植物过氧化物酶同工酶测

华南农业大学实验报告专业班次 11农学一班组别201130010110题目植物过氧化物酶同工酶组丙烯酰胺凝胶圆盆电泳姓名梁志雄日期【实验原理】过氧化物酶是植物体内常见的氧化酶，植物体内许多的生理代谢涡阳与过氧化物酶及其同工酶的种类有关，本实验用加有蔗糖的缓冲溶液作为缓冲剂，提取甘蔗叶片中的过氧化物酶同工酶，锁甲的蔗糖是为了增加样品液的相对密度，使点样时能让样品平铺于凝胶表面，有防止其扩散的作用，利用过氧化物酶能催化过氧化氢把联苯胺氧化为蓝色或棕色产物的原理，将经过电泳后的凝胶置于有过氧化氢及联苯胺的溶液中染色，有色部位即为过氧化物酶在凝胶中存在的位置，从而得到过氧化物酶同工酶酶。

【实验仪器和用品】1、实验仪器圆盆电泳槽、直流稳压电泳仪、离心机、恒温水浴锅、脱色摇床、研钵、电子天平2、实验用品烧杯、吸管、试管、试管架、玻璃棒、滴管、微量注射器、长针头注射器、培养皿、洗耳球、蒸馏水瓶、移液枪、大漏斗、滤纸、试剂瓶、烧杯、量筒、离心管、标签纸、PH试纸。

【实验材料和实验试剂】1、实验材料甘蔗叶片2、实验试剂样品提取缓冲液、0.5%（m/V）溴酚蓝、凝胶储备液A、凝胶储备液B、凝胶储备液C、电极缓冲液、POD 同工酶染色储存液。

【实验步骤】1 .凝胶柱的制备将凝胶贮备液 A 、 B 及水按 1 ： 2 ： 1 的比例混合于烧杯中，另量取 4 份的 C 液于另一烧杯中、即A液3ml、B液6ml、C液12ml，。

当准备好带有玻珠乳胶管封底的玻璃管后，可把两烧杯中的溶液混合，轻搅均匀，用长滴管沿玻管壁小心加到玻管中。

胶液应灌到离管口约 3mm 处。

用手指轻弹管壁，将管中胶液可能混有的气泡赶出，然后用滴管在胶液面上小心注入一层 3mm 蒸馏水，以防胶凝结时表面形成弯月面并隔绝空气。

当见到水层与胶液交界处有一清晰界面时，表明胶已聚合。

2 .样品的制备称取 0.5g 甘蔗叶片，加入 2 ~5毫升提取缓冲液，于研钵中研磨成浆状。

过氧化物酶同工酶电泳分析实验原理（1）凝胶板由上、下两层胶组成，两层凝胶的孔径不同。

上层为大孔径的浓缩胶，下层为小孔径的分离胶。

（2）缓冲液离子组成及各层凝胶的pH不同。

本实验采用碱性系统。

电极缓冲液为pH8.3的Tris-甘氨酸缓冲液，浓缩胶为pH6.7的Tris-HCl缓冲液。

而分离胶为pH8.9的Tris-HCl缓冲液。

（3）在电场中形成不连续的电位梯度。

在这样一个不连续的系统里，存在三种物理效应，即电荷效应、分子筛效应和浓缩效应。

在这三种效应的共同作用下，待测物质被很好地分离开来。

下面以本实验要分离的小麦苗过氧化物酶同工酶为例，分别说明三种效应的作用：（1）电荷效应：各种酶蛋白按其所带电荷的种类及数量，在电场作用下向一定电极，以一定速度泳动。

（2）分子筛效应：分子量小，形状为球形的分子在电泳过程中受到阻力较小，移动较快；反之，分子量大、形状不规则的分子，电泳过程中受到的阻力较大，移动较慢。

这种效应与凝胶过滤过程中的情况不同。

（3）浓缩效应：待分离样品中的各组分在浓缩胶中会被压缩成层，而使原来很稀的样品得到高度浓缩。

其原因如下：①由于两层凝胶孔径不同，酶蛋白向下移动到两层凝胶界面时，阻力突然加大，速度变慢。

使得在该界面处的待分离酶蛋白区带变窄，浓度升高。

②在聚丙烯酰胺凝胶中，虽然浓缩胶和分离胶用的都是Tris-HCl缓冲液，但上层浓缩胶为pH 6.7，下层分离胶为pH 8.9。

HCl是强电解质，不管在哪层胶中，HCl几乎都全部电离，Cl－布满整个胶板。

待分离的酶蛋白样品加在样品槽中，浸在pH8.3和Tris-甘氨酸缓冲液中。

电泳一开始，有效泳动率最大的Cl－迅速跑到最前边，成为快离子（前导离子）。

在pH6.7条件下解离度仅有0.1～1％的甘氨酸（pI = 6.0 ）有效泳动率最低，跑在最后边，成为慢离子（尾随离子）。

这样，快离子和慢离子之间就形成了一个不断移动的界面。

在pH6.7条件下带有负电荷的酶蛋白，其有效泳动率介于快慢离子之间，被夹持分布于界面附近，逐渐形成一个区带。

实验二过氧化物酶同工酶的提取、分离苟亚峰摘要：本实验采用聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳技术，分离小麦幼苗过氧化物酶同工酶，通过染色方法显示出酶的不同区带，以鉴定玉米幼苗过氧化物酶同工酶，实验结果显示玉米幼苗中至少含有5种过氧化物同工酶。

关键词：过氧化物同工酶；PAGE；电泳分离引言同工酶是指催化同一种化学反应，但酶的分子结构组成却有所不同的一组酶。

同工酶与生物的遗传，生长发育，代谢调节及抗性等都有一定的关系，如过氧化物酶在细胞代谢过程中与呼吸作用，光合作用，及生长素的氧化等都有关系，测定POD活性或其同工酶，可以反映某一时期植物体内代谢变化。

电泳(electrophoresis，简称EP ) 指带电粒子在电场中向与其自身所带电荷相反的电极方向移动的现象。

1937年瑞典科学家Tiselius 成功地将血清蛋白质分成清蛋白、α1、α2、β和γ球蛋白5个主要成分，由于他的突出贡献，1948年荣获诺贝尔奖。

50年代，先后出现了以滤纸、醋酸纤维素薄膜、淀粉及琼脂作为支持物的电泳技术。

60年代，出现了聚丙烯酰胺凝胶电泳技术，在此基础上发展了SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚焦电泳、双向电泳和印迹转移电泳等技术。

这些技术具有设备简单，操作方便，分辨率高等优点。

聚丙烯酰胺凝胶电泳是以聚丙烯胺凝胶作为载体的一种区带电泳。

这种凝胶是由丙烯酰胺单体（Acr）和交联剂N，N’-甲叉双丙烯酰胺（Bis）在催化剂作用下聚合而成的，Acr和Bis在具有自由基团体系时，就会聚合。

引发产生自由基的方法有两种：（1）化学法：引发剂是过硫酸铵(AP)，催化剂N、N、N’、N’-四甲基乙二胺（TEMED），它的碱基催化AP产生自由硫酸基，其氧原子激活丙烯酰胺单体形成单体长链。

化学聚合形成的凝胶孔径较小，且重复性好，用来制备分离胶；（2）光聚合法：光聚合法的催化剂是核黄素（VB2），光聚合形成的凝胶孔径较大，且不稳定，适于制备大孔径的浓缩胶。

实验五 聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分析过氧化物酶同工酶一、目的同工酶是指能催化同一种化学反应， 但其酶蛋白本身的分子结构组成却有所不同的一组 酶。

它们是 DNA 编码的遗传信息表达的结果。

最近的研究表明，同工酶与生物的遗传、生 长发、代谢调节及抗性等都有一定的关系。

因此，测定同工酶在理论上和实践上都有重要的 意义。

用聚丙烯酰胺凝胶电泳测定同工酶，方法简便、灵敏度高，重现性强，测定结果便于 观察、记录和保存。

过氧化物酶是植物体内普遍存在的、活性较高的一种酶。

它与呼吸作用、光合作用及生 长素的氧化等都有关系。

在植物生长发育过程中它的活性不断发生变化。

因此，测定这种酶 的活性或其同工酶的变化情况，可以反映某一时期植物体内代谢的变化。

本实验采用聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳技术，分离小麦幼苗过氧化物酶同工酶，根据酶 的生物化学反映，通过染色方法显示出酶的不同区带，以鉴定小麦幼苗过氧化物酶同工酶。

通过本实验，主要要掌握电泳技术的原理、方法、设计、装置、凝胶配制等问题，熟悉所有 的操作过程，另外，对同工酶有一个感性的认识。

二、原理1．电泳现象带电粒子在电场中向与其自身带相反电荷的电极移动，这种现象称为电泳。

由于带电胶粒或分子中各种成份，所具有的电荷和分子量不同，在电场中将以不同的速 度移动，因而在电泳进行过程中，不同的成份将按照各自的迁移速度得到有效的分离。

2．影响电泳的主要因素若将带净电荷 q 的粒子放入电场，则该粒子所受到的引力 F 引可用数学式表示如下：F 引 =E × q (1)式中 E 为电场强度，单位为“伏特／厘米” ，表示电场中单位距离上的电位差。

如果这种情况发生在真空中，则带电粒子会朝着电极加速前进并且最后与电极相撞。

但 在溶液中，由于电场的牵引力 F 引与加速运动的粒子和溶液之间产生的阻力（即摩擦力）F 阻 相对抗，故上述现象不会发生。

根本 Stokes 公式，阻力的大小取决于粒子的大小和形状以 及所在介质的粘度：F 阻 = 6pghn(2) 式中 F 阻是球形粒子所受的阻力，g 是球形粒子的半径，h 是溶液的粘度，n 是粒子移动的速度。

实验五聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分析⼩麦幼苗过氧化物酶同⼯酶（实验报告）⽣物化学实验报告实验五聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分析⼩麦幼苗过氧化物酶同⼯酶⼀、研究背景及⽬的电泳现象就是带电粒⼦在电场中向与其⾃⾝带相反电荷的电极泳动。

电泳技术最初是由瑞典的著名科学家Tisellius所奠基，⾃此⽣物⼤分⼦的分离纯化便进⼊了电泳技术的新纪元。

电泳技术的发明是⼈们在分离纯化技术中的“差异转换”思路上⼜⼀次伟⼤的飞跃。

⼈们清楚地意识到，要想使⽬标物得到分离，⽬标物与杂质之间的性质差异必须⾜够⼤，这⼜与某些性质差异⼩的物质的分离相⽭盾，⽽⼈为放⼤这些差异⼩的性质必然会破坏⽬标物的原有结构，因此需要借助第三者进⾏差异转化，即以其⾃⾝的性质为基础，转化为其他⽅⾯差异⼤的性质。

电泳技术就是利⽤⼀些⽣物⼤分⼦的电性特点，在⼀定的条件下使被分离物之间很⼩的差异转化为⾃⾝所带电荷性质与数量的差异，在外加电场的作⽤下便会体现出迁移⽅向及速度上的差异，通过时间上的积累进⽽体现为迁移距离的差异。

最初的电泳技术是在溶液中进⾏的⾃由电泳，后来⼈们想到，由于待分离物的⼤⼩、形状也存在差异，那么它们在电场中泳动的过程中必然会受到不同的阻⼒，这种阻⼒的差异⼜转化为了电场中迁移速度的差异，所以⼈们便发明了各种⽤于电泳的载体（⽀持介质），使分⼦的⼤⼩及形状差异得以转化和体现，⼤⼤提⾼了分辨率。

⾄此，电泳技术的基本理论就建⽴了。

此后，在实际操作中，⼈们不断进⾏探索、改进与完善，发明了诸多的电泳新技术，使电泳成为⼀项⽣物⼤分⼦分离纯化中令⼈瞩⽬的研究技术。

本实验基于电泳的基本原理对⼩麦过氧化物酶同⼯酶进⾏分离，旨在学习并掌握电泳技术的发明历程以及操作过程中的相关细节，同时更为深刻地理解⼀项新技术在实际应⽤中不断修正与完善的过程，体会电泳和层析两⼤技术各⾃的特点和优势。

⼆、原理[1]1.过氧化物酶同⼯酶同⼯酶是催化同⼀种化学反应，但其酶蛋⽩本⾝的分⼦结构组成却有所不同的⼀组酶。