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胚胎干细胞的亚全能型

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分子生物学工具
• 粒细胞集落刺激因子受体Granulocyte colonystimulating factor receptor (G-CSFR)是细胞因子 受体I型家族成员之一，跨膜蛋白，在ES细胞里不 表达。 • 构建了G-CSFR胞外域(GRΔcyto)、G-CSFR胞外 域+LIFR胞内域(GR/LR)、G-CSFR胞外域+gp130 胞内域(GR/gp130)和G-CSFR全长的载体，稳定 转染到LIF缺乏的ES细胞中。细胞在IL-6+SIL-6R 的体系里维持。
细胞外因子与ES细胞的多能性 维持ES细胞全能性的相关信号通路
2.
一、细胞因子对干细胞亚 全能性的影响
细胞因子
细胞因子(cytokine,CK)是由细胞产生的一类在细 胞间传递信息、具有免疫调节和效应功能的蛋白 质或小分子多肽。大多数细胞因子的分子量在1530KD之间，多以单体形式存在，也有少量如IL10、TGF-β等以双体形式存在。 细胞因子具有调节和促进细胞生长以及损伤组织 修复等多种功能。
STAT Structure
The Coiled-Coil Domain of Stat3 Is Essential for Its SH2 DomainMediated Receptor Binding and Subsequent Activation
SH2 (Src homology domain 2), a critical site of tyrosine phosphorylation (Y705 in STAT3)
CT-1、OSM和CNTF以及LIF之间在防止ES细胞分 化以及体外培养中维持ES细胞衍生化生长作用时 可以互换，表明这些细胞因子在功能上具有冗余 性。
细胞因子受体
大多数细胞因子受体是由两个或两个以上的亚单位组成的 异源二聚体或多聚体，通常包括一个特异性配体结合α链 和一个参与信号的β链。 α链构成低亲和力受体，β链一般单独不能与细胞因子结 合，但参与高亲和力受体的形成和信号转导。
STAT protein expression remains constant in the presence and absence of LIF
PY phosphotyrosine酪氨酸 PS phosphoserine 丝氨酸 PT phosphothreonine 苏氨酸
The LIF-dependent complex contains a STAT3-related protein and is phosphorylated both on tyrosine and serine residues
影响Gp130与STAT3的激活的机制
Gp130同源或异源二聚作用导致与 其box1，box2相结合的Jak激酶相 互靠近而发生磷酸化。激活的Jak 激酶使gp130胞内域Y126、Y173、 Y265、Y275磷酸化，进而磷酸化 与之结合的STAT3，使其发生二聚 作用并转移到细胞核内，起到自我 复制和维持亚全能性的作用。 这些位点的磷酸化对于STAT3和 ES细胞多能性起着什么样的作用？
IL-6家族成员
1、Interleukin-6 ，IL-6, 细胞因子白介素6
2、白血病抑制因子Leukemia inhibitory factor (LIF)
3、Oncostrain M, OSM 制瘤素 4、Ciliary neurotrophic factor, CNTF睫状神经营养 因子 5、Cardiotrophin-1, CT-1心肌营养素
•
通常将细胞粗提液和32P同位素或非放射性标记的DNA探针
一同保温，在非变性的聚丙烯凝胶电泳上，分离复合物和 非结合的探针。DNA-复合物比非结合的探针移动得慢。标 记的探针依研究的结合蛋白的不同，可是双链或者是单链。
EMSA中DNA结合蛋白特异性确定
1,阴性对照反应(标记探针)；2, 常规反应(含激活的目的转录因 子的核蛋白＋标记探针)；3,探 针冷竞争反应(含激活的目的转 录因子的核蛋白＋标记探针＋ 100倍量的未标记探针)；4,突 变探针的冷竞争反应(含激活的 目的转录因子的核蛋白＋标记 探针＋100倍量的未标记突变探 针)；5,Super-shift反应(含激活 的目的转录因子的核蛋白＋标 记探针＋目的转录因子的特异 抗体)。
二、维持ES细胞全能性的 相关信号通路
常用的ES细胞亚全能性的标志

细胞形态、形成未分化克隆的数目。 碱性磷酸酶的活力 β-gal-OCT4报告基因的活性

OCT4的表达
LIF依赖和不依赖的通路

LIF-gp130-STAT3 维持全能性的通路

LIF-gp130-SHP-2-ERK促进分化的通路 LIF不依赖通路
Structure of gp130
Fibronectin type III module
IL-6/IL-6R引起gp130的二聚作用
sIL-6R与大部分可溶性细胞因子受体不同，一旦与IL-6结 合，形成IL-6/sIL-6R复合物后，可以和膜型IL-6R同样的亲 和力与膜型gp130分子结合，引起信号传导。
LIF-dependent complex is sensitive to Staurosporine and Herbimycin A
Phase contrast micrographs of ES cells treated or not (control) with the different kinase inhibitors
IL-6/IL-6R,IL-11/IL-11R可以引起gp130的同源二聚作用 LIF和CT-1都可以和LIFR结合，引起gp130与LIFR的异源二聚 作用 CNTF与受体CNTFR结合后，可以促进gp130与LIFR的异源二 聚体的形成 OSM通过与gp130结合，促使gp130/LIFR或OSMR/gp130的 异源二聚体的形成
STAT信号的调节主要通过翻译后调节，以酪氨酸和丝氨酸的 磷酸化为主，如STAT1的Y701、S727，STAT3的Y705， S727，STAT5α的Y694等。 STAT的二聚作用是由于SH2结构域和磷酸化的酪氨酸分子间 相互作用形成的，同源或异源二聚体形成后转移至细胞核内， 与特定的DNA序列结合，从而激活基因转录。 为了达到最大的转录活性，需要MAPK家族成员对STAT1或 STAT3结构域的C端的S727进行磷酸化，提示MAPK和JAKSTAT信号通路之间存在交联对话。
SH2 Domain Function • Recruitment to activated receptor complexes. • Interaction with Jaks. • STAT dimerization and DNA binding.
STAT Regulation and Dimerization
白血病抑制因子(LIF)

众所周知，小鼠ES细胞在体外培养时需要靠滋养 层细胞维持其多能性，而滋养层的作用主要是通过 分泌LIF来实现的。

LIF最早由Tomida于1984年研究鼠骨髓样白血病 M1细胞时发现，对鼠骨髓样白血病细胞具有抑制 作用。
细胞因子的特点
细胞外因子的结构与功能相关，可以作用于不同 细胞，参与调节细胞增殖或分化，或同时调节两 者。具有多效性。

LIF-gp130-STAT3 维持全能性的 通路
STAT家族成员
• STAT: 在将细胞膜信号转导到细胞核的过程中发 挥关键作用，因此得名“信号转导与转录活化因 子” (signal transducer and activator of transcription)。 • 哺乳动物有7种STAT蛋白: STAT1-STAT6， STAT5a和STAT5b，除了STAT4仅在髓样细胞和 精巢表达，其余的STAT存在于所有组织中。 • STATs受多种细胞因子、生长因子和干扰素的作 用而激活，作为Janus家族和酪氨酸激酶Src的底 物而发挥作用。
LIF/LIFR 在胚胎发育中表达
LIF mRNA首次出现在小鼠胚胎的桑椹期
LIFR和gp130 mRNA首次出现在囊胚期
LIF
LIFR
细胞因子/受体在胚胎发育中的作用
• LIF-/-的雌性动物无法完成胚胎植入而造成不孕， 但LIF-/-胚胎能够移植并在正常子宫内发育至妊娠 终了。LIF KO小鼠能够正常存在。 • IL-6和CNTF无效突变小鼠的发育表型和正常老鼠 没有明显区别。 • LIFR KO的胚胎在出生后很快死亡，伴随着骨体 积减少和明显的运动神经元缺失。 • Gp130 KO的胚胎在交配后12-18天死于胎盘、心 肌、造血和神经方面的异常。
第六课 胚胎干细胞维持亚全能性的分 子基础
引言

ES细胞能够无限制地进行忠实的自我复制(Self Renewal)。在适当条件下，在自我分裂增殖的过 程中可以同时维持其亚全能性（Pluripotency）。

多能性是ES细胞巨大应用前景的基础，那么ES细 胞维持多能性的分子基础是什么？
内容提要
1.
LIF对STAT3的激活作用小结
• 在ES细胞进行的LIF依赖性转录激活诱导实验显示， STAT3相关DNA结合活力与LIF处理密切相关。 • 细胞经LIF处理后没有改变STAT1、STAT3、 STAT5 和STAT6的表达水平，但免疫共沉淀实验 显示LIF诱导后STAT3变成了酪氨酸磷酸化复合物 的组分之一 。 • 酪氨酸激酶抑制剂显示出对活化STAT3的抑制作用， 并使得未分化的ES细胞形态转变为分化表型。
STAT3 is present in tyrosinephosphorylated complexes only upon LIF treatment
specific tyrosine kinase inhibitors (Genistein and Herbimycin A) or with a more general protein kinase inhibitor (Staurosporine)

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胚胎干细胞分类

胚胎干细胞分类

胚胎干细胞是一类具有多能性（能够分化成多种不同细胞类型）的细胞，它们源自胚胎发育的早期阶段。

胚胎干细胞可以分为两种主要类型：胚胎干细胞（ES细胞）和诱导多能性干细胞（iPS细胞）。

1.胚胎干细胞（ES细胞）：
•来源：ES细胞最初来自早期发育的胚胎。

它们通常从胚胎的内细胞团中获得。

•多能性：ES细胞具有全能性，即它们可以分化成体内所有三个胚层（外胚层、中胚层和内胚层）的各种细胞类型。

•应用：由于其多能性，ES细胞被广泛用于研究和医学应用，包括组织工程、再生医学和疾病治疗。

2.诱导多能性干细胞（iPS细胞）：
•来源：iPS细胞是通过重新编程（诱导）已分化的体细胞，使其重新获得胚胎干细胞的多能性。

•多能性：类似于ES细胞，iPS细胞也具有多能性，可以分化成多种细胞类型。

•应用：iPS细胞的制备避免了使用胚胎，因此在伦理上更为可接受。

它们被广泛应用于疾病建模、药物筛选和个体化医学等领域。

这两种类型的干细胞都具有巨大的潜力，但也伴随着伦理和科研挑战。

胚胎干细胞的使用涉及胚胎的捐赠和使用，可能引发伦理争议。

诱导多能性干细胞的技术在伦理上更可接受，但在研究和应用中仍然需要解决一些问题。

细胞分化 干细胞(细胞生物学)

细胞分化 干细胞(细胞生物学)


正常分化的细胞
转分化 (transdifferentiation)
射线、药物、毒物...
癌细胞
从一种特化细胞类型转变为另一种类型的分化细胞的现象。 培养基中缺乏维生素A 人皮肤基底层细胞 培养基中富含维生素A 粘膜上皮细胞或具有纤毛的上皮细胞 角化细胞
（四）个体发育中细胞分化的潜能性
1、细胞发育潜能在发育过程中逐渐变窄
干细胞
过渡放大细胞
分化细胞 (transit amplifying cell)
缓慢增殖的生理意义 可减少基因发生突变的危险； 有利于干细胞对环境信号作 出反应。
2.干细胞增殖系统的自稳定性
• 自稳定性是指干细胞可以在生物个体生命区间中自我更新并维持其自身数目的恒定 。
四、干细胞的分化特征
• 干细胞的分化潜能（全能－多能－专能） 胚胎干细胞的亚全能分化特性 成体干细胞的多全能分化特性 区别于前体细胞 • 干细胞具有可塑性，在适当条件下干细胞的转 分化和去分化。 干细胞的转分化：一种组织类型的干细胞在适 当条件下分化为另一种组织类型细胞的现象。 如人的骨髓干细胞可以分化为肝脏细胞、肌肉 细胞、神经细胞等。 干细胞的去分化：一种干细胞向其前体细胞的 逆向转化。
2. 什麽是细胞分化？有那些具体特征？ 3. 细胞分化的影响因素有那些？
4. 为什么说在发育过程中细胞的潜能逐渐变窄？
干细胞
• 在个体成熟之后，机体的组织仍然保持着一种特 有的自稳性。即在特定组织中细胞的死亡和细胞 的增生的速度会维持着一个动态平衡。 • 各种组织还保持着程度不同的损伤后再生的能力 ，如两栖类动物、哺乳动物的造血系统，小肠， 毛发及皮肤等。
3. 细胞粘附分子对细胞分化的作用
细胞粘合是由于同类细胞可以通过表面细胞粘附因子，进
什么是胚胎干细胞

什么是胚胎干细胞

什么是胚胎干细胞胚胎干细胞是在人胚胎发育早期——囊胚（受精后约5—7天）中未分化的细胞。

囊胚含有约140个细胞，外表是一层扁平细胞，称滋养层，可发育成胚胎的支持组织如胎盘等。

中心的腔称囊胚腔，腔内一侧的细胞群，称内细胞群，这些未分化的细胞可进一步分裂、分化，发育成个体。

内细胞群在形成内、中、外三个胚层时开始分化。

每个胚层将分别分化形成人体的各种组织和器官。

如外胚层将分化为皮肤、眼睛和神经系统等，中胚层将形成骨骼、血液和肌肉等组织，内胚层将分化为肝、肺和肠等。

由于内细胞群可以发育成完整的个体，因而这些细胞被认为具有全能性。

当内细胞群在培养皿中培养时，我们称之为胚胎干细胞。

研究证实：分离的小鼠胚胎干细胞在体外可以分化成各种细胞，包括神经细胞，造血干细胞（血细胞的前体）和心肌细胞。

令人惊奇的是，这些细胞还具有自发发育成某些原始结构的趋势。

如在一定的培养条件下，一部分胚胎干细胞会分化为胚状体（与小的跳动的心脏具有奇异的相似之处），而另一些细胞会发育成包含造血干细胞的卵黄囊。

形成胚状体和卵黄囊的比例可通过改变培养基而改变，但至今还没有诱导胚胎干细胞发育为一纯的分化细胞群的报道。

从理论上讲，小鼠胚胎干细胞具有发育成某一器官的能力，但还没有用干细胞体外培养成器官的报道。

不过，如果将小鼠胚胎干细胞移植到重度复合免疫缺损小鼠（SCID，它不会排斥移植的细胞）体内时，胚胎干细胞则能够发育成肌肉、软骨、骨骼、牙齿和毛发。

但无论如何，如果直接将分离的小鼠胚胎干细胞植入子宫内，它们不会发育成个体小鼠，因为没有着床必需的滋养层细胞。

这种条件下，胚胎干细胞被认为是多能的（pluripotent），而不是全能的（totipotent）。

尽管如此，如果将胚胎干细胞植入不能发育成个体的四倍体胚胎中，再将该胚胎植入小鼠子宫中，那么可以获得完全是由培养的胚胎干细胞产生的正常个体小鼠。

这表明了胚胎干细胞具有难以置信的全能性。

干细胞的基本知识

干细胞的基本知识


四 干细胞的应用
• • • • • • • 一，干细胞是早期胚胎发育的良好模型 二，干细胞是研究人类疾病的良好模型 三，干细胞具有临床应用的前景。 1，移植治疗 2，基因治疗������ 3，转运载体 4，干细胞库
五 存在的问题
1)干细胞的分离、纯化、增殖、鉴定的问题。 2)干细胞诱导分化的问题。 3）移植时机的把握 4）供体细胞的功能表达问题 5)移植后免疫排斥反应。 6) 干细胞治疗中生物安全，伦理和法律问题
骨髓干细胞
• 一类是造血干细胞（hematopoietic stem cells，HSCs），它为循环血液提供前体细 胞； • 另一类是间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs），它是骨髓中主要的 支持细胞，在调节造血干细胞的长期存活， 生长分化中起重要作用。
二、干细胞的生物学特征
干细胞的可塑性
• 干细胞的可塑性：即干细胞具有在不同微环境 中可转化为不同干细胞及不同类型的成熟组织 细胞的特性。 • 机制：1, 横向分化 • 2，去分化/脱分化 3，干细胞的异质性 4，细胞融合 5，基因重组学说 6，亚全能干细胞学说 影响因素：微环境和基因表达
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胚胎干细胞
成体干细胞
来源
囊胚的内细胞团或胎儿 的生殖脊 易分离，纯化，可无限 增殖，有分化全能性
The Therapeutic Potential of Human Umbilical Mesenchymal Stem Cells from Wharton’s Jelly in the Treatment of Rat Liver Fibrosis
Pei-Chun Tsai,1 Tz-Win Fu,5 Yi-Ming Arthur Chen,2 Tsui-Ling Ko,8 Tien-Hua Chen,3 Yang-Hsin Shih,6,9 Shih-Chieh Hung,4,7* and Yu-Show Fu3,1