过氧化物酶同工酶的提取分离

实验五聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分析小麦幼苗过氧化物酶同工酶生物111班杨明轩1102040128一、研究背景及目的过氧化物酶是以过氧化氢为电子受体催化底物氧化的酶，具有消除过氧化氢和酚类、胺类毒性的双重作用。

它与呼吸作用、光合作用及生长素的氧化等都有关系，在种子萌动以前,它们的过氧化物酶同工酶很少,待幼芽长到0.5 -1 厘米以后,它们的过氧化物酶才得到充分的表达。

这说明植物过氧化物酶同工酶的多寡和有无,与植物不同发育时期,与植物的不同组织、器官的分化形成及特定的生理状态等均有密切关系。

而同工酶是指能催化同一种化学反应，但其酶蛋白本身的分子结构组成却有所不同的一组酶。

大多数基因性同工酶由于对底物亲和力不同和受不同因素的调节，常表现不同的生理功能。

它们存在于生物的同一种属或同一个体的不同发育阶段，或同一发育阶段的不同组织，在细胞发育和代谢调解中起重要作用。

在动、植物中，一种酶的同工酶在各组织、器官中的分布和含量不同，形成各组织特异的同工酶谱，体现各组织的特异功能，这一特点可用于研究物种进化、遗传变异、杂交育种和个体发育、组织分化等。

品种资源工作者借助同工酶分析品种的地理分布与亲缘关系来指导品种资源的收集与鉴定工作。

育种工作者常用同工酶来作为鉴定植物的种间杂交, 特别是远缘杂交的生化指标。

在医学方面，同工酶是研究癌瘤发生的重要手段。

要对同工酶展开研究，首先要实现对它的分离，因此要选择合适的分离技术。

基于“差异转化”的思路，层析和电泳是两种最为常见的大分子分离方法。

但由于二者技术细节上的差异，层析更常用于大分子的分离纯化，而电泳则主要用于大分子的分离检测。

因此在本次实验中，我们采用不连续的聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分析小麦幼苗中的过氧化物酶同工酶。

同时本实验利用电泳现象对过氧化物同工酶进行分离纯化和分析鉴定，通过电泳技术的实际操作体会电泳技术的原理和特点，比较分析电泳技术和其它分离技术如层析技术的不同，进一步学习应用更为广泛和纯化水平更高的分离技术。

过氧化物酶(POD)同工酶聚丙烯酰胺凝胶电泳一、目的1、了解聚丙烯酰胺凝胶电泳原理。

2、了解聚丙烯酰胺凝胶的制作过程。

3、了解过氧化物酶同工酶电泳过程。

二、实验原理：1、聚丙烯酰胺凝胶电泳原理及影响电泳的主要因素带电粒子在电场中向与其自身带相反电荷的电极移动，这种现象称为电泳。

用电泳技术分离、分析蛋白质、酶、核酸等生物大分子，有较高的分辨率，目前已成为生物科学研究中必不可少的手段之一。

带电离子在电场中的泳动速度（1）和迁移率（泳动度）（2）由（2）式可以看出，凡能影响溶液粘度η的因素如温度，影响分子带电量q及解离度a的因素如pH的改变，都会对迁移率产生影响。

因此，电泳应尽可能在恒温条件下进行。

并选用一定pH的缓冲液。

同时，所选用的pH以能扩大各种被分离物质所带电荷量的差异为好，以利于分离各种成分。

迁移率与粒子的大小（r）有关，非球形粒子（如DNA）在电泳过程中会受到更大的阻力，即粒子的移动速度还与粒子形状有关。

另外，迁移率还受电渗现象的影响。

所谓电渗是指在电场中，液体对于固体支持物的相对移动。

例如在纸电泳中，由于滤纸（纤维素）上带有负电荷，因感应相吸而使与滤纸相接触的水溶液带正电荷，从而使液体向负极移动，带动着本来是向负极泳动的物质以更快的速度移动。

因此，电泳时应避免用高电渗物质作支持介质。

聚丙烯酰胺凝胶结构中不带电荷，在电场中电渗现象极为微小。

这些特点，使得聚丙烯酰胺凝胶适合作区带电泳的支持介质。

最后，要考虑选用离子强度适宜的溶液。

一般低离子强度比较合适，因为此时导电性低，产生的热量较少。

同时可使被分离的带电离子对电流贡献最大从而加快电泳速度。

但也不能过低，它必须可以缓冲被分离样品中带电离子对凝胶pH的影响，且过低的离子强度易导致蛋白质凝聚。

一般最适的离子强度在0.01～0.1mol/L之间。

最常见的为0.05。

在稀溶液中，离子强度Ⅰ可用下式计算：Ⅰ＝1/2ΣmiZi2 (3)（3)式中，mi为离子的摩尔浓度，Zi为离子的价数。

果蔬成分生化分析果蔬成分的分析主要分为四个方面：维生素C含量的测定、总糖和还原糖含量的测定、蛋白质含量的测定、过氧化物酶的分析。

总体从实验目的、实验原理、实验试剂、实验结果和分析的角度进行分析一．实验目的：1、掌握微量测定维生素C的方法和技术。

2、了解果蔬中维生素C含量。

3、掌握总糖和还原糖含量的测定方法。

4、掌握蛋白质测定的方法和技术。

5、了解果蔬中蛋白质的含量。

6、了解聚丙烯酰胺凝胶的制作过程及结构特点。

二．实验原理：1.还原型维生素C可被氧化型2，6-二氯酚靛酚（下面简称染料）所氧化，成为氧化型维生素C。

氧化型染料在中性或碱性溶液中呈蓝色，在酸性溶液中呈红色。

成为还原型后为无色。

用氧化型染料来滴定还原型维生素C，当滴至全部还原型维生素C被氧化后，在稍滴一点呈微红色为终点。

滴定用去染料量与样品中还原型维生素C量成正比。

（此法虽简单迅速，但氧化型染料亦能使其他还原型物质氧化，所以有一定缺点。

）2.蒽酮比色法是一个快速而简便的定糖方法。

其原理：糖类在较高温度下可被硫酸脱水成糠醛或糠醛衍生物，再与蒽酮缩合成蓝色化合物，在620nm处有最大吸收。

多糖为非还原糖，可用酸将没有还原性的多糖和寡糖彻底水解成具有还原性的单糖，再利用还原糖的性质进行测定，这样就可分别求出总糖和还原糖的含量。

3. 考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度，是利用蛋白质-染料结合的原理，定量的测定微量蛋白浓度的快速、灵敏的方法。

考马斯亮蓝G-250存在着两种不同的颜色形式，红色和蓝色。

考马斯亮蓝G-250在酸性游离状态下呈棕红色，最大光吸收在465nm，当它与蛋白质结合后变为蓝色，最大光吸收在595nm。

在一定的蛋白质浓度范围内，蛋白质-染料复合物在波长为595nm处的光吸收与蛋白质含量成正比，通过测定595nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。

蛋白质和考马斯亮蓝G-250结合，在2min左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速，其结合物在室温下1小时内保持稳定。

过氧化物酶同工酶电泳分析实验原理（1）凝胶板由上、下两层胶组成，两层凝胶的孔径不同。

上层为大孔径的浓缩胶，下层为小孔径的分离胶。

（2）缓冲液离子组成及各层凝胶的pH不同。

本实验采用碱性系统。

电极缓冲液为pH8.3的Tris-甘氨酸缓冲液，浓缩胶为pH6.7的Tris-HCl缓冲液。

而分离胶为pH8.9的Tris-HCl缓冲液。

（3）在电场中形成不连续的电位梯度。

在这样一个不连续的系统里，存在三种物理效应，即电荷效应、分子筛效应和浓缩效应。

在这三种效应的共同作用下，待测物质被很好地分离开来。

下面以本实验要分离的小麦苗过氧化物酶同工酶为例，分别说明三种效应的作用：（1）电荷效应：各种酶蛋白按其所带电荷的种类及数量，在电场作用下向一定电极，以一定速度泳动。

（2）分子筛效应：分子量小，形状为球形的分子在电泳过程中受到阻力较小，移动较快；反之，分子量大、形状不规则的分子，电泳过程中受到的阻力较大，移动较慢。

这种效应与凝胶过滤过程中的情况不同。

（3）浓缩效应：待分离样品中的各组分在浓缩胶中会被压缩成层，而使原来很稀的样品得到高度浓缩。

其原因如下：①由于两层凝胶孔径不同，酶蛋白向下移动到两层凝胶界面时，阻力突然加大，速度变慢。

使得在该界面处的待分离酶蛋白区带变窄，浓度升高。

②在聚丙烯酰胺凝胶中，虽然浓缩胶和分离胶用的都是Tris-HCl缓冲液，但上层浓缩胶为pH 6.7，下层分离胶为pH 8.9。

HCl是强电解质，不管在哪层胶中，HCl几乎都全部电离，Cl－布满整个胶板。

待分离的酶蛋白样品加在样品槽中，浸在pH8.3和Tris-甘氨酸缓冲液中。

电泳一开始，有效泳动率最大的Cl－迅速跑到最前边，成为快离子（前导离子）。

在pH6.7条件下解离度仅有0.1～1％的甘氨酸（pI = 6.0 ）有效泳动率最低，跑在最后边，成为慢离子（尾随离子）。

这样，快离子和慢离子之间就形成了一个不断移动的界面。

在pH6.7条件下带有负电荷的酶蛋白，其有效泳动率介于快慢离子之间，被夹持分布于界面附近，逐渐形成一个区带。

实验八 聚丙烯酰胺凝胶电泳分离过氧化物同工酶一、实验目的１ 学习聚丙烯酰胺凝胶电泳原理。

２ 掌握聚丙烯酰胺凝胶垂直板（及同盘）电泳的操作技术。

３ 掌握同工酶定义、理化性质的差异，了解过氧化物酶的染色原理。

４ 掌握过氧化物酶的活性的测定。

二 实验原理聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺（Acr ）和交联剂（即共聚体的N,N －甲叉双丙烯酰胺 Bis ）在加速剂（N,N,N ’,N ’－四甲基乙二胺 TEMED ）和催化剂（过硫酸胺 (NH 4)4S 2O 8 简称AP ）的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶。

（一）聚丙烯酰胺凝胶聚合原理及相关特性１ 聚合反应聚丙烯酰胺是由Acr 和Bis 在催化剂（AP ）或核黄素（C 17H 20O 6N 4）和加速剂（TEMDA ）的作用下聚合而成的三维网状结构。

催化剂和加速剂的种类很多，目前常用的有２种催化体系：① AP-TEMED 属化学聚合作用② 核黄素－TEMED 属光聚合作用２ 凝胶孔径的可调性及其相关性质① 凝胶性能与总浓度及交联度的关系凝胶的孔径、机械性能、弹性、透明度、粘度和聚合程度取决于凝胶总浓度和Acr 与Bis 之比： 00100a bT m +=⨯ a:b<10 脆硬乳白交联度： 00100bc a b =⨯+ a:b>100糊状易断② 凝胶浓度与孔径的关系T （Acr 和Bis 总浓度）增加 孔径减小 移动颗粒穿过网孔阻力增加③ 凝胶浓度与被分离物分子量的关系分子量增加 阻力增加 移动速度减慢。

同时还与分子形状及分子电荷有关系。

在操作时，可以选用007.5凝胶。

因为生物体内大多数蛋白质在此范围内电泳均可取得满意的结果。

３ 试剂对凝胶聚合的影响水中金属离子或其他成分对凝胶电泳的电泳速度、分离效果等有影响。

（二）聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE ）原理根据有无浓缩效应可分为：连续系统：电泳体系中由于缓冲液PH 值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场中主要靠电荷及分子筛效应。

实验五 聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分析过氧化物酶同工酶一、目的同工酶是指能催化同一种化学反应， 但其酶蛋白本身的分子结构组成却有所不同的一组 酶。

它们是 DNA 编码的遗传信息表达的结果。

最近的研究表明，同工酶与生物的遗传、生 长发、代谢调节及抗性等都有一定的关系。

因此，测定同工酶在理论上和实践上都有重要的 意义。

用聚丙烯酰胺凝胶电泳测定同工酶，方法简便、灵敏度高，重现性强，测定结果便于 观察、记录和保存。

过氧化物酶是植物体内普遍存在的、活性较高的一种酶。

它与呼吸作用、光合作用及生 长素的氧化等都有关系。

在植物生长发育过程中它的活性不断发生变化。

因此，测定这种酶 的活性或其同工酶的变化情况，可以反映某一时期植物体内代谢的变化。

本实验采用聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳技术，分离小麦幼苗过氧化物酶同工酶，根据酶 的生物化学反映，通过染色方法显示出酶的不同区带，以鉴定小麦幼苗过氧化物酶同工酶。

通过本实验，主要要掌握电泳技术的原理、方法、设计、装置、凝胶配制等问题，熟悉所有 的操作过程，另外，对同工酶有一个感性的认识。

二、原理1．电泳现象带电粒子在电场中向与其自身带相反电荷的电极移动，这种现象称为电泳。

由于带电胶粒或分子中各种成份，所具有的电荷和分子量不同，在电场中将以不同的速 度移动，因而在电泳进行过程中，不同的成份将按照各自的迁移速度得到有效的分离。

2．影响电泳的主要因素若将带净电荷 q 的粒子放入电场，则该粒子所受到的引力 F 引可用数学式表示如下：F 引 =E × q (1)式中 E 为电场强度，单位为“伏特／厘米” ，表示电场中单位距离上的电位差。

如果这种情况发生在真空中，则带电粒子会朝着电极加速前进并且最后与电极相撞。

但 在溶液中，由于电场的牵引力 F 引与加速运动的粒子和溶液之间产生的阻力（即摩擦力）F 阻 相对抗，故上述现象不会发生。

根本 Stokes 公式，阻力的大小取决于粒子的大小和形状以 及所在介质的粘度：F 阻 = 6pghn(2) 式中 F 阻是球形粒子所受的阻力，g 是球形粒子的半径，h 是溶液的粘度，n 是粒子移动的速度。

实验五聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分析⼩麦幼苗过氧化物酶同⼯酶（实验报告）⽣物化学实验报告实验五聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分析⼩麦幼苗过氧化物酶同⼯酶⼀、研究背景及⽬的电泳现象就是带电粒⼦在电场中向与其⾃⾝带相反电荷的电极泳动。

电泳技术最初是由瑞典的著名科学家Tisellius所奠基，⾃此⽣物⼤分⼦的分离纯化便进⼊了电泳技术的新纪元。

电泳技术的发明是⼈们在分离纯化技术中的“差异转换”思路上⼜⼀次伟⼤的飞跃。

⼈们清楚地意识到，要想使⽬标物得到分离，⽬标物与杂质之间的性质差异必须⾜够⼤，这⼜与某些性质差异⼩的物质的分离相⽭盾，⽽⼈为放⼤这些差异⼩的性质必然会破坏⽬标物的原有结构，因此需要借助第三者进⾏差异转化，即以其⾃⾝的性质为基础，转化为其他⽅⾯差异⼤的性质。

电泳技术就是利⽤⼀些⽣物⼤分⼦的电性特点，在⼀定的条件下使被分离物之间很⼩的差异转化为⾃⾝所带电荷性质与数量的差异，在外加电场的作⽤下便会体现出迁移⽅向及速度上的差异，通过时间上的积累进⽽体现为迁移距离的差异。

最初的电泳技术是在溶液中进⾏的⾃由电泳，后来⼈们想到，由于待分离物的⼤⼩、形状也存在差异，那么它们在电场中泳动的过程中必然会受到不同的阻⼒，这种阻⼒的差异⼜转化为了电场中迁移速度的差异，所以⼈们便发明了各种⽤于电泳的载体（⽀持介质），使分⼦的⼤⼩及形状差异得以转化和体现，⼤⼤提⾼了分辨率。

⾄此，电泳技术的基本理论就建⽴了。

此后，在实际操作中，⼈们不断进⾏探索、改进与完善，发明了诸多的电泳新技术，使电泳成为⼀项⽣物⼤分⼦分离纯化中令⼈瞩⽬的研究技术。

本实验基于电泳的基本原理对⼩麦过氧化物酶同⼯酶进⾏分离，旨在学习并掌握电泳技术的发明历程以及操作过程中的相关细节，同时更为深刻地理解⼀项新技术在实际应⽤中不断修正与完善的过程，体会电泳和层析两⼤技术各⾃的特点和优势。

⼆、原理[1]1.过氧化物酶同⼯酶同⼯酶是催化同⼀种化学反应，但其酶蛋⽩本⾝的分⼦结构组成却有所不同的⼀组酶。

植物过氧化物同工酶的聚丙烯酰胺凝胶电泳【目的】1．掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理及操作过程。

2．了解聚丙烯酰胺圆盘电泳的实际应用，利用此法分离植物过氧化物同工酶。

【概述】1．聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳是以聚丙烯酰胺凝胶作为支承物的一种电泳技术。

其凝胶是由丙烯酰胺单体和交联剂甲叉双丙烯酰胺在催化剂的作用下聚合交联而成的三维网状结构。

凝胶网孔的大小可通过改变单体浓度和交联剂浓度的比例加以调节，常用的所谓标准凝胶是指含丙烯酰胺7%～7.5%的凝胶，大多数生物体内的蛋白质在此凝胶中电泳能达到满意的结果。

聚丙烯酰凝胶电泳过程中除了一种电泳所具有的电荷效应外，还具有“分子筛”效应；不连续的凝胶电泳过程中具有电荷效应、分子筛效应和浓缩效应。

不连续凝胶电泳体系的不连续性体现在：（1）凝胶由上、下两层组成，两层胶孔孔径不同。

上层为大孔径的浓缩胶，下层为小孔径的分离胶。

（2）缓冲液离子组成及各层凝胶的pH 值不同。

如常用的碱性系统中，电极缓冲液为pH8.3的Tris-甘氨酸缓冲液，浓缩胶为pH6.7的Tris-HCl 缓冲液，分离胶为pH8.9的Tris-HCl 缓冲液。

（3）在电场中形成不连续的电位梯度。

在这种不连续的系统中有三种物理效应起作用，使样品分离效果好、分辨率高。

这三种效应是电荷效应、分子筛效应和浓缩效应。

① 电荷效应 由于各种蛋白质分子所载有效电荷不同，因而在一定电场作用下迁移率不同。

承载有并效电荷多的，泳动的快，反之则慢。

CH 2CH C=O NH 3CH 2=CH C=O NH CH 2NH C=O CH 2+CH 2CH C=O NH 3CH 2CH C=O NH 3C=O NH CH 2NH C=O CH 2CH 2CH [[]]nn 催化剂② 分子筛效应 因为聚丙烯酰胺具有网孔结构，所以直径大，形状不规则的分子，电泳时通过凝胶受到的阻力大，移动较慢；分子量小，形状为球形的分子在电泳过程中受到的阻力小移动较快。

菜心的花和叶的过氧化物酶的提取、活性测定及同工酶的凝胶电泳分析广州大学生命科学学院洪韬文生物工程1121114200044摘要：本实验分两部分，1：过氧化物酶的提取，:用考马斯亮蓝试剂进行酶液蛋白质浓度的测定，根据标准曲线的方程式，计算出样品的蛋白质含量；2：:通过过氧化物酶活性的测定（愈创木酚氧化比色法），测出的OD值计算出酶活性数值，接着对同工酶的凝胶电泳分析，使它在胶柱上呈现同工酶谱，得出最终实验结果，通过数据记录和拍照记录最终结果。

关键字：过氧化物酶蛋白质OD值同工酶凝胶电泳前言：本实验是在完成基础生物化学实验以后，学生综合运用已经学过的生物化学实验理论和已经掌握的生物化学实验技术进行的一项综合性设计性实验，也是对学生实验动手能力的一次较全面的检验。

POD是一种由单一肽链与卟啉构成的血红素蛋白，脱辅基蛋白分子需与血红素结合才构成全酶。

参与植物POD血红素的合成部位可能象动物一样是在线粒体上。

POD 是一种氧化还原酶，它是由微生物或植物所产生的一类氧化还原酶，POD广泛存在于植物体内，是一种活性较高的一种酶，它与植物的呼吸，光合作用以及生长起着很大的作用。

材料和方法：材料：菜叶，菜花方法：1.植物POD的提取分别称取菜心的花和叶各1~2克，然后剪碎，分别放入研钵，向研钵中加入少许石英砂和3ml KH2PO4，快速研磨，后分别加入离心管中进行离心，离心条件为8500rpm，时间为15分钟。

离心完毕后取上清液，并定容至10ml（刻度试管），***此液即为POD提取液，取5ml冷冻保存，作为电泳的POD样品。

2.蛋白浓度的测定—考马斯亮蓝法标准曲线的制定制作标准曲线回归方程：Y(含量)=aX(OD595值) + b，得出相关系数R2。

3.样品蛋白浓度的测定根据标准曲线的方程式，计算出样品的蛋白质含量。

4.过氧化物酶活性的测定（愈创木酚氧化比色法）备好酶液，将分光光度计调到470nm，取光径1厘米的比色杯2只，向对照杯加反应混合液2.0 ml，KH2PO4 0.5ml，校零点。