下载文档原格式
一、实验目的1. 了解过氧化物酶在植物生理过程中的作用。
2. 掌握愈创木酚法测定过氧化物酶活性的原理和方法。
3. 通过实验，提高学生运用实验方法分析植物生理问题的能力。
二、实验原理过氧化物酶（POD）是一种广泛存在于植物体内的酶，催化H2O2分解产生O2和H2O。
愈创木酚法是一种测定POD活性的常用方法，其原理是POD催化H2O2将愈创木酚氧化成茶褐色产物，该产物在470 nm处有最大光吸收值。
通过测定该波长下的吸光度变化，可以计算出POD的活性。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：马铃薯块茎2. 仪器：分光光度计、离心机、研钵、容量瓶、量筒、试管、吸管3. 试剂：100 mmol/L的磷酸缓冲液（pH 6.0）、愈创木酚溶液、30% H2O2、20 mmol/L KH2PO4四、实验步骤1. 制备酶提取液：取马铃薯块茎约0.5 g，加入5 mL磷酸缓冲液（pH 6.0），研磨均匀，过滤，收集滤液，4℃下保存备用。
2. 测定酶活性：a. 设置酶活性测定体系：取2 mL酶提取液，加入1 mL 30% H2O2和1 mL愈创木酚溶液，混匀，立即放入分光光度计中，于470 nm处测定吸光度。
b. 设置对照体系：取2 mL酶提取液，加入1 mL磷酸缓冲液（pH 6.0）和1 mL愈创木酚溶液，混匀，立即放入分光光度计中，于470 nm处测定吸光度。
3. 计算酶活性：a. 酶活性 = [(A1 - A2) / (t2 - t1)] × 0.01 × (1.977 - 0.874) / 10 × 0.01 × 250.027575b. 其中，A1为酶活性测定体系的吸光度，A2为对照体系的吸光度，t1为酶活性测定体系测定时间，t2为对照体系测定时间。
五、实验结果与分析1. 实验结果：通过实验，得到马铃薯块茎中POD的活性为0.027575 U/g。
2. 结果分析：a. 从实验结果可以看出，马铃薯块茎中含有一定量的POD，且活性较高。
贮藏温度对白菜叶片SOD、POD活性及MDA含量的影响张杰;孙叶烁;薛一花;陈霖;张鲁刚;方智远【摘要】[目的]研究白菜叶片在不同贮藏温度下超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)活性及丙二醛(MDA)含量的变化特点.[方法]以白菜品种紫衣、百慕田和947-5s为供试材料,将白菜叶片在不同温度下贮藏不同时间(4℃下贮藏0,3,5,8和10 d;-40,-80℃下贮藏0,12,24,48和72 d),测定SOD、POD活性及MDA含量.[结果]不同品种叶片的SOD活性明显不同.4℃贮藏条件下,紫衣、百慕田和947-5s SOD活性表现相同的变化趋势,即冷藏0～5 d和8～10 d活性变化不大,冷藏5～8 d SOD活性明显增大,8d时SOD活性较5d时分别提高了62.28％,74.83％和61.96％;-40,-80℃两种冻藏温度下,SOD活性均表现为升高-降低-上升的变化趋势.不同品种叶片的POD活性明显不同.4℃贮藏条件下,紫衣、百慕田和947-5s POD活性都表现先下降再上升趋势,在冷藏第3天降到最低值,较0d分别下降了42.64％,18.16％和11.4％,3～10 d POD活性逐渐上升,10d时的POD活性分别为0d的1.10,1.49和2.14倍;在两种冻藏温度下3个品种POD活性都呈现下降-上升-下降趋势,且品种间POD活性变化较大.3个白菜品种鲜叶片的MDA含量明显不同.4℃贮藏条件下,947-5s和百慕田MDA含量呈逐渐升高趋势,紫衣则为逐渐降低趋势.在-40,-80℃条件下,紫衣MDA含量都呈现下降-上升-下降-上升的波浪式趋势;-40℃条件下947-5s和百慕田MDA含量呈现上升-下降-上升相同趋势;-80℃条件下947-5s MDA含量呈现升高-降低-上升-降低趋势,而百慕田MDA含量无明显变化.[结论]3个白菜品种鲜叶片SOD、POD活性和MDA含量各不相同.3个白菜品种叶片只有SOD的活性在4℃冷藏0～5 d时有平稳期,而POD活性及MDA含量在冷、冻藏条件下都会随着时间延长而变化.【期刊名称】《西北农林科技大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2019(047)010【总页数】7页(P113-119)【关键词】白菜贮藏;超氧化物歧化酶;过氧化物酶;丙二醛【作者】张杰;孙叶烁;薛一花;陈霖;张鲁刚;方智远【作者单位】西北农林科技大学园艺学院,陕西杨凌712100;西北农林科技大学园艺学院,陕西杨凌712100;西北农林科技大学园艺学院,陕西杨凌712100;西北农林科技大学园艺学院,陕西杨凌712100;西北农林科技大学园艺学院,陕西杨凌712100;西北农林科技大学园艺学院,陕西杨凌712100;中国农业科学院蔬菜花卉研究所,北京100000【正文语种】中文【中图分类】S634.09+3大白菜(Brassica campestris syn.rapa L.ssp.pekinensis)属于十字花科芸薹属蔬菜，原产中国，又称“结球白菜”、“包心白菜”、“黄芽白”、“胶菜”等，栽培历史非常悠久，品种资源十分丰富，是目前我国栽培面积最大的蔬菜作物之一[1-2]。
８种大白菜过氧化物酶同工酶分析摘要利用聚丙烯酰胺凝胶电泳法对8个大白菜品种的过氧化物酶（POD）同工酶进行分析。
结果表明，8个品种的POD同工酶酶谱在酶带数、迁移率、酶量（酶带宽窄）及酶活性（酶带深浅）等方面均存在相似性，但也有一定的差异。
依酶谱带特征初步将8个品种进行分类，并对其亲缘关系进行了分析。
关键词大白菜；过氧化物酶同工酶；谱带；亲缘关系同工酶广泛存在于生物界中，它表现出明显的种属、组织和发育阶段的特异性，既是生理指标，又是可靠的遗传标志[1]。
过氧化物酶同工酶在高等植物中广泛而大量地存在，具有高度多型性、器官组织特异性和相对稳定性，即同一器官的同一发育时期，POD同工酶酶谱和活性强弱是稳定的，能反映植物的遗传特性[2]。
因而同工酶分析技术被广泛地运用于植物的分类鉴定、亲缘关系及矮化砧木的预选、抗寒性和抗病性鉴定等研究领域。
笔者采用聚丙烯酰胺凝胶电泳方法，对潍坊地区普遍栽种的8个品种的大白菜过氧化物酶同工酶进行分析研究，以期在测定同工酶谱带的基础上，探讨以同工酶谱带特征作为大白菜品种鉴定的依据，进一步测定大白菜品种间的亲缘关系。
1 材料与方法1.1 试验材料试验材料购于潍坊市农科院蔬菜研究所，共8个品种，分别为：潍白秋冠、潍白-78、潍白-68、潍白ER-60、潍白-45、潍白四号、潍白二号及潍白一号。
1.2 试验方法1.2.1 酶液提取。
取8个品种大白菜的种子放入培养皿中，加水在培养箱中（15～25℃）黑暗条件下培养4d。
分别取叶片（除去叶脉）0.5g，洗净用滤纸吸干水分，剪碎置于预冷的研钵中，加入酶提取液（由蔗糖10mL、电极缓冲液2mL、无离子水8mL组成）1mL，研磨成匀浆，移入离心管中，8 000rpm离心10min，取上清液备用。
1.2.2 电泳。
聚丙烯酰胺凝胶电泳参照张卫国（2006）等的方法[2-6]，略有改进。
染色参照杨太兴（1991）、孟秋峰（2006）方法[7，8]，采用醋酸—联苯胺法，略有改进。
大白菜过氧化物酶的分离及某些性质的研究1引言过氧化物酶是一类解剖水解物质的酶,它们也是保护植物防御物质的重要组成部分。
大白菜过氧化物酶是一种植物保护酶,在大白菜中大量存在，具有其独特的生物学性质和功能特征，为大白菜特有的有益物质的生物降解提供了良好的前景。
所以，对大白菜过氧化物酶的分离及某些性质的研究具有重要的理论意义和应用价值。
2研究内容采用技术分析大白菜过氧化物酶的性质，以弄清其特性的原理，为分离及鉴定大白菜过氧化物酶的组成物及活力做准备，搞清各型及酶活力对不同环境和条件的适应性等。
在大白菜中对过氧化物酶的抽提研究主要采用分子筛选方法，用低温反应进行分离，结合抗原的存在，利用免管抗体的特性，有效地从大白菜中分离出java组成的过氧化物酶结合物。
同时，为了更加全面地揭示过氧化物酶的作用机理和功能，对大白菜过氧化物酶的调控特性、底物特性、pH特性等特性进行全面的分析比较，从而进一步深入了解过氧化物酶的生物学特性。
3技术手段研究过氧化物酶的相关性质，主要采用生物化学实验室采用一系列生物化学技术，如电泳，冷冻凝结，回流电泳和凝胶渗透.对大白菜过氧化物酶的特性进行分析，如抗原特性，抗体底物特性，pH特性，温度特性，离子弹性及其底物特性等。
4成果由于大白菜过氧化物酶是一种植物防御酶，所以经过筛选，我们可以找到具有抗性能的大白菜过氧化物酶结合物，这些大白菜过氧化物酶结合物的组成物和酶活使得大白菜有效地抗抑制病原体的生长，即可以降低植物的病害风险。
此外，研究还可以揭示大白菜过氧化物酶的底物特性、抑制特性、pH特性以及酶活的温度和离子弹性，从而为合理利用大白菜中的过氧化物酶，提高植物抗性提供有益的参考依据。
5结论经过对大白菜过氧化物酶的分离及某些性质的研究，成功获取了大白菜中具有一定抗性性能的过氧化物酶结合物。
并且研究还探明了大白菜过氧化物酶的底物特性，抗原特性，pH特性等特性，为提高大白菜抗性提供了有益的参考依据，为保护植物，促进植物的健康发展做出贡献。
不同抗寒冬油菜品种过氧化物同工酶比较次仁白珍【摘要】本文利用聚丙烯酰胺凝胶电泳分析了8份白菜型冬油菜的过氧化物酶同工酶的特性。
结果表明：天油类与陇油类在逆境损伤下酶谱含量差异较大，陇油类的酶谱含量均高于天油类；天油类不同种间酶谱特征基本相同，而陇油类相比天油类而言，酶谱间均存有较大的差异。
这说明陇油类的过氧化物同工酶抗逆性生理作用高于天油类。
%Take advantage of the PAGE polyacrylamide gelelectrophoresis of POD for 8 Spe-cies of campestris.The results indicated that:when the Tianyou and Longyou were damaged by low temperature .the difference of zymogram between the Tianyou and Longyou was obvious,the content of the Longyou were all exceed the Tianyou.The electrophoretograms of POD for four species of the Tianyou of the difference was lower,but the Longyou for four species had sharp distinction.The results state that stress tolerance of the the Tianyou was better than the Longy-ou.【期刊名称】《西藏农业科技》【年(卷),期】2015(000)003【总页数】5页(P35-39)【关键词】油菜;过氧化物同工酶;聚丙烯酰胺凝胶电泳【作者】次仁白珍【作者单位】西藏自治区农牧科学院农业研究所·西藏拉萨·850032【正文语种】中文冬油菜是我国北方地区重要的油料作物之一,对北方地区国民经济和农业生产具有深远意义。
８种大白菜过氧化物酶同工酶分析
摘要利用聚丙烯酰胺凝胶电泳法对8个大白菜品种的过氧化物酶（pod）同工酶进行分析。
结果表明，8个品种的pod同工酶酶谱在酶带数、迁移率、酶量（酶带宽窄）及酶活性（酶带深浅）等方面均存在相似性，但也有一定的差异。
依酶谱带特征初步将8个品种进行分类，并对其亲缘关系进行了分析。
关键词大白菜；过氧化物酶同工酶；谱带；亲缘关系
中图分类号 s634.1 文献标识码 a 文章编号 1007-5739（2009）05-0008-02
同工酶广泛存在于生物界中，它表现出明显的种属、组织和发育阶段的特异性，既是生理指标，又是可靠的遗传标志[1]。
过氧化物酶同工酶在高等植物中广泛而大量地存在，具有高度多型性、器官组织特异性和相对稳定性，即同一器官的同一发育时期，pod同工酶酶谱和活性强弱是稳定的，能反映植物的遗传特性[2]。
因而同工酶分析技术被广泛地运用于植物的分类鉴定、亲缘关系及矮化砧木的预选、抗寒性和抗病性鉴定等研究领域。
笔者采用聚丙烯酰胺凝胶电泳方法，对潍坊地区普遍栽种的8个品种的大白菜过氧化物酶同工酶进行分析研究，以期在测定同工酶谱带的基础上，探讨以同工酶谱带特征作为大白菜品种鉴定的依据，进一步测定大白菜品种间的亲缘关系。
1 材料与方法
1.1 试验材料
试验材料购于潍坊市农科院蔬菜研究所，共8个品种，分别为：潍白秋冠、潍白-78、潍白-68、潍白er-60、潍白-45、潍白四号、潍白二号及潍白一号。
1.2 试验方法
1.2.1 酶液提取。
取8个品种大白菜的种子放入培养皿中，加水在培养箱中（15～25℃）黑暗条件下培养4d。
分别取叶片（除去叶脉）0.5g，洗净用滤纸吸干水分，剪碎置于预冷的研钵中，加入酶提取液（由蔗糖10ml、电极缓冲液2ml、无离子水8ml组成）1ml，研磨成匀浆，移入离心管中，8 000rpm离心10min，取上清液备用。
1.2.2 电泳。
聚丙烯酰胺凝胶电泳参照张卫国（2006）等的方法[2-6]，略有改进。
染色参照杨太兴（1991）、孟秋峰（2006）方法[7，8]，采用醋酸—联苯胺法，略有改进。
染色液的成分为：联苯胺0.5g，冰醋酸3.75ml，4%氯化铵溶液1g，30%双氧水350μl，5%edta 25ml，加蒸馏水混合定容至100ml。
1.2.3 照相及绘制酶谱模式图。
电泳照片拍照，并根据各酶带的相对迁移率绘制过氧化物酶同工酶酶谱模式图。
酶带的相对迁移率rf = 酶带的迁移距离/溴酚蓝的迁移距离[9]。
2 结果与分析
2.1 不同品种大白菜过氧化物酶同工酶酶谱特征
大白菜叶片过氧化物同工酶经电泳后，显示的酶谱带3~5条不等（见图1），从酶谱表型可以看出，同类品种的酶谱具有较稳定的相似性。
把它们分成a、b、c等3个区，其中a区有1~2条酶带，染
色较深；b区染色浅，酶带数1~2条不等；c区染色最深，活性最高，有1条酶带。
酶带的染色深浅在一定程度上表示了酶活性的强弱不同。
潍白er-60酶带的活性普遍低于其他品种。
2.2 迁移距离
溴酚蓝（即前沿指示剂）的迁移距离为7.1cm；8个大白菜品种的过氧化物酶同工酶谱带的迁移距离见表1。
各个品种的酶带数差别较大，但部分酶带的排列具有一定的规律性。
另外，从表1可以看出，在大白菜谱带的b区有一条特征性谱带，迁移距离是4.45cm。
2.3 过氧化物酶同工酶的相对迁移率
8种大白菜共产生32条酶带，表现出13种不同的迁移率，rf值变动在 0.17~0.88之间，但酶带出现的频率差异不是很大。
酶带的迁移距离与酶带数见表2所示。
综合8个品种的酶带迁移率可以得出，rf =0.63位置的酶带可以说是几个白菜品种的基本谱带，为8个品种所共有。
酶谱模式见图2。
2.4 过氧化物酶同工酶酶谱间相似系数
相似系数采用以下公式计算：c＝2w/（a+b）[5，9]；其中：c为酶谱间相似系数；w为a和b 2个品种相同的酶带数；a为品种a
在酶谱中的酶带数；b为品种b在酶谱中的酶带数。
不同品种大白菜的酶谱间的相似系数见表3。
从表3中可以分析出，相似系数越大，说明品种间的亲源关系越近。
相反，相似系数越小，品种间的亲源关系就越远。
相似系数最大的是潍白一号与潍白二号、潍白四号与潍白-45、潍白二号与潍白-68，相似系数都为0.75；其次为潍白秋冠与潍白-78，相似系数为0.66；潍白er-60与潍白-45、潍白er-60与潍白四号相似系数都为0.57；潍白-68与潍白-78、潍白二号与潍白-78、潍白一号与潍白-78、潍白-68与潍白一号、潍白-45与潍白一号、潍白-45与潍白二号相似系数都为0.50；其余品种之间的相似系数较小。
3 结论与讨论
过氧化物酶同工酶分析法不仅能较为客观地反映物种间的遗传差异和它们的亲缘关系，而且利用其进行物种的辅助鉴定，是一种较为方便、有效的手段[10]。
过氧化物酶同工酶在大白菜中广泛而大量地存在，具有高度多型性、器官组织特异性和相对稳定性。
即同一器官的同一发育时期，pod同工酶酶谱和活性强弱是稳定的，能反映大白菜的遗传特性[11，12]。
要想研究过氧化物酶与不同品种的系谱进化及抗逆性之间的关系，应选具有代表性、一致性的品种，最好是地方品种。
因为品种在迁移过程中可能会出现变异或环境的不适应，同时过氧化物酶受气候环境、温度、生长发育时期等方面的影响也很大[13]。
作为基因的表达产物，酶具有一定的不稳定性，在很多情况下要受到环境条件的影响，而且许多因素也会影响电泳及分析效果，这都使得试验存在一定的误差。
本试验的8个大白菜品种是潍坊地区普遍栽植的品种，经分析在酶带数量、位点及分布格局上有一定的相似性，在酶带的共性方面也表现出一定的相似性，即品种与品种之间、几个品种之间出现相同的1~3条同带。
这说明他们在种间有一定的相似性，8种植物间存在着亲缘关系。
这种亲缘关系还需要通过进行种间相似性聚类分析进一步得出结论。
4 参考文献
[1] 闫忠业，伊凯，李作轩，等.富士系苹果过氧化物酶同工酶研究[j].沈阳农业大学学报，2006（4）：578-581.
[2] 刘永军，王同坤，齐永顺，等.不同板栗品种（系）过氧化物酶同工酶的分析比较（简报）[j].河北科技师范学院学报，2006（4）：72-75，80.
[3] 陈学群，周光凡，周源，等.芥菜脂酶同工酶分析[j].西南农业学报，1993，6（3）：40-46.
[4] 刘永军，郭守华，杨晓玲.植物生理生化实验[m].北京：中国农业科技出版社，2002.
[5] 张卫国，罗冬梅，徐颖利，等.10个品种向日葵过氧化物酶同工酶分析[j].内蒙古民族大学学报（自然科学版），2006，21（5）：528-531.
[6] 吴沿友，周光艺.芸薹族几种近缘植物的过氧化物同工酶的研究[j].贵州农业科学，1996（2）：14-17.
[7] 孟秋峰，王毓洪，顿兰凤，等.八个芥菜品种的过氧化物同
工酶分析[j].安徽农学通报，2006，12（11）：70-71.
[8] 杨太兴，贾希海，李仁风，等.同工酶电泳技术在品种纯度检验中的应用研究[j].种子，1991（6）：1-5.
[9] 陈学群，周光凡.芥菜脂酶同工酶分析[j].西南农业学报，1993，6（3）：40-46.
[10] 谢可军，李阳春，吴天德.10种早熟禾属植物的过氧化酶同工酶分析[j].中国草地，2003，25（2）：30-33.
[11] 吴少伯.植物组织中蛋白质及同工酶的聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳[j].植物生理学通讯，1979（1）：30-33.
[12] 卞阿娜，方份.菊花7个品种过氧化物酶同工酶分析[j].漳州师范学院学报，2003，16（1）：78-81.
[13] 郭水良，毛郁薷.温度对过氧化物酶同工酶谱的影响[j].广西植物，2002，22（6）：557-562.。
