过氧化物酶同工酶提取、分离

实验五聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分析小麦幼苗过氧化物酶同工酶生物111班杨明轩1102040128一、研究背景及目的过氧化物酶是以过氧化氢为电子受体催化底物氧化的酶，具有消除过氧化氢和酚类、胺类毒性的双重作用。

它与呼吸作用、光合作用及生长素的氧化等都有关系，在种子萌动以前,它们的过氧化物酶同工酶很少,待幼芽长到0.5 -1 厘米以后,它们的过氧化物酶才得到充分的表达。

这说明植物过氧化物酶同工酶的多寡和有无,与植物不同发育时期,与植物的不同组织、器官的分化形成及特定的生理状态等均有密切关系。

而同工酶是指能催化同一种化学反应，但其酶蛋白本身的分子结构组成却有所不同的一组酶。

大多数基因性同工酶由于对底物亲和力不同和受不同因素的调节，常表现不同的生理功能。

它们存在于生物的同一种属或同一个体的不同发育阶段，或同一发育阶段的不同组织，在细胞发育和代谢调解中起重要作用。

在动、植物中，一种酶的同工酶在各组织、器官中的分布和含量不同，形成各组织特异的同工酶谱，体现各组织的特异功能，这一特点可用于研究物种进化、遗传变异、杂交育种和个体发育、组织分化等。

品种资源工作者借助同工酶分析品种的地理分布与亲缘关系来指导品种资源的收集与鉴定工作。

育种工作者常用同工酶来作为鉴定植物的种间杂交, 特别是远缘杂交的生化指标。

在医学方面，同工酶是研究癌瘤发生的重要手段。

要对同工酶展开研究，首先要实现对它的分离，因此要选择合适的分离技术。

基于“差异转化”的思路，层析和电泳是两种最为常见的大分子分离方法。

但由于二者技术细节上的差异，层析更常用于大分子的分离纯化，而电泳则主要用于大分子的分离检测。

因此在本次实验中，我们采用不连续的聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分析小麦幼苗中的过氧化物酶同工酶。

同时本实验利用电泳现象对过氧化物同工酶进行分离纯化和分析鉴定，通过电泳技术的实际操作体会电泳技术的原理和特点，比较分析电泳技术和其它分离技术如层析技术的不同，进一步学习应用更为广泛和纯化水平更高的分离技术。

· 62 ·过氧化物酶(peroxidase，POD，EC1.11.1.7)收稿日期：2012-03-30 *通讯作者基金项目：国家自然科学基金项目(31071625)。

作者简介：丁薪源(1989—)，女，吉林德惠人，硕士研究生，研究方向为食品质量与安全。

是广泛存在于各种动物、植物和微生物体内的一丁薪源，曹建康*(中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京 100083)摘要：综述了过氧化物酶在植物抗性方面的作用及研究意义，并对抗性相关酶POD 的分离纯化、同工酶谱、酶结构及分布等酶学特性进行了综述。

分析得到，果蔬中过氧化物酶的最适pH 范围大部分集中在5.0~7.0之间，最适温度集中在30~60 ℃，对于大部分果蔬的过氧化物酶，Fe 2+、Fe 3+、Ca 2+、Mg 2+等金属离子有不同程度的激活作用，表面活性剂PEG 、SDS 和DETA 的激活作用不明显，甲醇、乙醇、丙酮、抗坏血酸、柠檬酸、L-半胱氨酸也有不同程度的抑制作用。

研究表明，大多数植物的过氧化物酶分子量在30~60 ku 范围内，不同品种、不同发育期、不同器官之间的同工酶种类有所差异。

同时，对过氧化物酶的发展前景进行了展望。

关键词：植物抗性；过氧化物酶；酶学特性；同工酶；果蔬中图分类号：TS 201.2+5 文献标志码：A 文章编号：1005-9989(2012)10-0062-05Characteristics of peroxidase from fruit and vegetable researchprogressDING Xin-yuan, CAO Jian-kang *(College of Food Science & Nutritional Engineering, Chinese Agricultural University,Beijing 100083)Abstract: This paper described the peroxidase’s role in plant resistance and research significance, and summarized the characteristic of peroxidase, such as purification, isozymes, structure and distribution of POD. The result showed that, the optimum pH of the peroxidase in many fruits and vegetables concentrated in 5.0~7.0, the optimum temperature concentrated in 30~60 ℃. For many fruits and vegetables, peroxidase activities were stimulated in different degrees by some metal ions like Fe 2+, Fe 3+, Ca 2+, Mg 2+, and almost weren’t stimulated by surfactant like PEG, SDS, DETA. Methanol, ethanol, acetone, ascorbic acid, citric acid, L-cysteine have different degrees of inhibition to the peroxidase. Molecular weights of most of the PODs vary from 30 ku to 60 ku, and isoenzyme types are different between the different varieties, different developmental stages and different organs. This paper gave an overview of peroxidase development prospects.Key words : plant resistance; peroxidase; enzymatic characteristics; isozymes; fruits and vegetables果蔬过氧化物酶酶学特性研究进展· 63 ·2012年 第37卷 第10期类氧化酶，可催化由过氧化氢参与的各种氧化反应，如催化酚类和胺类化合物的氧化反应。

过氧化物酶同工酶电泳分析实验原理（1）凝胶板由上、下两层胶组成，两层凝胶的孔径不同。

上层为大孔径的浓缩胶，下层为小孔径的分离胶。

（2）缓冲液离子组成及各层凝胶的pH不同。

本实验采用碱性系统。

电极缓冲液为pH8.3的Tris-甘氨酸缓冲液，浓缩胶为pH6.7的Tris-HCl缓冲液。

而分离胶为pH8.9的Tris-HCl缓冲液。

（3）在电场中形成不连续的电位梯度。

在这样一个不连续的系统里，存在三种物理效应，即电荷效应、分子筛效应和浓缩效应。

在这三种效应的共同作用下，待测物质被很好地分离开来。

下面以本实验要分离的小麦苗过氧化物酶同工酶为例，分别说明三种效应的作用：（1）电荷效应：各种酶蛋白按其所带电荷的种类及数量，在电场作用下向一定电极，以一定速度泳动。

（2）分子筛效应：分子量小，形状为球形的分子在电泳过程中受到阻力较小，移动较快；反之，分子量大、形状不规则的分子，电泳过程中受到的阻力较大，移动较慢。

这种效应与凝胶过滤过程中的情况不同。

（3）浓缩效应：待分离样品中的各组分在浓缩胶中会被压缩成层，而使原来很稀的样品得到高度浓缩。

其原因如下：①由于两层凝胶孔径不同，酶蛋白向下移动到两层凝胶界面时，阻力突然加大，速度变慢。

使得在该界面处的待分离酶蛋白区带变窄，浓度升高。

②在聚丙烯酰胺凝胶中，虽然浓缩胶和分离胶用的都是Tris-HCl缓冲液，但上层浓缩胶为pH 6.7，下层分离胶为pH 8.9。

HCl是强电解质，不管在哪层胶中，HCl几乎都全部电离，Cl－布满整个胶板。

待分离的酶蛋白样品加在样品槽中，浸在pH8.3和Tris-甘氨酸缓冲液中。

电泳一开始，有效泳动率最大的Cl－迅速跑到最前边，成为快离子（前导离子）。

在pH6.7条件下解离度仅有0.1～1％的甘氨酸（pI = 6.0 ）有效泳动率最低，跑在最后边，成为慢离子（尾随离子）。

这样，快离子和慢离子之间就形成了一个不断移动的界面。

在pH6.7条件下带有负电荷的酶蛋白，其有效泳动率介于快慢离子之间，被夹持分布于界面附近，逐渐形成一个区带。

实验八 聚丙烯酰胺凝胶电泳分离过氧化物同工酶一、实验目的１ 学习聚丙烯酰胺凝胶电泳原理。

２ 掌握聚丙烯酰胺凝胶垂直板（及同盘）电泳的操作技术。

３ 掌握同工酶定义、理化性质的差异，了解过氧化物酶的染色原理。

４ 掌握过氧化物酶的活性的测定。

二 实验原理聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺（Acr ）和交联剂（即共聚体的N,N －甲叉双丙烯酰胺 Bis ）在加速剂（N,N,N ’,N ’－四甲基乙二胺 TEMED ）和催化剂（过硫酸胺 (NH 4)4S 2O 8 简称AP ）的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶。

（一）聚丙烯酰胺凝胶聚合原理及相关特性１ 聚合反应聚丙烯酰胺是由Acr 和Bis 在催化剂（AP ）或核黄素（C 17H 20O 6N 4）和加速剂（TEMDA ）的作用下聚合而成的三维网状结构。

催化剂和加速剂的种类很多，目前常用的有２种催化体系：① AP-TEMED 属化学聚合作用② 核黄素－TEMED 属光聚合作用２ 凝胶孔径的可调性及其相关性质① 凝胶性能与总浓度及交联度的关系凝胶的孔径、机械性能、弹性、透明度、粘度和聚合程度取决于凝胶总浓度和Acr 与Bis 之比： 00100a bT m +=⨯ a:b<10 脆硬乳白交联度： 00100bc a b =⨯+ a:b>100糊状易断② 凝胶浓度与孔径的关系T （Acr 和Bis 总浓度）增加 孔径减小 移动颗粒穿过网孔阻力增加③ 凝胶浓度与被分离物分子量的关系分子量增加 阻力增加 移动速度减慢。

同时还与分子形状及分子电荷有关系。

在操作时，可以选用007.5凝胶。

因为生物体内大多数蛋白质在此范围内电泳均可取得满意的结果。

３ 试剂对凝胶聚合的影响水中金属离子或其他成分对凝胶电泳的电泳速度、分离效果等有影响。

（二）聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE ）原理根据有无浓缩效应可分为：连续系统：电泳体系中由于缓冲液PH 值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场中主要靠电荷及分子筛效应。

实验二过氧化物酶同工酶的提取、分离苟亚峰摘要：本实验采用聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳技术，分离小麦幼苗过氧化物酶同工酶，通过染色方法显示出酶的不同区带，以鉴定玉米幼苗过氧化物酶同工酶，实验结果显示玉米幼苗中至少含有5种过氧化物同工酶。

关键词：过氧化物同工酶；PAGE；电泳分离引言同工酶是指催化同一种化学反应，但酶的分子结构组成却有所不同的一组酶。

同工酶与生物的遗传，生长发育，代谢调节及抗性等都有一定的关系，如过氧化物酶在细胞代谢过程中与呼吸作用，光合作用，及生长素的氧化等都有关系，测定POD活性或其同工酶，可以反映某一时期植物体内代谢变化。

电泳(electrophoresis，简称EP ) 指带电粒子在电场中向与其自身所带电荷相反的电极方向移动的现象。

1937年瑞典科学家Tiselius 成功地将血清蛋白质分成清蛋白、α1、α2、β和γ球蛋白5个主要成分，由于他的突出贡献，1948年荣获诺贝尔奖。

50年代，先后出现了以滤纸、醋酸纤维素薄膜、淀粉及琼脂作为支持物的电泳技术。

60年代，出现了聚丙烯酰胺凝胶电泳技术，在此基础上发展了SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚焦电泳、双向电泳和印迹转移电泳等技术。

这些技术具有设备简单，操作方便，分辨率高等优点。

聚丙烯酰胺凝胶电泳是以聚丙烯胺凝胶作为载体的一种区带电泳。

这种凝胶是由丙烯酰胺单体（Acr）和交联剂N，N’-甲叉双丙烯酰胺（Bis）在催化剂作用下聚合而成的，Acr和Bis在具有自由基团体系时，就会聚合。

引发产生自由基的方法有两种：（1）化学法：引发剂是过硫酸铵(AP)，催化剂N、N、N’、N’-四甲基乙二胺（TEMED），它的碱基催化AP产生自由硫酸基，其氧原子激活丙烯酰胺单体形成单体长链。

化学聚合形成的凝胶孔径较小，且重复性好，用来制备分离胶；（2）光聚合法：光聚合法的催化剂是核黄素（VB2），光聚合形成的凝胶孔径较大，且不稳定，适于制备大孔径的浓缩胶。

期考复习提要名词解释：蛋白质四级结构Protein tertiary structure：蛋白质的变性作用protein denaturation分子病molecular disease核酸杂交The molecule hybridizationDNA双螺旋结构DNA double helex同工酶Isoenzymes糖酵解Glycolysis：糖异生glyconeogenesis酮体Ketone bodies：氧化磷酸化oxidative phosphorylation生酮氨基酸ketogenesis amino acid转氨基作用transamination盐析作用salfate precipitation必需氨基酸Essential amino acids：遗传密码genetic code转录Transcription：简答题：1.为什么DNA不易被水解？而RNA容易被碱水解？2.何为解链温度?影响某种核酸分子Tm值大小的因素是什么?为什么?3.何为必需脂肪酸？哺乳动物体内所需的必需脂肪酸都有哪些？4.激烈运动后人们感到肌肉酸痛，几天后酸痛感会消失，利用生化机制解释该现象5.给哺乳动物喂食15N 标记的丙氨酸，能否在动物体内找到15N标记的苏氨酸、赖氨酸、和天冬氨酸？6.假如给因氨中毒导致肝昏迷的病人注射鸟氨酸、谷氨酸和维生素，请解释注射它们的用意何在？7.以磺胺药为例，说明竞争性抑制的特点是什么?8.设纯化制备了一种酶，如何鉴定它是蛋白质?9.从以下几方面比较糖酵解与有氧氧化：(1)代谢部位(2)反应条件(3)ATP生成方式(4)产生ATP的数量(5)终产物(6)主要生理意义10.糖代谢与脂代谢是通过哪些反应联系起来的?11.乙酰CoA是由哪些物质代谢产生的?它有哪些代谢去路?12.若有一球状蛋白质，分子中有一段肽链为：…Ala-Gln-Pro-Trp-Phe-Glu-Tyr-Met…在生理条件下，哪些氨基酸可能定位在分子内部？13.导致蛋白质变性的主要因素有哪些？如何在蛋白质分离纯化中减少其变性机会？14.什么是三羧酸循环？它有些什么生物学意义15. 在DNA复制中为什么使用的是需要被切除的RNA引物？16.类固醇激素的代谢调节机制是如何进行的？在调节过程中，第一信使和第二信使为何种物质？。