制备的水凝胶呈现果冻状，疏松多孔，含有大量微气泡，水凝胶的溶胀性能最佳.3.2 最佳质量下的不同交联剂用量对水凝胶溶胀行为的影响交联剂质量浓度增大，交联凝胶的溶胀速率变慢，溶胀度降低.3.3 不同反应温度对水凝胶溶胀行为的影响最佳配比下的水凝胶在反应温度在50℃最佳，且反应温度水凝胶的溶胀性能影响较小.3.4 最佳质量比下的pH响应性凝胶对溶胀介质pH值变化具有良好的响应性，其溶胀过程可逆，在酸性环境中的pH敏感性优于碱性环境中的pH敏感性.且在pH值为3.0溶胀性能最佳.该pH响应型的水凝胶对不同pH具有不同的响应性，具备良好的溶胀性能，由于壳聚糖和明胶的生物相容性及无毒性，这种载体材料将有望应用于药物的缓释载体中，具备良好的应用前景.参考文献：〔1〕Koen Raemdonck, Joseph Demeestera,Stefaan De Smedt.Advanced nanogel engineering for drug delivery .Soft Matter, 2009,5, 707-715.〔2〕Chao-Hua Hu, Xian-Zheng Zhang, Lei Zhang, et al. 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研究与技术丝绸ＪＯＵＲＮＡＬＯＦＳＩＬＫ丝素蛋白明胶壳聚糖羟基磷灰石多孔支架的制备及性能评估Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎａｎｄｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅｅｖａｌｕａｔｉｏｎｏｆｓｉｌｋｐｒｏｔｅｉｎ￣ｇｅｌａｔｉｎ￣ｃｈｉｔｏｓａｎ￣ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅｐｏｒｏｕｓｓｃａｆｆｏｌｄｓ谷明西１ꎬ王常成２ꎬ田丰德３ꎬ郝瑞胡３ꎬ安㊀宁３ꎬ郭㊀林３(１.北京大学深圳医院内科ꎬ深圳５１８０００ꎻ２.大连理工大学医学部ꎬ大连１１６０８１ꎻ３.大连大学附属中山医院膝关节与骨肿瘤科ꎬ大连１１６００１)摘要:文章以丝素蛋白(ＳＦ)㊁明胶(Ｇｅｌ)㊁壳聚糖(ＣＳ)和羟基磷灰石(Ｈａｐ)为基础材料ꎬ通过真空冷冻干燥和化学交联制备了５组ＳＦ￣ＣＳ￣Ｇｅｌ￣ｎＨａｐ多孔支架(Ｈａｐ￣１％㊁Ｈａｐ￣２％㊁Ｈａｐ￣３％㊁Ｈａｐ￣４％㊁Ｈａｐ￣５％)ꎮ通过扫描电子显微镜㊁Ｘ射线衍射仪(ＸＲＤ)㊁孔隙率㊁吸水膨胀率㊁生物降解率及力学性能研究ꎬ筛选出理化性能优越适合全层软骨缺损再生重建的复合支架ꎮ随后将其与骨关节炎患者分离提取的软骨细胞共培养ꎬ通过细胞黏附率测定㊁细胞活死染色和ＣＣＫ￣８细胞活性增殖实验等方法评估多孔支架的生物性能ꎬ探索其用于修复全层软骨缺损的可行性ꎮ结果显示ꎬ基于明胶㊁壳聚糖㊁丝素蛋白和纳米羟基磷灰石制备的ＳＦ￣ＣＳ￣Ｇｅｌ￣２％Ｈａｐ多孔复合支架不仅可以模拟天然骨软骨的细胞外基质(ＥＣＭ)ꎬ而且具有良好的生物相容性ꎬ能够为营养物质的转运和细胞黏附㊁增殖和立体生长提供良好的网状骨架ꎬ为全层软骨缺损的治疗提供新的选择ꎮ关键词:组织工程ꎻ支架ꎻ全层软骨缺损ꎻ丝素蛋白ꎻ壳聚糖ꎻ明胶ꎻ羟基磷灰石中图分类号:ＴＳ１０２.１ꎻＱ８１３㊀㊀㊀㊀文献标志码:Ａ㊀㊀㊀㊀文章编号:１００１７００３(２０２３)１１０００１０９引用页码:１１１１０１ＤＯＩ:１０.３９６９/ｊ.ｉｓｓｎ.１００１￣７００３.２０２３.１１.００１收稿日期:２０２３０１２８ꎻ修回日期:２０２３１０１１作者简介:谷明西(１９９２)ꎬ男ꎬ医学硕士ꎬ主要从事骨关节炎和组织工程方面的研究ꎮ通信作者:郭林ꎬ教授ꎬｇｋｙｓｇｌ＠１２６.ｃｏｍꎮ㊀㊀关节软骨主要由嵌有软骨细胞的细胞外基质(ＥｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒＭａｔｒｉｘꎬＥＣＭ)组成ꎬ具有承载和缓冲作用ꎬ覆盖和保护骨骼免受数倍于身体质量的承重力的影响[１]ꎮ与大多数其他组织不同ꎬ软骨组织结构特殊ꎬ由于缺乏血管化和神经支配ꎬ软骨细胞少㊁增殖能力低ꎬ导致软骨损伤后的自我修复能力差ꎬ当损伤从软骨表层延伸到软骨下骨时ꎬ即发生全层软骨缺损(Ｆｕｌｌ￣ＴｈｉｃｋｎｅｓｓＣａｒｔｉｌａｇｅＤｅｆｅｃｔꎬＦＴＡＣ)[２]ꎮ组织工程(ＴｉｓｓｕｅＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇꎬＴＥ)是一种结合了工程学和细胞生物学的跨学科方法ꎬ旨在恢复㊁改善和维持组织功能[３]ꎬ已成为软骨组织再生和重建最常用的方法之一ꎮ种子细胞㊁支架材料及生长因子是制约软骨组织工程的三个关键性制约因素ꎬ其中作为组织形成模板的支架材料在ＴＥ中起着最重要的作用[４]ꎮ丝素蛋白(ＳｉｌｋＦｉｂｒｏｉｎꎬＳＦ)是一种具有出色机械性能㊁生物降解性㊁生物相容性和生物可吸收性的天然蛋白质[５]ꎮ壳聚糖(ＣｈｉｔｏｓａｎꎬＣＳ)是唯一带正电荷的天然多糖ꎬ与ＥＣＭ中发现的葡糖胺聚糖(ＧｌｙｃｏｓａｍｉｎｏｇｌｙｃａｎꎬＧＡＧｓ)相似ꎬ不仅能够与带负电的ＧＡＧ发生静电相互作用ꎬ而且还能促进软骨特异性蛋白表达[６]ꎮ明胶(ＧｅｌａｔｉｎꎬＧｅｌ)是胶原蛋白的水解产物ꎬ具有高度的亲水性和出色的生物相容性ꎬ这有助于支架中的营养输送和细胞黏附[７]ꎮ羟基磷灰石(ＨｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅꎬＨａｐ)是天然骨骼的矿物质成分ꎬ具有骨传导特性㊁骨诱导特性㊁骨结合能力和原位降解缓慢等优势ꎬ已成功应用于临床骨修复[８]ꎮ然而由单一成分制成的支架在水和生理条件下的稳定性差ꎬ因此ꎬ可以将两种或多种聚合物混合以获得新材料[９￣１０]ꎮ本研究为了构建理想的组织工程支架ꎬ充分恢复关节软骨的原始成分㊁结构㊁力学和生物功能ꎬ以明胶㊁壳聚糖㊁丝素蛋白和羟基磷灰石为基础材料ꎬ通过真空冷冻干燥和化学交联开发一种能够满足骨软骨ＥＣＭ和成骨成软骨双向分化要求的三维多孔支架ꎬ探索其用于修复软骨缺损的可行性ꎮ１㊀方㊀法１.１㊀材㊀料蚕茧(西北养蚕工业基地)ꎻ甲苯胺蓝染色液㊁透析袋(北京索莱宝科技有限公司)ꎻ脱乙酰度ȡ９５％的壳聚糖㊁明胶㊁溴化锂㊁Ｎ￣羟基琥珀酰亚胺㊁碳酰二亚酸盐(上海麦克林生化科技有限公司)ꎻＤＭＥＭ/Ｆ１２培养基(海克隆Ｈｙｃｌｏｎｅ生物科技１Ｖｏｌ.６０㊀Ｎｏ.１１Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎａｎｄｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅｅｖａｌｕａｔｉｏｎｏｆｓｉｌｋｐｒｏｔｅｉｎ￣ｇｅｌａｔｉｎ￣ｃｈｉｔｏｓａｎ￣ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅｐｏｒｏｕｓｓｃａｆｆｏｌｄｓ公司)ꎻ澳洲胎牛血清(美国赛默飞公司Ｇｉｂｃｏ胎牛血清)ꎻＣＣＫ￣８细胞增殖试剂盒㊁活死细胞染色试剂盒(Ａｂｂｋｉｎｅ亚科因生物技术有限公司)ꎻ碳酸氢钠(国药集团药业有限公司)ꎬＩＩ型胶原酶(百普赛斯Ｂｉｏｓｈａｐ生物科技公司)１.２㊀主要实验溶液的配制１.２.１㊀壳聚糖溶液称取３ｇ壳聚糖(脱乙酰度ȡ９５％)粉末溶解于１００ｍＬ１％醋酸溶液中ꎬ磁力搅拌４ｈ直至完全溶解ꎬ然后过滤溶液以除去杂质ꎮ１.２.２㊀明胶溶液称取３ｇ生物明胶溶解于５０ħ１００ｍＬ超纯水中ꎬ水浴加热并持续搅拌至完全溶解ꎮ１.２.３㊀丝素蛋白溶液１)脱胶:挑选优质干净的蚕茧ꎬ将切好的茧块加入沸腾的０.５％Ｎａ２ＣＯ３溶液中ꎬ煮沸６０ｍｉｎꎬ然后用蒸馏水浸泡洗涤１０ｍｉｎꎬ重复２~３次后烘干ꎮ２)溶解:按照１︰６的比例将脱胶蚕丝在６０ħ条件下溶解于９.３ｍｏｌ/ＬＬｉＢｒ溶液中ꎮ３)过滤离心:冷却至室温ꎬ使用不锈钢过滤网过滤去除较大颗粒杂质ꎬ以９０００ｒ/ｍｉｎ速度离心１０ｍｉｎꎮ４)透析:将离心后的丝素蛋白溶液转移至截留相对分子质量１２０００ʃ２０００的透析袋中ꎬ超纯水持续透析３ｄꎬ直至透析袋内水位不再变化ꎮ５)浓缩:将含丝素蛋白溶液的透析袋放入质量分数１０％的聚乙二醇溶液中进行浓缩１２ｈꎬ保存于４ħ冰箱中备用ꎮ１.３㊀ＳＦ￣ＣＳ￣Ｇｅｌ￣ｎＨａｐ支架的制备将质量分数为３％的ＳＦ溶液㊁ＣＳ溶液㊁Ｇｅｌ溶液分别以１︰１︰１体积比混合均匀ꎬ调整Ｈａｐ的量ꎬ根据Ｈａｐ在混合溶液质量分数的不同ꎬＳＦ￣ＣＳ￣Ｇｅｌ￣ｎＨａｐ复合溶液分为５组(Ｈａｐ￣１％㊁Ｈａｐ￣２％㊁Ｈａｐ￣３％㊁Ｈａｐ￣４％㊁Ｈａｐ￣５％)ꎬ磁力搅拌６０ｍｉｎ混合均匀ꎬ然后以每孔１ｍＬ转移至４８孔板内ꎮ在－２０ħ预冻过夜ꎬ放入－８０ħ冰箱中继续冷冻２４ｈꎬ然后真空冷冻干燥４８ｈꎬ经第一次塑形得到规则㊁圆柱状的冷冻干燥支架ꎮ冷冻干燥后每孔中加入２ｍＬ交联剂ꎬ交联剂各成分分别为碳化二亚胺盐５０ｍｍｏｌ/Ｌ和Ｎ￣羟基琥珀酰亚胺２５ｍｍｏｌ/Ｌꎮ在４ħ条件下充分交联过夜ꎬ然后用７５％乙醇和去离子水清洗数次ꎬ加入７５％乙醇溶液浸泡２４ｈꎬ１ｍｏｌ/ＬＮａＯＨ溶液浸泡中和６ｈꎬ去离子水洗净ꎮ再次放于－２０ħ冷冻过夜ꎬ－８０ħ冷冻２４ｈ后行真空干燥４８ｈꎬ进行第二次塑形ꎮ干燥完成后ꎬ将支架收集密封ꎬ置于４ħ冰箱ꎬ保存备用ꎮ１.４㊀物理性能表征１.４.１㊀大体外观将不同类型的３Ｄ支架从４８孔板中取出进行拍照观察ꎮ１.４.２㊀扫描电镜观察使用手术刀片将每个支架样品切成合适厚度ꎬ常规涂覆金膜后ꎬ通过Ｒｅｇｕｌｕｓ８１００扫描电子显微镜(日本日立公司)对支架的内部结构和形貌进行分析ꎻ采用ＩｍａｇｅＪ图像可视化软件对样品进行孔径分析ꎬ平均孔径是通过测量在样品中心部分至少随机选择的２０个孔的最大和最小直径来获得ꎮ１.４.３㊀Ｘ射线衍射(ＸＲＤ)分析将支架研磨成粉末ꎬ使用Ｄ８ａｄｖａｎｃｅ全自动Ｘ射线衍射仪(美国布鲁克海文仪器公司)对粉末样品进行表征ꎬＸ射线衍射仪在３５ｋＶ和１０ｍＡ的条件下用Ｃｕｋα辐射(λ＝１.５４２)记录样品的衍射图ꎬ扫描２θ角范围为５ʎ~６０ʎꎬ扫描速率为５ʎ/ｍｉｎꎮ１.４.４㊀溶胀率用常规重量法测定各组支架的吸水溶胀率ꎮ将冷冻干燥后的支架后称重记为Ｍ１ꎬ然后浸泡于ＰＢＳ缓冲液(ｐＨ７.４)中２４ｈ后ꎬ取出样品ꎬ用纱布吸去支架表面多余的水分ꎬ称重记为Ｍ２ꎮ每组实验进行３次ꎮ吸水溶胀率Ｓ计算如下式所示:Ｓ/％＝Ｍ２－Ｍ１Ｍ１ˑ１００(１)１.４.５㊀孔隙率采用比重瓶法测定各组复合支架的孔隙率ꎮ用手术刀片将各支架切成统一大小的样品ꎬ以无水乙醇为液体介质ꎬ称量充满无水乙醇的比重瓶ꎬ质量记为Ｍ１ꎬ将干重Ｍ０的支架浸入无水乙醇中ꎬ真空脱泡３０ｍｉｎꎬ直至支架完全被无水乙醇所饱和ꎬ加入乙醇直至比重瓶充满相同刻度ꎬ再次称重ꎬ记为Ｍ２ꎮ取出充盈乙醇的样品ꎬ称量剩余的液体与比重瓶质量ꎬ记为Ｍ３ꎮ支架孔隙率ε计算如下式所示:ε/％＝Ｍ２－Ｍ３－Ｍ０Ｍ１－Ｍ３ˑ１００(２)１.４.６㊀生物降解率支架的体外酶降解实验根据支架在含酶的磷酸盐缓冲液中孵育后的残留量百分比来评价支架的降解行为ꎮ真空干燥后的支架质量记录为Ｍ１ꎬ然后用含１０ｍｇ/ｍＬ溶菌酶的ＰＢＳ缓冲液(ｐＨ７.４)３７ħ浸泡４周ꎮ在规定的时间间隔(７㊁１４㊁２１㊁２８ｄ)取出样品ꎬ真空干燥２４ｈꎬ称重记为Ｍｔꎮ生物降解率δ计算如下式所示:δ/％＝Ｍ１－ＭｔＭ１ˑ１００(３)１.４.７㊀机械性能使用ＥＴＭ系列通用万能试验机(深圳万测试验设备有限公司)进行压缩机械测试ꎮ在每次测试之前测量样品大小ꎬ支架样品为直径约１０ｍｍ㊁高１５~１８ｍｍ的圆柱体ꎬ水平头速度设定为２ｍｍ/ｍｉｎꎬ当压缩位移达到１０ｍｍ时停止加压ꎮ然后绘制应力应变曲线以评估支架的机械性ꎬ应力应变曲２第６０卷㊀第１１期丝素蛋白明胶壳聚糖羟基磷灰石多孔支架的制备及性能评估线初始线性阶段的斜率为弹性模量ꎬ每组３个平行样ꎮ１.５㊀生物性能表征１.５.１㊀软骨细胞的提取和鉴定本研究经大连大学附属中山医院伦理委员会批准(伦理审查批件２０２１０７３１)ꎬ并获得所有研究对象的知情同意ꎮ纳入２０２１年１１月因骨关节炎行全膝关节置换术的患者１例(年龄５２岁ꎬ职业木工)ꎮ收集膝关节置换术中切除的股骨髁软骨ꎬ无菌条件下转移至在超净工作台ꎬ使用含无菌ＰＢＳ缓冲液连续漂洗２~３次ꎬ分离出光滑透亮的透明软骨组织薄片ꎬ切成２ｍｍ大小的组织块ꎬ之后使用５倍体积的０.２％Ⅱ型胶原酶消化过夜(３７ħ和５％ＣＯ２恒温培养箱)ꎮ消化结束后使用１００μｍ细胞滤器过滤ꎬ然后终止消化ꎬ将获得的细胞悬液在室温下以１５００ｒ/ｍｉｎ的速度离心５ｍｉｎꎬ收集细胞沉淀ꎬ重悬后接种到Ｔ２５ｃｍ２培养瓶ꎬ在３７ħ和５％ＣＯ２的细胞孵箱中培养ꎬ２４ｈ后更换一次培养液以去除未贴壁的细胞ꎮ此后每３ｄ换液一次ꎬ建立原代培养ꎬ当贴壁细胞达到９０％汇合时ꎬ用无菌ＰＢＳ缓冲液洗涤后使用胰蛋白酶(含ＥＤＴＡ)进行消化处理并将细胞以１︰２的传代比例重新接种以进行传代培养ꎬ直到细胞达到第２代ꎬ使用甲苯胺蓝染色对软骨细胞进行鉴定ꎮ１.５.２㊀支架接种前的处理将支架样品切成直径１０ｍｍ㊁厚度１~２ｍｍ的薄片ꎬ在紫外光下用７５％酒精消毒过夜ꎬ然后用无菌ＰＢＳ缓冲液彻底冲洗３次ꎮ在细胞培养之前ꎬ通过在３７ħ的培养箱中浸入ＤＭＥＭ中２ｈ将支架预润湿ꎮ１.５.３㊀黏附率取传代培养至第２代的软骨细胞悬液ꎬ将含有１０５个/ｍＬ细胞(Ａ０)的细胞悬液１００μＬ接种在预先润湿的支架上ꎬ然后添加培养基至３００μＬꎬ并在接种２㊁４㊁６ｈ后测量黏附率ꎮ从孔中取出支架ꎬ用细胞计数板(Ａ１)计数细胞数ꎬ去除所有培养基溶液后ꎬ消化并计算黏附在孔壁上的细胞(Ａ２)ꎮ细胞黏附率θ计算如下式所示:θ/％＝Ａ０－Ａ１－Ａ２Ａ０ˑ１００(４)每组进行３次实验ꎬ得到平均黏附率ꎮ１.５.４㊀增殖率使用ＣＣＫ￣８法检测支架上软骨细胞的增殖ꎬ将软骨细胞接种在支架上(每个支架１０４个细胞)ꎬ４８孔板每孔添加培养基至３００μＬꎮ每３天更换一次培养基ꎬ经过１㊁４㊁７㊁１０ｄ培养后ꎬ３０μＬＣＣＫ￣８的反应溶液加入到每个孔中ꎬ并在３７ħ温育４ｈꎮ然后将１００μＬ含有ＣＣＫ￣８反应液的培养基转移到９６孔细胞培养板中ꎬ使用Ｂｉｏｔｅｋ８００ＴＳ酶标仪(美国伯腾仪器有限公司)在４５０ｎｍ处读取吸光度ꎬ绘制生长曲线ꎬ所有实验一式三份进行ꎮ１.５.５㊀活死细胞染色细胞接种３ｄ后使用Ｌｉｖｅ/Ｄｅａｄ试剂盒进行染色ꎬ观察细胞在支架样品上的分布ꎮ该试剂盒分别用碘化丙啶和ＣａｌｃｅｉｎＡＭ对死细胞㊁活细胞进行染色ꎬ并在细胞培养箱中孵育３０ｍｉｎ后ꎬ使用ＴＸＭ￣５００Ｃ荧光显微镜(上海天省光学仪器有限公司)观察ꎮ１.６㊀统计分析多组样本间的比较使用ＳＰＳＳ２０.０软件进行ＡＮＯＶＡ单因素方差分析ꎬ然后进行Ｔｕｋｅｙ ｓ检验ꎬ以确定组间测量数据的差异ꎮ独立样本数据的比较使用ｔ检验ꎬ重复测量数据使用球形检验ꎬ认为ｐ<０.０５具有统计学意义ꎮ置信度记号标为:∗表示ｐ<０.０５ꎬ∗∗表示ｐ<０.０１ꎬ∗∗∗表示ｐ<０.００１)ꎮ２㊀结果和分析２.１㊀物理性能２.１.１㊀大体外观５组ＳＦ￣ＣＳ￣Ｇｅｌ￣ｎＨａｐ多孔支架均为直径１０ｍｍ左右的白色圆柱体ꎬ随着支架内Ｈａｐ质量分数的增加ꎬ支架底部可见少量沉积的羟基磷灰石ꎬ质量分数越高沉积越多ꎬ如图１所示ꎮ图１㊀ＳＦ￣ＣＳ￣Ｇｅｌ￣ｎＨａｐ多孔支架大体外观Ｆｉｇ.１㊀ＧｅｎｅｒａｌａｐｐｅａｒａｎｃｅｏｆＳＦ￣ＣＳ￣Ｇｅｌ￣ｎＨａｐｓｃａｆｆｏｌｄｓ２.１.２㊀扫描电镜观察各组支架扫描电镜图像如图２所示ꎮ由图２可见ꎬＨａｐ￣１％支架㊁Ｈａｐ￣２％支架㊁Ｈａｐ￣３％支架㊁Ｈａｐ￣４％支架具有多孔结构ꎬＨａｐ￣１％支架的平均孔径最大ꎬ为(２２５.１４ʃ５３.６３)μｍꎻＨａｐ￣２％支架㊁Ｈａｐ￣３％支架㊁Ｈａｐ￣４％支架的孔径分别为(２１２ ８９ʃ６２.２２)μｍ㊁(１７１.３０ʃ３１.８７)μｍ㊁(１６９.７３ʃ２６ １９)μｍꎻＨａｐ￣５％支架的平均孔径最小ꎬ为(１３６.１１ʃ２０ ４６)μｍꎮ当支架内Ｈａｐ的质量分数在１％~４％变化时ꎬ支架能保持高度多孔的网络结构和良好的孔间联通性ꎬ随着Ｈａｐ在支架中质量分数的增加ꎬ多孔材料的孔径有所减小ꎬ支架的联通性下降ꎻ当Ｈａｐ的质量分数达到５％及以上时ꎬ可以明显看到过量的羟基磷灰石沉积在多孔支架的孔壁上ꎬ逐渐堵塞支架的孔道ꎮ合适的微观结构和孔径ꎬ能够提供迁移细胞㊁运输营养物质和代谢物㊁信号分子和细胞废物[１１￣１２]ꎮ３Ｖｏｌ.６０㊀Ｎｏ.１１Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎａｎｄｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅｅｖａｌｕａｔｉｏｎｏｆｓｉｌｋｐｒｏｔｅｉｎ￣ｇｅｌａｔｉｎ￣ｃｈｉｔｏｓａｎ￣ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅｐｏｒｏｕｓｓｃａｆｆｏｌｄｓ图２㊀ＳＦ￣ＣＳ￣Ｇｅｌ￣ｎＨａｐ多孔支架电镜图像Ｆｉｇ.２㊀ＥｌｅｃｔｒｏｎｍｉｃｒｏｇｒａｐｈｏｆＳＦ￣ＣＳ￣Ｇｅｌ￣ｎＨａｐｐｏｒｏｕｓｓｃａｆｆｏｌｄｓ２.１.３㊀ＸＲＤ晶型分析通过ＸＲＤ对ＳＦ￣ＣＳ￣Ｇｅｌ￣ｎＨａｐ多孔支架的晶型结构进行了分析ꎬＳＦ￣ＣＳ￣Ｇｅｌ￣ｎＨａｐ支架的ＸＲＤ图谱如图３所示ꎮ由图３可见ꎬ２θ在２５.７ʎ㊁３２.２ʎ㊁３３.０ʎ㊁３４.３ʎ㊁４０.３ʎ㊁４６.６ʎ和４９.６ʎ附近能观察到羟基磷灰石的特征峰ꎮ对比低质量分数和高质量分数Ｈａｐ的复合支架材料的ＸＲＤ图谱ꎬ还可以观察到羟基磷灰石少量水解和新的磷酸钙化合物生成ꎮ这是因为冰乙酸溶解壳聚糖为溶液提供了酸性环境ꎬ微酸条件下部分羟基磷灰石发生水解ꎬ从而形成新的磷酸钙化合物(２θ＝２８.４ʎ和２９ １ʎ)ꎬ有研究指出磷酸钙化合物的存在不会干扰支架的生物活性或生物相容性[１０ꎬ１３]ꎮ图３㊀ＳＦ￣ＣＳ￣Ｇｅｌ￣ｎＨａｐ支架ＸＲＤ图谱Ｆｉｇ.３㊀ＸＲＤａｔｌａｓｏｆＳＦ￣ＣＳ￣Ｇｅｌ￣ｎＨａｐｐｏｒｏｕｓｓｃａｆｆｏｌｄｓ２.１.４㊀元素分析电镜扫描和ＸＲＤ晶型分析证实ꎬ在多孔复合材料表面沉积层中存在结晶簇聚集体ꎬ如图２(ｆ)所示ꎮ为了确保添加的Ｈａｐ颗粒确实存在于复合材料中ꎬ本研究对ＳＦ￣ＣＳ￣Ｇｅｌ￣ｎＨａｐ多孔支架进行了元素分析ꎮＸ射线能谱分析仪(ＥｎｅｒｇｙＤｉｓｐｅｒｓｉｖｅＡｎａｌｙｓｉｓｏｆＸ￣ｒａｙｓꎬＥＤＡＸ)元素检测的结果表明ꎬ结晶簇的主要元素是Ｃａ和Ｐꎬ如图４所示ꎮ检测到的结晶簇聚集体内的Ｃａ/Ｐ比值约为１.７４ꎬ其值与化学计量羟基磷灰石中的Ｃａ/Ｐ比值１.６７接近[１４￣１５]ꎬ据文献报道稳定的Ｈａｐ相对应的Ｃａ/Ｐ比值在１.３~１.８[１６]ꎬ表明Ｈａｐ在支架基质内能够稳定存在ꎮ图４㊀ＳＦ￣ＣＳ￣Ｇｅｌ￣ｎＨａｐ多孔支架元素分析Ｆｉｇ.４㊀ＥｌｅｍｅｎｔａｌａｎａｌｙｓｉｓｏｆＳＦ￣ＣＳ￣Ｇｅｌ￣ｎＨａｐｐｏｒｏｕｓｓｃａｆｆｏｌｄｓ４第６０卷㊀第１１期丝素蛋白明胶壳聚糖羟基磷灰石多孔支架的制备及性能评估２.１.５㊀吸水溶胀率支架的保水性能对组织工程有重要意义ꎬ吸水溶胀率影响细胞的迁移㊁增殖和分化ꎬ也影响营养物质的运输和机械性能[１７]ꎮＳＦ￣ＣＳ￣Ｇｅｌ￣ｎＨａｐ多孔支架的吸水溶胀率如图５所示ꎬ５组支架吸水溶胀率之间的差异有统计学意义(ｐ<０.０５)ꎮＨａｐ￣１％支架和Ｈａｐ￣２％支架的吸水溶胀率最高ꎬ分别为１４６６％ʃ１７９％和１２８６％ʃ１１４％ꎻＨａｐ￣５％支架的吸水膨胀率最低ꎬ为７７１％ʃ８９％ꎮ随着ＳＦ￣ＣＳ￣Ｇｅｌ￣ｎＨａｐ复合支架内羟基磷灰石质量分数的增加ꎬ支架的吸水溶胀率明显降低ꎬ即使是Ｈａｐ￣５％支架的平均溶胀率依然大于７００％ꎮ图５㊀ＳＦ￣ＣＳ￣Ｇｅｌ￣ｎＨａｐ多孔支架溶胀率比较Ｆｉｇ.５㊀ＣｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆｓｗｅｌｌｉｎｇｒａｔｅｏｆＳＦ￣ＣＳ￣Ｇｅｌ￣ｎＨａｐｐｏｒｏｕｓｓｃａｆｆｏｌｄｓ２.１.６㊀孔隙率多孔复合支架的营养运输能力除了受材料本身亲水性能的影响外ꎬ还与支架的孔隙率㊁孔径大小及孔道联通性密切相关[１７￣１８]ꎮ因此孔隙率也是组织工程支架的重要特征之一ꎮＳＦ￣ＣＳ￣Ｇｅｌ￣ｎＨａｐ复合支架的孔隙率如图６所示ꎬ５组支架孔隙率之间的差异有统计学意义(ｐ<０.０５)ꎮＳＦ￣ＣＳ￣Ｇｅｌ￣１％Ｈａｐ支架的孔隙率最高ꎬ约为８７.２５％ʃ２.２８％ꎮＨａｐ￣２％的支架和Ｈａｐ￣３％的支架具有相似的孔隙率ꎬ分别为７６.５２％ʃ２.３１％和７２.２７％ʃ２.２８％ꎮＨａｐ￣５％支架的孔隙率最低ꎬ只有４９.４１％ʃ５.９２％ꎬ多孔支架的孔隙率随着支架内部Ｈａｐ质量分数的增加而明显降低ꎮ分析认为ꎬ这是随着复合支架内羟基磷灰石质量分数的增加ꎬ过量的羟磷灰石会沉积在多孔支架的孔壁内ꎬ堵塞孔径ꎬ使多孔支架结构通道的联通性降低ꎬ从而导致支架的孔隙率下降ꎮ孔隙率大于７０％的多孔支架被认为是细胞生存的良好空间和维持细胞生长的营养运输通道[１８]ꎬ高度多孔的结构可以提供足够的营养和气体交换ꎬ以及足够的空间供细胞增殖和附着[１９￣２０]ꎮ掺杂低质量分数Ｈａｐ的ＳＦ￣ＣＳ￣Ｇｅｌ￣ｎＨａｐ的多孔支架ꎬ不仅可以提供高度多孔的结构ꎬ为细胞的黏附㊁迁移和生长提供了很大的表面积ꎬ还能兼顾保持Ｈａｐ的生物活性和促成骨作用ꎬ也许更适合骨软骨缺损的修复ꎮ图６㊀ＳＦ￣ＣＳ￣Ｇｅｌ￣ｎＨａｐ多孔支架孔隙率比较Ｆｉｇ.６㊀ＣｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆｐｏｒｏｓｉｔｙｏｆＳＦ￣ＣＳ￣Ｇｅｌ￣ｎＨａｐｐｏｒｏｕｓｓｃａｆｆｏｌｄｓ２.１.７㊀生物降解率本研究使用溶菌酶对ＳＦ￣ＣＳ￣Ｇｅｌ￣ｎＨａｐ多孔支架进行了体外降解实验ꎬ如图７所示ꎬ５组支架生物降解率之间的差异有统计学意义(ｐ<０.０５)ꎮＨａｐ￣１％支架降解率最高４１.８％ʃ２.４７％ꎬＨａｐ￣５％支架的降解率最低２４.８９％ʃ１.１６％ꎬ支架生物降解率随着羟基磷灰石质量分数的增加而降低ꎮ这一结果与软骨下骨层多孔支架孔隙率结果一致ꎬ这可能是因为低质量分数Ｈａｐ的复合支架具有较高的孔隙率ꎬ多孔结构提供了较大的比表面积ꎬ导致溶菌酶更容易渗透进支架内部与壳聚糖㊁明胶等有机材料发生反应ꎻ另一个可能的原因是羟基磷灰石是天然骨骼的矿物质成分ꎬ本身具有优良的结合能力和原位降解缓慢等优势[１４￣１５]ꎬ因此适当添加Ｈａｐ可以改善多孔复合支架降解速度快的缺点ꎬ从而使多孔支架的生物降解速度与组织的再生重建相匹配ꎮ图７㊀ＳＦ￣ＣＳ￣Ｇｅｌ￣ｎＨａｐ多孔支架的生物降解率(ｐ<０.０５)Ｆｉｇ.７㊀ＢｉｏｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎｒａｔｅｏｆＳＦ￣ＣＳ￣Ｇｅｌ￣ｎＨａｐｐｏｒｏｕｓｓｃａｆｆｏｌｄｓ(ｐ<０.０５)２.１.８㊀机械性能机械强度也是评估软骨修复生物材料性能的最关键因素之一ꎬＳＦ￣ＣＳ￣Ｇｅｌ￣ｎＨａｐ支架的应力应变曲线如图８所示ꎮ这５Ｖｏｌ.６０㊀Ｎｏ.１１Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎａｎｄｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅｅｖａｌｕａｔｉｏｎｏｆｓｉｌｋｐｒｏｔｅｉｎ￣ｇｅｌａｔｉｎ￣ｃｈｉｔｏｓａｎ￣ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅｐｏｒｏｕｓｓｃａｆｆｏｌｄｓ次实验通过比较多孔支架的弹性模量(线性应力应变部分的斜率)和２０％形变量的抗压强度评价多孔支架的力学性能ꎬＳＦ￣ＣＳ￣Ｇｅｌ￣１％Ｈａｐ支架的抗压强度最低(１４.４４ｋＰａ)ꎬＳＦ￣ＣＳ￣Ｇｅｌ￣５％Ｈａｐ支架的抗压强度最高(４０.２８ｋＰａ)ꎬＳＦ￣ＣＳ￣Ｇｅｌ￣ｎＨａｐ多孔支架抗压强度随Ｈａｐ的质量分数增加而增大ꎬ高质量分数的Ｈａｐ的有助于提高支架的抗压强度ꎮ然而ＳＦ￣ＣＳ￣Ｇｅｌ￣ｎＨａｐ支架的弹性模量变化与抗压强度变化并不完全一致ꎬ此次实验结果显示ＳＦ￣ＣＳ￣Ｇｅｌ￣１％Ｈａｐ支架的弹性模量最低ꎬＨａｐ质量分数在２％~５％的多孔支架拥有相似的弹性模量ꎬ并不随Ｈａｐ质量分数的增加而发生明显改变ꎮ支架的机械性能影响细胞的增殖和分化ꎬ在较硬结构上生长的细胞比在较软基质上的细胞增殖更快ꎬ迁移更慢[２０]ꎮ因此用于软骨修复的支架需要足够坚固㊁有弹性和坚韧ꎬ以容纳种子细胞或从宿主组织迁移的细胞ꎬ同时具有足够的容量以抵抗反复的动态冲击而不会倒塌或压碎[２１￣２２]ꎮ图８㊀ＳＦ￣ＣＳ￣Ｇｅｌ￣ｎＨａｐ多孔支架的应力应变曲线Ｆｉｇ.８㊀Ｓｔｒｅｓｓ￣ｓｔｒａｉｎｃｕｒｖｅｓｏｆＳＦ￣ＣＳ￣Ｇｅｌ￣ｎＨａｐｐｏｒｏｕｓｓｃａｆｆｏｌｄｓ２.２㊀生物性能理想组织工程支架需要具备多种能力ꎬ如高度水合的三维结构和高含水量㊁合适的孔径和孔隙率㊁材料交换能力㊁良好的生物降解性和优越的机械性能ꎬ并能提供合适的微环境和高效的生物相容性和高强度[２２]ꎮ综合本研究的物理性能检测结果ꎬＳＦ￣ＣＳ￣Ｇｅｌ￣２％Ｈａｐ支架更符合全层软骨缺损修复的要求ꎮ该支架具有(２１２.８９ʃ６２.２２)μｍ大小的孔径结构㊁７６.５２％ʃ２.３１％的孔隙率㊁良好的吸水溶胀率１２８６％ʃ１１４％及３７.０９％ʃ１.４１％生物降解速率与良好的机械性能ꎮ因此将ＳＦ￣ＣＳ￣Ｇｅｌ￣２％Ｈａｐ支架与骨关节炎患者的软骨细胞共培养ꎬ以进一步检测支架材料的生物性能ꎮ２.２.１㊀软骨细胞的培养和鉴定原代软骨细胞形态大多为梭形和多角形ꎬ细胞在贴壁２ｄ后开始较好地附着在细胞培养瓶表面并开始增殖ꎬ并在７~９ｄ后达到９０％的汇合状态ꎮ传代细胞表现出相似的形态ꎬ绝大数细胞表现为多角形ꎬ表面多树突状突起ꎬ随着培养时间增加ꎬ树突状突起伸展为细长触丝ꎬ如图９所示ꎮ使用甲苯胺蓝对提取的原代细胞进行染色ꎬ细胞核被染成紫蓝色ꎬ胞核偏向一侧ꎬ未见肥大样细胞ꎬ符合软骨细胞的特征ꎬ如图９(ｃ)所示ꎮ图９㊀软骨细胞的培养及鉴定Ｆｉｇ.９㊀Ｃｕｌｔｕｒｅａｎｄｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅｓ２.２.２㊀黏附率理想的生物支架可以改善细胞黏附㊁细胞分化和与周围天然组织的整合[１０]ꎮ本研究比较了ＳＦ￣ＣＳ￣Ｇｅｌ￣２％Ｈａｐ支架在接种细胞２㊁４㊁６ｈ后的黏附率ꎬ如图１０所示ꎮ由图１０可见ꎬ软骨细胞能与支架良好黏附ꎬ细胞种板后６ｈ内可成功黏附于支架网状纤维上ꎬ表明ＳＦ￣ＣＳ￣Ｇｅｌ￣２％Ｈａｐ支架很好地保持材料优良的生物活性ꎮ图１０㊀细胞黏附率Ｆｉｇ.１０㊀Ｃｅｌｌａｄｈｅｓｉｏｎｒａｔｅ２.２.３㊀增殖率本研究使用ＣＣＫ￣８法检测软骨细胞在ＳＦ￣ＣＳ￣Ｇｅｌ￣２％Ｈａｐ支架的增殖表达ꎬ如图１１所示ꎮ由图１１可见ꎬ单纯软骨细胞组增殖曲线呈Ｓ形ꎬ而仿生支架共培养组软骨细胞在连续共培养１０ｄ后ꎬ生长增殖曲线仍然呈明显上升趋势ꎬ保持６第６０卷㊀第１１期丝素蛋白明胶壳聚糖羟基磷灰石多孔支架的制备及性能评估有良好的细胞活力ꎬ未观察到明显的接触抑制效应ꎮ这主要是因为软骨细胞在普通培养皿表面贴壁生长ꎬ细胞增殖存在明显的接触抑制效应ꎬ但是三维立体培养可以避免这种效应ꎮ结果表明ꎬ本研究制备的ＳＦ￣ＣＳ￣Ｇｅｌ￣２％Ｈａｐ多孔支架具有良好细胞相容性ꎬ能够为种子细胞提供良好的生长微环境ꎬ三维立体培养比二维平面扩展生长具有更大的增殖效率ꎮ图１１㊀细胞增殖率Ｆｉｇ.１１㊀Ｃｅｌｌｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｒａｔｅ２.２.４㊀活死染色为了直观地观察细胞在支架上的状态和活性ꎬ共培养一段时间后使用Ｌｉｖｅ/Ｄｅａｄ试剂盒进行染色ꎬ然后通过荧光显微镜观察(１０ˑ１０倍)ꎬ如图１２所示ꎬ绿色代表活细胞ꎬ而红色代表死细胞ꎮ由图１２可见ꎬＳＦ￣ＣＳ￣Ｇｅｌ支架上的大部分细胞呈现绿色荧光ꎬ少见死细胞ꎬ支架上细胞表现出高存活率和低细胞毒性ꎬ表明本研究所制备的多孔支架具有良好的生物相容性ꎮ图１２㊀活/死细胞染色Ｆｉｇ.１２㊀Ｌｉｖｅ/ｄｅａｄｃｅｌｌｓｔａｉｎｉｎｇ３㊀结㊀论基于明胶㊁壳聚糖㊁丝素蛋白和纳米羟基磷灰石制备的ＳＦ￣ＣＳ￣Ｇｅｌ￣ｎＨａｐ三维多孔复合支架不仅可以模拟天然骨软骨的ＥＣＭꎬ而且具有良好的生物相容性ꎬ能够为营养物质的转运和细胞附着㊁增殖和立体生长提供良好的网状骨架ꎬ从而为全层软骨缺损的治疗提供新的选择ꎮ«丝绸»官网下载㊀中国知网下载参考文献:[１]ＤＡＯＵＦꎬＣＯＣＨＩＳＡꎬＬＥＩＧＨＥＢＭꎬｅｔａｌ.Ｃｕｒｒｅｎｔａｄｖａｎｃｅｓｉｎｔｈｅｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｏｆｄｅｇｅｎｅｒａｔｅｄａｒｔｉｃｕｌａｒｃａｒｔｉｌａｇｅ:Ａｌｉｔｅｒａｔｕｒｅｒｅｖｉｅｗｏｎｔｉｓｓｕｅｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇａｎｄｉｔｓｒｅｃｅｎｔｃｌｉｎｉｃａｌｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ[Ｊ].Ｍａｔｅｒｉａｌｓꎬ２０２１ꎬ１５(１):３１.[２]ＴＨＵＮＳＩＲＩＫꎬＰＩＴＪＡＭＩＴＳꎬＰＯＴＨＡＣＨＡＲＯＥＮＰꎬｅｔａｌ.Ｔｈｅ３Ｄ￣ｐｒｉｎｔｅｄｂｉｌａｙｅｒ ｓｂｉｏａｃｔｉｖｅ￣ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓｓｃａｆｆｏｌｄｆｏｒｆｕｌｌ￣ｔｈｉｃｋｎｅｓｓａｒｔｉｃｕｌａｒｃａｒｔｉｌａｇｅｄｅｆｅｃｔｓｔｒｅａｔｍｅｎｔ[Ｊ].Ｍａｔｅｒｉａｌｓꎬ２０２０ꎬ１３(１５):１￣２６.[３]ＴＳＡＮＡＫＴＳＩＤＯＵＥꎬＫＡＭＭＯＮＡＯꎬＫＩＰＡＲＩＳＳＩＤＥＳＣ.Ｒｅｃｅｎｔｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓｉｎｈｙａｌｕｒｏｎｉｃａｃｉｄ￣ｂａｓｅｄｈｙｄｒｏｇｅｌｓｆｏｒｃａｒｔｉｌａｇｅｔｉｓｓｕｅｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ[Ｊ].Ｐｏｌｙｍｅｒｓꎬ２０２２ꎬ１４(４):８３９.[４]ＲＡＤＵＬＥＳＣＵＤＭꎬＮＥＡＣＳＵＩＡꎬＧＲＵＭＥＺＥＳＣＵＡＭꎬｅｔａｌ.Ｎｅｗｉｎｓｉｇｈｔｓｏｆｓｃａｆｆｏｌｄｓｂａｓｅｄｏｎｈｙｄｒｏｇｅｌｓｉｎｔｉｓｓｕｅｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ[Ｊ].Ｐｏｌｙｍｅｒｓꎬ２０２２ꎬ１４(４):７９９.[５]ＳＵＮＷＺꎬＧＲＥＧＯＲＹＤＡꎬＴＯＭＥＨＭＡꎬｅｔａｌ.Ｓｉｌｋｆｉｂｒｏｉｎａｓａｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｆｏｒｔｉｓｓｕｅｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ[Ｊ].ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＪｏｕｒｎａｌＭｏｌｅｃｕｌａｒＳｃｉｅｎｃｅｓꎬ２０２１ꎬ２２(３):１￣２８.[６]ＬＩＹＳꎬＺＨＡＮＧＹＬꎬＷＥＩＹꎬｅｔａｌ.Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｏｆｃｈｉｔｏｓａｎ￣ｂａｓｅｄｉｎｊｅｃｔａｂｌｅｈｙｄｒｏｇｅｌｓａｎｄｉｔｓａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｉｎ３Ｄｃｅｌｌｃｕｌｔｕｒｅ[Ｊ].ＪｏｕｒｎａｌｏｆＶｉｓｕａｌｉｚｅｄＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓꎬ２０１７(１２７):ｅ５６２５３.[７]ＬＩＪＱꎬＷＡＮＧＱＫꎬＧＵＹＢꎬｅｔａｌ.Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆｃｏｍｐｏｓｉｔｅｓｃａｆｆｏｌｄｃｏｎｔａｉｎｉｎｇｓｉｌｋｆｉｂｒｏｉｎꎬｃｈｉｔｏｓａｎꎬａｎｄｇｅｌａｔｉｎｆｏｒ３Ｄｃｅｌｌｃｕｌｔｕｒｅａｎｄｂｏｎｅｔｉｓｓｕｅｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ[Ｊ].ＭｅｄｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅＭｏｎｉｔｏｒꎬ２０１７ꎬ２３:５３１１￣５３２０.[８]ＳＨＡＮＧＬＬꎬＭＡＢＪꎬＷＡＮＧＦＬꎬｅｔａｌ.Ｎａｎｏｔｅｘｔｕｒｅｄｓｉｌｋｆｉｂｒｏｉｎ/ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅｂｉｏｍｉｍｅｔｉｃｂｉｌａｙｅｒｔｏｕｇｈｓｔｒｕｃｔｕｒｅｒｅｇｕｌａｔｅｄｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ/ｃｈｏｎｄｒｏｇｅｎｉｃｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｏｆｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓｆｏｒｏｓｔｅｏｃｈｏｎｄｒａｌｒｅｐａｉｒ[Ｊ].ＣｅｌｌＰｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎꎬ２０２０ꎬ５３(１１):ｅ１２９１７.[９]ＧＲＡＢＳＫＡ￣ＺＩＥＬＩＳＫＡＳꎬＳＩＯＮＫＯＷＳＫＡＡꎬＣＡＲＶＡＬＨＯÂꎬｅｔａｌ.Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓｗｉｔｈｐｏｔｅｎｔｉａｌｕｓｅｉｎｂｏｎｅｔｉｓｓｕｅｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ￣ｃｏｌｌａｇｅｎ/ｃｈｉｔｏｓａｎ/ｓｉｌｋｆｉｂｒｏｉｎｓｃａｆｆｏｌｄｓｃｒｏｓｓ￣ｌｉｎｋｅｄｂｙＥＤＣ/ＮＨＳ[Ｊ].Ｍａｔｅｒｉａｌｓꎬ２０２１ꎬ１４(５):１￣２０.[１０]ＹＥＰꎬＹＵＢꎬＤＥＮＧＪꎬｅｔａｌ.Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆｓｉｌｋｆｉｂｒｏｉｎ/ｃｈｉｔｏｓａｎ/ｎａｎｏ￣ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅｃｏｍｐｏｓｉｔｅｓｃａｆｆｏｌｄｉｎｔｈｅｒｅｐａｉｒｏｆｒａｂｂｉｔｒａｄｉａｌｂｏｎｅｄｅｆｅｃｔ[Ｊ].ＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌａｎｄＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃＭｅｄｉｃｉｎｅꎬ２０１７ꎬ１４(６):５５４７￣５５５３.[１１]ＸＩＡＯＨＬꎬＨＵＡＮＧＷＬꎬＸＩＯＮＧＫꎬｅｔａｌ.Ｏｓｔｅｏｃｈｏｎｄｒａｌｒｅｐａｉｒｕｓｉｎｇｓｃａｆｆｏｌｄｓｗｉｔｈｇｒａｄｉｅｎｔｐｏｒｅｓｉｚｅｓｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄｗｉｔｈｓｉｌｋｆｉｂｒｏｉｎꎬ７Ｖｏｌ.６０㊀Ｎｏ.１１Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎａｎｄｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅｅｖａｌｕａｔｉｏｎｏｆｓｉｌｋｐｒｏｔｅｉｎ￣ｇｅｌａｔｉｎ￣ｃｈｉｔｏｓａｎ￣ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅｐｏｒｏｕｓｓｃａｆｆｏｌｄｓｃｈｉｔｏｓａｎꎬａｎｄｎａｎｏ￣ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ[Ｊ].ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＪｏｕｒｎａｌＮａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅꎬ２０１９ꎬ１４:２０１１￣２０２７.[１２]ＡＳＡＤＰＯＵＲＳꎬＫＡＲＧＯＺＡＲＳꎬＭＯＲＡＤＩＬꎬｅｔａｌ.Ｎａｔｕｒａｌｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｂａｓｅｄｃｏｍｐｏｓｉｔｅｓｃａｆｆｏｌｄｓｆｒｏｍｓｉｌｋｆｉｂｒｏｉｎꎬｇｅｌａｔｉｎａｎｄｃｈｉｔｏｓａｎｔｏｗａｒｄｔｉｓｓｕｅｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ[Ｊ].ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＭａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓꎬ２０２０ꎬ１５４:１２８５￣１２９４. [１３]ＡＢＰＥＩＫＡＲＺꎬＭＯＲＡＤＩＬꎬＪＡＶＤＡＮＩＭꎬｅｔａｌ.Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｍａｃｒｏｐｏｒｏｕｓｐｏｌｙｃａｐｒｏｌａｃｔｏｎｅ/ｓｉｌｋｆｉｂｒｏｉｎ/ｇｅｌａｔｉｎ/ａｓｃｏｒｂｉｃａｃｉｄｃｏｍｐｏｓｉｔｅｓｃａｆｆｏｌｄｓａｎｄｉｎｖｉｖｏｒｅｓｕｌｔｓｉｎａｒａｂｂｉｔｍｏｄｅｌｆｏｒｍｅｎｉｓｃｕｓｃａｒｔｉｌａｇｅｒｅｐａｉｒ[Ｊ].Ｃａｒｔｉｌａｇｅꎬ２０２１ꎻ１３(２):１５８３Ｓ￣１６０１Ｓ. [１４]ＱＩＸＮꎬＭＯＵＺＬꎬＺＨＡＮＧＪꎬｅｔａｌ.Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｏｆｃｈｉｔｏｓａｎ/ｓｉｌｋｆｉｂｒｏｉｎ/ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅｐｏｒｏｕｓｓｃａｆｆｏｌｄａｎｄｉｔｓｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓｉｎｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｔｏｂｉ￣ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓｃａｆｆｏｌｄｓ[Ｊ].ＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｍｅｄｉｃａｌＭａｔｅｉａｌｓＲｅｓｅａｒｃｈＰａｒｔＡꎬ２０１４ꎬ１０２(２):３６６￣３７２.[１５]ＲＡＴＮＡＹＡＫＥＪＴＢꎬＭＵＣＡＬＯＭꎬＤＩＡＳＧＪ.Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅｓｆｏｒｂｏｎｅｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ:Ａｒｅｖｉｅｗｏｆｃｕｒｒｅｎｔｔｒｅｎｄｓ[Ｊ].ＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｍｅｄｉｃａｌＭａｔｅｒｉａｌｓＲｅｓｅａｒｃｈＰａｒｔＢ:ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓꎬ２０１７ꎬ１０５(５):１２８５￣１２９９.[１６]ＤＨＩＶＹＡＳꎬＳＡＲＡＶＡＮＡＮＳꎬＳＡＳＴＲＹＴＰꎬｅｔａｌ.Ｎａｎｏｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ￣ｒｅｉｎｆｏｒｃｅｄｃｈｉｔｏｓａｎｃｏｍｐｏｓｉｔｅｈｙｄｒｏｇｅｌｆｏｒｂｏｎｅｔｉｓｓｕｅｒｅｐａｉｒｉｎｖｉｔｒｏａｎｄｉｎｖｉｖｏ[Ｊ].ＪｏｕｒｎａｌｏｆＮａｎｏｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙꎬ２０１５ꎬ１３:１￣１３.[１７]ＢＡＯＷＲꎬＬＩＭＬꎬＹＡＮＧＹＹꎬｅｔａｌ.Ａｄｖａｎｃｅｍｅｎｔｓａｎｄｆｒｏｎｔｉｅｒｓｉｎｔｈｅｈｉｇｈｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅｏｆｎａｔｕｒａｌｈｙｄｒｏｇｅｌｓｆｏｒｃａｒｔｉｌａｇｅｔｉｓｓｕｅｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ[Ｊ].ＦｒｏｎｔｉｅｒｓｉｎＣｈｅｍｉｓｔｒｙꎬ２０２０ꎬ８:１￣１８. [１８]ＰＵＰＰＩＤꎬＣＨＩＥＬＬＩＮＩＦꎬＰＩＲＡＳＡＭꎬｅｔａｌ.Ｐｏｌｙｍｅｒｉｃｍａｔｅｒｉａｌｓｆｏｒｂｏｎｅａｎｄｃａｒｔｉｌａｇｅｒｅｐａｉｒ[Ｊ].ＰｒｏｇｒｅｓｓｉｎＰｏｌｙｍｅｒＳｃｉｅｎｃｅꎬ２０１０ꎬ３５(４):４０３￣４４０.[１９]ＶＯＬＰＩＭꎬＰＡＲＡＤＩＳＯＡꎬＣＯＳＴＡＮＴＩＮＩＭꎬｅｔａｌ.Ｈｙｄｒｏｇｅｌ￣ｂａｓｅｄｆｉｂｅｒｂｉｏｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓｆｏｒｓｋｅｌｅｔａｌｍｕｓｃｌｅｔｉｓｓｕｅｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ[Ｊ].ＡＣＳＢｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓＳｃｉｅｎｃｅ＆Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇꎬ２０２２ꎬ８(２):３７９￣４０５.[２０]ＣＯＳＴＡＮＴＩＮＩＭꎬＴＥＳＴＡＳꎬＦＯＲＮＥＴＴＩＥꎬｅｔａｌ.Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇｍｕｓｃｌｅｎｅｔｗｏｒｋｓｉｎ３Ｄｇｅｌａｔｉｎｍｅｔｈａｃｒｙｌｏｙｌｈｙｄｒｏｇｅｌｓ:Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｏｆｍｅｃｈａｎｉｃａｌｓｔｉｆｆｎｅｓｓａｎｄｇｅｏｍｅｔｒｉｃａｌｃｏｎｆｉｎｅｍｅｎｔ[Ｊ].ＦｒｏｎｔｉｅｒｓｉｎＢｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇａｎｄＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙꎬ２０１７ꎬ５:１￣８.[２１]ＨＡＦＥＺＩＭꎬＫＨＯＲＡＳＡＮＩＳＮꎬＺＡＲＥＭꎬｅｔａｌ.Ａｄｖａｎｃｅｄｈｙｄｒｏｇｅｌｓｆｏｒｃａｒｔｉｌａｇｅｔｉｓｓｕｅｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ:Ｒｅｃｅｎｔｐｒｏｇｒｅｓｓａｎｄｆｕｔｕｒｅｄｉｒｅｃｔｉｏｎｓ[Ｊ].Ｐｏｌｙｍｅｒｓꎬ２０２１ꎬ１３(２３):１￣３５.[２２]ＭＥＬＬＡＴＩＡꎬＦＡＮＣＭꎬＴＡＭＡＹＯＬＡꎬｅｔａｌ.Ｍｉｃｒｏｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ３Ｄｃｅｌｌ￣ｌａｄｅｎｔｈｅｒｍｏｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｈｙｄｒｏｇｅｌｓｆｏｒｍｉｍｉｃｋｉｎｇｃｅｌｌｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙａｎｄｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎｉｎｃａｒｔｉｌａｇｅｔｉｓｓｕｅｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ[Ｊ].ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙａｎｄＢｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇꎬ２０１７ꎬ１１４(１):２１７￣２３１. [２３]ＬＩＬꎬＹＵＦꎬＺＨＥＮＧＬＭꎬｅｔａｌ.Ｎａｔｕｒａｌｈｙｄｒｏｇｅｌｓｆｏｒｃａｒｔｉｌａｇｅｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ:Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎꎬｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎａｎｄａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ[Ｊ].ＪｏｕｒｎａｌｏｆＯｒｔｈｏｐａｅｄｉｃＴｒａｎｓｌａｔｉｏｎꎬ２０１８ꎬ１７:２６￣４１.８第６０卷㊀第１１期丝素蛋白明胶壳聚糖羟基磷灰石多孔支架的制备及性能评估Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎａｎｄｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅｅｖａｌｕａｔｉｏｎｏｆｓｉｌｋｐｒｏｔｅｉｎ￣ｇｅｌａｔｉｎ￣ｃｈｉｔｏｓａｎ￣ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅｐｏｒｏｕｓｓｃａｆｆｏｌｄｓＧＵＭｉｎｇｘｉ１ＷＡＮＧＣｈａｎｇｃｈｅｎｇ２ＴＩＡＮＦｅｎｇｄｅ３ＨＡＯＲｕｉｈｕ３ＡＮＮｉｎｇ３ＧＵＯＬｉｎ３１.ＩｎｔｅｒｎａｌＭｅｄｉｃａｌ ＰｅｋｉｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＳｈｅｎｚｈｅｎＨｏｓｐｉｔａｌ Ｓｈｅｎｚｈｅｎ５１８０００Ｃｈｉｎａ ２.ＦａｃｕｌｔｙｏｆＭｅｄｉｃｉｎｅ ＤａｌｉａｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｄａｌｉａｎ１１６０８１Ｃｈｉｎａ ３.ＯｒｔｈｏｐｅｄｉｃＫｎｅｅＪｏｉｎｔａｎｄＢｏｎｅＴｕｍｏｒｓ ＡｆｆｉｌｉａｔｅｄＺｈｏｎｇｓｈａｎＨｏｓｐｉｔａｌｏｆＤａｌｉａｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｄａｌｉａｎ１１６００１ＣｈｉｎａＡｂｓｔｒａｃｔ Ｔｏｔａｌａｒｔｉｃｕｌａｒｃａｒｔｉｌａｇｅｄｅｆｅｃｔｓａｒｅｕｓｕａｌｌｙａｃｃｏｍｐａｎｉｅｄｂｙｓｕｂｃｈｏｎｄｒａｌｂｏｎｅｄａｍａｇｅ ａｎｄｔｉｓｓｕｅｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａｓａｎｉｎｔｅｒｄｉｓｃｉｐｌｉｎａｒｙｔｅｃｈｎｉｑｕｅｃｏｍｂｉｎｉｎｇｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇａｎｄｃｅｌｌｂｉｏｌｏｇｙ ｐｒｏｖｉｄｅｓｎｅｗｉｄｅａｓａｎｄａｐｐｒｏａｃｈｅｓｆｏｒｔｈｅｒｅｐａｉｒｏｆｔｏｔａｌｃａｒｔｉｌａｇｅｄｅｆｅｃｔｓ.Ｉｎｔｈｉｓｓｔｕｄｙ ｗｅｄｅｖｅｌｏｐｅｄａｎｅｗａｐｐｒｏａｃｈｆｏｒｔｈｅｒｅｐａｉｒｏｆｔｏｔａｌｃａｒｔｉｌａｇｅｄｅｆｅｃｔｓｂｙｕｓｉｎｇｓｉｌｋｆｉｂｒｏｉｎＳＦ ｇｅｌａｔｉｎＧｅｌ ｃｈｉｔｏｓａｎＣＳ ａｎｄｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅＨａｐ ａｓｔｈｅｂａｓｅｍａｔｅｒｉａｌｓｔｏｍｅｅｔｔｈｅｎｅｅｄｓｏｆｏｓｔｅｏｃｈｏｎｄｒａｌｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｍａｔｒｉｘＥＣＭ ａｎｄｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ￣ｃｈｏｎｄｒｏｇｅｎｉｃｂｉｐａｒｔｉｔｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ.ＦｉｖｅｇｒｏｕｐｓｏｆＳＦ￣ＣＳ￣Ｇｅｌ￣ｎＨａｐｐｏｒｏｕｓｓｃａｆｆｏｌｄｓＨａｐ￣１％Ｈａｐ￣２％Ｈａｐ￣３％Ｈａｐ￣４％ａｎｄＨａｐ￣５％ｗｉｔｈｏｕｔｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｇｒａｄｉｅｎｔｗｅｒｅｐｒｅｐａｒｅｄｂｙｖａｃｕｕｍｆｒｅｅｚｅ￣ｄｒｙｉｎｇａｎｄｃｈｅｍｉｃａｌｃｒｏｓｓ￣ｌｉｎｋｉｎｇｂｙａｄｄｉｎｇｄｉｆｆｅｒｅｎｔｃｏｎｔｅｎｔｓｏｆｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅｔｏｔｈｅｃｏ￣ｂｌｅｎｄｅｄｓｏｌｕｔｉｏｎｏｆｓｉｌｋｐｒｏｔｅｉｎ ｃｈｉｔｏｓａｎａｎｄｇｅｌａｔｉｎ.Ｔｈｅ３Ｄｐｏｒｏｕｓｃｏｍｐｏｓｉｔｅｓｃａｆｆｏｌｄｓｗｉｔｈｓｕｐｅｒｉｏｒｐｈｙｓｉｃｏｃｈｅｍｉｃａｌｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓｗｅｒｅｓｃｒｅｅｎｅｄｂｙｓｃａｎｎｉｎｇｅｌｅｃｔｒｏｎｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｘ￣ｒａｙｄｉｆｆｒａｃｔｏｍｅｔｒｙＸＲＤ ａｎｄｔｈｅｓｔｕｄｙｏｆｐｏｒｏｓｉｔｙ ｗａｔｅｒａｂｓｏｒｐｔｉｏｎａｎｄｓｗｅｌｌｉｎｇ ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎｒａｔｅｓａｎｄｍｅｃｈａｎｉｃａｌｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ.Ｔｈｅｓｃａｆｆｏｌｄｓｗｅｒｅｔｈｅｎｃｏ￣ｃｕｌｔｕｒｅｄｗｉｔｈｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅｓｉｓｏｌａｔｅｄａｎｄｅｘｔｒａｃｔｅｄｆｒｏｍｐａｔｉｅｎｔｓｗｉｔｈｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ.Ｔｈｅｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓｏｆｔｈｅｐｏｒｏｕｓｓｃａｆｆｏｌｄｓｗｅｒｅｅｖａｌｕａｔｅｄｂｙｃｅｌｌａｄｈｅｓｉｏｎｒａｔｅｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｃｅｌｌｌｉｖｅ￣ｄｅａｄｓｔａｉｎｉｎｇａｎｄＣＣＫ￣８ｃｅｌｌａｃｔｉｖｉｔｙｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎａｓｓａｙｔｏｅｘｐｌｏｒｅｔｈｅｆｅａｓｉｂｉｌｉｔｙｏｆｔｈｅｉｒｕｓｅｆｏｒｒｅｐａｉｒｉｎｇｔｏｔａｌｃａｒｔｉｌａｇｅｄｅｆｅｃｔｓ.Ａｌｌｆｉｖｅｇｒｏｕｐｓｏｆｓｃａｆｆｏｌｄｓｈａｄｐｏｒｏｕｓｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄｔｈｅｗａｔｅｒａｂｓｏｒｐｔｉｏｎｓｗｅｌｌｉｎｇａｎｄｐｏｒｏｓｉｔｙｏｆＳＦ￣ＣＳ￣Ｇｅｌ￣ｎＨａｐｐｏｒｏｕｓｓｃａｆｆｏｌｄｄｅｃｒｅａｓｅｄｗｉｔｈｉｎｃｒｅａｓｉｎｇＨａｐｃｏｎｔｅｎｔｉｎｔｈｅｓｃａｆｆｏｌｄ ｗｈｉｌｅｔｈｅｂｉｏｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎｒａｔｅｇｒａｄｕａｌｌｙｓｌｏｗｅｄｄｏｗｎｗｉｔｈｉｎｃｒｅａｓｉｎｇＨａｐｃｏｎｔｅｎｔ.ＴｈｅＳＦ￣ＣＳ￣Ｇｅｌ￣１％Ｈａｐｓｃａｆｆｏｌｄｈａｄｔｈｅｈｉｇｈｅｓｔｗａｔｅｒａｂｓｏｒｐｔｉｏｎａｎｄｓｗｅｌｌｉｎｇｒａｔｅａｎｄｐｏｒｏｓｉｔｙｏｆ１４６６％ʃ１７９％ａｎｄ８７.２５％ʃ２.２８％ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ ｂｕｔｉｔｈａｄｔｈｅｆａｓｔｅｓｔａｎｄｌｅａｓｔｓｔａｂｌｅｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎａｎｄｐｏｏｒｍｅｃｈａｎｉｃａｌｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ.ＳＦ￣ＣＳ￣Ｇｅｌ￣２％Ｈａｐｓｃａｆｆｏｌｄｈａｄａｐｏｒｅｓｉｚｅｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆ２１２.８９ʃ６２.２２μｍ ａｐｏｒｏｓｉｔｙｏｆ７６.５２％ʃ２.３１％ｇｏｏｄｗａｔｅｒａｂｓｏｒｐｔｉｏｎａｎｄｓｗｅｌｌｉｎｇｒａｔｅｏｆ１２８６％ʃ１１４％ａｎｄａｂｉｏｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎｒａｔｅｏｆ３７.０９％ʃ１ ４１％.ＴｈｅｐｈｙｓｉｃｏｃｈｅｍｉｃａｌｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓｏｆＳＦ￣ＣＳ￣Ｇｅｌ￣２％Ｈａｐｓｃａｆｆｏｌｄｗｅｒｅｍｏｒｅｉｎｌｉｎｅｗｉｔｈｔｈｅｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓｏｆｆｕｌｌ￣ｌａｙｅｒｅｄｃａｒｔｉｌａｇｅｄｅｆｅｃｔｒｅｐａｉｒ.Ｄｕｒｉｎｇｉｔｓｃｏ￣ｃｕｌｔｕｒｅｗｉｔｈｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅｓｉｓｏｌａｔｅｄａｎｄｅｘｔｒａｃｔｅｄｆｒｏｍｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓｐａｔｉｅｎｔｓｔｈｅＳＦ￣ＣＳ￣Ｇｅｌ￣２％Ｈａｐｓｃａｆｆｏｌｄｓｈｏｗｅｄｂｅｔｔｅｒｂｉｏａｃｔｉｖｉｔｙ ｉ.ｅ.ｇｏｏｄｃｅｌｌａｄｈｅｓｉｏｎａｎｄｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ａｎｄｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｏｆＣＣＫ￣８ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎａｓｓａｙａｎｄｌｉｖｅ/ｄｅａｄｃｅｌｌｄｏｕｂｌｅ￣ｓｔａｉｎｉｎｇａｓｓａｙｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｐｏｒｏｕｓｓｃａｆｆｏｌｄｈａｄｇｏｏｄｂｉｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙａｎｄｌｏｗｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ.ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｏｆｔｈｉｓｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓｈｏｗｔｈａｔｔｈｅＳＦ￣ＣＳ￣Ｇｅｌ￣２％Ｈａｐｐｏｒｏｕｓｃｏｍｐｏｓｉｔｅｓｃａｆｆｏｌｄｐｒｅｐａｒｅｄｂａｓｅｄｏｎｇｅｌａｔｉｎ ｃｈｉｔｏｓａｎ ｓｉｌｋｆｉｂｒｏｉｎａｎｄｎａｎｏ￣ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅｃａｎｎｏｔｏｎｌｙｍｉｍｉｃｔｈｅＥＣＭｏｆｎａｔｕｒａｌｂｏｎｅｃａｒｔｉｌａｇｅ ｂｕｔａｌｓｏｈａｓｇｏｏｄｂｉｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙａｎｄｃａｎｐｒｏｖｉｄｅａｇｏｏｄｒｅｔｉｃｕｌａｒｓｋｅｌｅｔｏｎｆｏｒｎｕｔｒｉｅｎｔｔｒａｎｓｐｏｒｔａｎｄｃｅｌｌａｄｈｅｓｉｏｎ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎａｎｄｓｔｅｒｅｏｇｅｎｅｓｉｓ ｐｒｏｖｉｄｉｎｇａｎｅｗｏｐｔｉｏｎｆｏｒｔｈｅｔｒｅａｔｍｅｎｔｏｆｔｏｔａｌｃａｒｔｉｌａｇｅｄｅｆｅｃｔｓ.Ｋｅｙｗｏｒｄｓ ｔｉｓｓｕｅｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｓｃａｆｆｏｌｄ ｔｏｔａｌｃａｒｔｉｌａｇｅｄｅｆｅｃｔ ｓｉｌｋｆｉｂｒｏｉｎ ｃｈｉｔｏｓａｎ ｇｅｌａｔｉｎ ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ９。

壳聚糖明胶聚合ph
壳聚糖是一种天然高分子多糖，具有生物相容性、生物降解性和无毒性等优点。

它可以在碱性条件下进行水解反应，生成可溶性壳聚糖。

在酸性条件下，壳聚糖可以形成不溶性的聚合物。

壳聚糖具有很好的成膜性和成球性，可以作为药物控释材料、组织工程支架、化妆品添加剂等应用。

明胶是一种动物源性胶体，具有很好的水溶性、成膜性和成球性。

它可以在碱性条件下进行聚合反应，生成可溶性的明胶聚合物。

在酸性条件下，明胶可以形成不溶性的聚合物。

明胶可以作为药物控释材料、组织工程支架、化妆品添加剂等应用。

当壳聚糖和明胶聚合在一起时，它们可以形成一种具有优异性能的复合材料。

这种复合材料具有很好的成膜性、成球性和药物控释性能，可以作为药物载体、组织工程支架、化妆品添加剂等应用。

此外，这种复合材料还具有很好的耐磨性和抗冲击性能，可以用于制备高性能的材料和制品。

Embosphere微球在临床中的应用一、引言Embosphere微球，一种由明胶和白蛋白制成的微小球体，近年来在临床医学领域获得了广泛的应用。

由于其独特的物理和化学性质，Embosphere微球在血管栓塞、药物载体和组织工程等方面具有重要的应用价值。

本文将详细介绍Embosphere微球在临床中的应用及其优势。

二、Embosphere微球的性质和制备Embosphere微球是一种可生物降解的微球，由明胶和白蛋白制成。

这种微球具有较高的生物相容性，可以在体内降解，并且具有较好的药物释放性能。

通过特定的制备工艺，可以控制微球的形状、大小和药物负载量。

这些特性使得Embosphere微球在临床中具有广泛的应用。

三、Embosphere微球在临床中的应用1、血管栓塞：Embosphere微球可以作为血管栓塞剂，用于治疗各种血管疾病，如出血性脑血管病、肝血管瘤等。

通过栓塞病变血管，Embosphere微球可以有效地控制出血，减轻患者症状。

2、药物载体：Embosphere微球可以作为药物载体，用于输送抗肿瘤药物、抗生素等。

由于其具有较好的药物释放性能，可以将药物在体内缓慢释放，从而降低药物副作用，提高疗效。

3、组织工程：Embosphere微球可以作为组织工程材料，用于修复或替代受损的组织。

例如，在软骨修复中，Embosphere微球可以作为支架材料，与患者的自体细胞一起培养，形成新的软骨组织。

四、结论Embosphere微球作为一种生物相容性好、药物负载能力强、生物降解性好的生物材料，在临床医学中具有广泛的应用前景。

未来随着材料科学和生物医学工程的发展，Embosphere微球的应用领域将进一步拓展，为患者提供更加安全、有效的治疗选择。

高分子载体材料在药物传递系统中扮演着至关重要的角色。

其中，药用微球是一种由高分子材料制成的药物载体，可实现药物的控释和靶向输送。

本文将重点探讨高分子载体材料在药用微球中的应用及最新进展。