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实验报告题目:单元二:目的基因的克隆、转化及重组子筛选指导老师:丛佩清日期:2013/10/24-2013/10/26一．实验目的：(1)学习和掌握DNA片段胶回收的方法。
(2)学习DNA连接的有关技术。
(3)掌握用CaCl2 法制备感受态细胞的原理和方法。
(4)学习和掌握质粒DNA的转化和重组质粒的筛选方法。
(5)掌握质粒提取的基本方法。
(6)学习和掌握限制性内切酶的使用方法。
二．实验原理：(1)cDNA的TA克隆:Taq酶能够在PCR产物的3’末端加上一个非模板依赖的A，而T载体是一种带有 3’T突出端的载体，在连接酶作用下，通过粘性末端连接，把PCR产物插入到质粒载体的多克隆位点，称为 T-A克隆。
可用于PCR产物的克隆和测序。
(2)感受态细胞制备原理：细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态,细菌处于0℃，CaCl2的低渗溶液中，细胞膨胀，细胞壁通透性增强,在冷热变化刺激下细胞膜表面产生裂隙，使外源DNA进入。
(3)蓝白斑筛选:载体带有一个LacZ基因的调控序列和头146个氨基酸的编码信息，编码α-互补肽；宿主细胞编码C端部分序列。
诱导物IPTG 和乳糖的结构相似，可以与乳糖操纵元的阻遏蛋白结合，从而解除阻遏蛋白的作用，使载体得以合成α-互补肽，与宿主细胞编码的C端部分结合形成β-半乳糖苷酶，而X-Gal是β-半乳糖苷酶的显色底物，在β-半乳糖苷酶的催化下会产生蓝色产物。
可用于重组克隆的筛选，重组克隆无法产生α-互补肽，因而无法使X-Gal显色，培养基上表现为白色菌落。
三．实验材料：大肠杆菌DH5a、LB培养基、0.1mol/L CaCl2溶液、Binding Buffer、spin-column、SPW 溶液、1µl pMD19-T Vector、5µlSolution Ⅰ、250µlSolution Ⅰ、250µlSolution Ⅱ、350µlSolution Ⅲ、HiBind ® Mini Columns (I)、500 µlBuffer HB、1400 µlDNA Wash Buffer等四．实验步骤、现象、结果及分析：Ⅰ10月24号(1)cDNA电泳及胶回收1. 取上周制备的置于-20℃冰箱保存的目的基因产物1、2、3组DNA样品，选取其中2号组及3号组进行琼脂糖电泳，因1号组RT-PCR琼脂糖凝胶电泳有杂带故弃而不用，1、3号组DNA样品（已加入loading buffer）分别加入SYBR Gold2µl，1%琼脂糖电泳，紫外灯下切胶。
口腔鳞癌组织中肿瘤转移相关基因1（MTA1）一、选择原因及应用口腔鳞癌组织中肿瘤转移相关基因1（MTA1）在蛋白和mRNA的表达水平，揭示其与口腔鳞癌（OSCC）发生、发展的关系。
方法采用免疫组织化学法和原位杂交技术检测46例OSCC标本、15例口腔黏膜白斑与20例正常口腔黏膜标本中MTAl 基因的表达水平，并分析其与OSCC临床病理学参数的关系。
结果MTA1蛋白和MTA1mRNA在OSCC组织中的表达水平显著高于口腔黏膜白斑和正常口腔黏膜（P 〈0．05），口腔黏膜白斑中MTA1蛋白和MTA1mRNA表达水平显著高于口腔正常黏膜（P〈0．01），MTA1蛋白和MTA1mRNA表达与肿瘤浸润深度和淋巴结转移密切相关（P〈0．05）。
结论MTA1基因在蛋白和mRNA的表达水平在OSCC发生、发展及浸润转移过程中起一定促进作用，有望成为判断OSCC预后及选择治疗方案的一个新肿瘤标志物。
二、2查阅NCBI得到MTA1相关信息并获得目的基因PREDICTED: Gorilla gorilla gorilla metastasis associated 1 (MTA1), mRNANCBI Reference Sequence: XM_004055801.1FASTA GraphicsLOCUS XM_004055801 2872 bp mRNA linear PRI 03-DEC-2012DEFINITION PREDICTED: Gorilla gorilla gorilla metastasis associated 1 (MTA1),mRNA.ACCESSION XM_004055801VERSION XM_004055801.1 GI:426378238KEYWORDS .SOURCE Gorilla gorilla gorilla (western lowland gorilla) ORGANISM Gorilla gorilla gorillaEukaryota; Metazoa; Chordata; Craniata; Vertebrata; Euteleostomi;Mammalia; Eutheria; Euarchontoglires; Primates; Haplorrhini;Catarrhini; Hominidae; Gorilla.COMMENT MODEL REFSEQ: This record is predicted by automated computationalanalysis. This record is derived from a genomic sequence(NW_004005914) annotated using gene prediction method: GNOMON,supported by mRNA and EST evidence.Also see:Documentation of NCBI's Annotation Process##Genome-Annotation-Data-START##Annotation Provider :: NCBIAnnotation Status :: Full annotationAnnotation Version :: Gorilla gorilla Annotation Release 100Annotation Pipeline :: NCBI eukaryotic genome annotation pipelineAnnotation Method :: Best-placed RefSeq; Gnomon Features Annotated :: Gene; mRNA; CDS; ncRNA##Genome-Annotation-Data-END##FEATURES Location/Qualifierssource 1..2872/organism="Gorilla gorilla gorilla"/mol_type="mRNA"/sub_species="gorilla"/db_xref="taxon:9595"/chromosome="14"gene 1..2872/gene="MTA1"/note="Derived by automated computational analysis usinggene prediction method: GNOMON. Supporting evidence/codon_start=1/product="metastasis-associated protein MTA1"/protein_id="XP_004055849.1"/db_xref="GI:426378239"/db_xref="GeneID:101134898"/translation="MAANMYRVGDYVYFENSSSNPYLIRRIEELNKTANGNVEAKVVC FYRRRDISSTLIALADKHATLSVCYKAGPGADNGEEGEIEEEMENPEMVDLPEKLKHQ LRHRELFLSRQLESLPATHIRGKCSVTLLNETESLKSYLEREDFFFYSLVYDPQQKTL LADKGEIRVGNRYQADITDLLKEGEEDGRDQSKLETKVWEAHNPLTDKQIDQFLVVAR SVGTFARALDCSSSVRQPSLHMSAAAASRDITLFHAMDTLHKNIYDISKAISALVPQG GPVLCRDEMEEWSASEANLFEEALEKYGKDFTDIQQDFLPWKSLTSIIEYYYMWKTTD RYVQQKRLKAAEAESKLKQVYIPNYNKPNPNQISVNNVKAGVVNGTGAPGQSPGAGRA CESCYTTQSYQWYSWGPPNMQCRLCASCWTYWKKYGGLKMPTRLDGERPGPNRSNMSP HGLPARSSGSPKFAMKTRQAFYLHTTKLTRIARRLCREILRPWHAARHPYLPINSAAI KAECTARLPEASQSPLVLKQAVRKPLEAVLRYLETHPRPPKPDPVKSVSSVLSSLTPA KVAPVINNGSPTILGKRSYEQHNGVDGNMKKRLLMPSRGLANHGQTRHMGPSRNLLLN GKSYPTKVRLIRGGSLPPVKRRRMNWIDAPDDVFYMATEETRKIRKLLSSSETKRAAR RPYKPIALRQSQALPLRPPPPAPVNDEPIVIED" ORIGIN1 tcctcctctt cctctcccgc ccgcgccgcg gccctcccgt ccctgcgcgg cctcggcggc61 ctcggcggcg gcggcggcgg cggcggcagc agcgcggccc ctttaaacgc ctgcggcgccgcgccgagcg ccgcgcccgcaacatgtaca gggtcggaga241 ctacgtctac tttgagaact cctccagcaa cccatacctg atccggagga tcgaggagct301 caacaagacg gccaatggga acgtggaggc caaagtggtg tgcttctacc ggaggcggga361 catctccagc accctcatcg ccctggccga caagcacgca accctgtcag tctgctataa421 ggccggaccg ggggcggaca acggcgagga aggggaaata gaagaggaaa tggagaatcc481 ggaaatggtg gacctgcccg agaaactaaa gcaccagctg cggcatcggg agctgttcct541 ctcccggcag ctggagtctc tgcccgccac gcacatcagg ggcaagtgca gcgtcaccct601 gctcaacgag accgagtcgc tcaagtccta cctggagcgg gaggatttct tcttctattc661 tctagtctac gacccacagc agaagaccct gctggcagat aaaggagaga ttcgagtagg721 aaaccggtac caggcagaca tcaccgactt gttaaaagaa ggcgaggagg atggccgaga781 ccagtccaag ttggagacca aggtgtggga ggcgcacaac ccactcacag acaagcagat841 cgaccagttc ctggtggtgg cccgctctgt gggcaccttc gcacgggccc tggactgcag901 cagctccgtc cgacagccca gcctgcacat gagcgccgca gctgcctccc gagacatcac961 gctgttccac gccatggata ctctccacaa gaacatctat gacatctcca aggccatctc1021 ggcactggtg ccgcagggcg ggcccgtgct ctgcagggac gagatggagg agtggtctgc1081 atcagaggcc aaccttttcg aggaagccct ggaaaaatat gggaaggatt tcacggacat1141 tcagcaagat tttctcccgt ggaagtcgct gaccagcatc attgagtact actacatgtg1201 gaagaccacc gacagatacg tgcagcagaa acgcttgaaa gcagctgaag ctgagagcaa1261 gttaaagcaa gtttatattc ccaactataa caagccaaat ccgaaccaaa tcagtgtcaa1321 caacgtcaag gccggtgtgg tgaatggcac gggggcgccg ggccagagcc ctggggctgg1381 ccgggcctgc gagagctgtt acaccacaca gtcttaccag tggtattctt ggggtccccc1441 taacatgcag tgtcgtctct gcgcatcttg ttggacatat tggaagaaat atggtggctt1501 gaaaatgcca acccggttag atggagagag gccaggacca aaccgcagta acatgagtcc1561 ccacggcctc ccagcccgga gcagcgggag ccccaagttt gccatgaaga ccaggcaggc1621 tttctatctg cacacgacga agctgacgcg gatcgcccgg cgcctgtgcc gtgagatcct1681 gcgcccgtgg cacgctgcgc ggcaccccta cctgcccatc aacagtgcgg ccatcaaggc1741 cgagtgcacg gcgcggctgc ccgaagcctc ccagagcccg ctggtgctga agcaggcggt1801 acgcaagccg ctggaagccg tgcttcggta tcttgagacc cacccccgtc cccccaagcc1861 tgaccccgtg aaaagcgtgt ccagcgtgct cagcagcctg acgcccgcca aggtggcccc1921 cgtcatcaac aacggctccc ccaccatcct gggcaagcgc agctacgagc agcacaacgg1981 ggtggacggc aacatgaaga agcgcctctt gatgcccagt aggggtctgg caaaccacgg2041 acagaccagg cacatgggac caagccggaa cctcctgctc aacgggaagt cctaccccac2101 caaagtgcgc ctgatccggg ggggctccct gcccccagtc aagcggcggc ggatgaactg2161 gatcgacgcc ccggatgacg tgttctacat ggccacagag gagaccagga agatccgcaa2221 gctgctctca tcctcggaaa ccaagcgtgc tgcccgccgg ccctacaagc ccatcgccctgcgcccgtca acgacgagccgccccccgcc cctcgcccgc2401 ccacacggcc ccttcccagc cagcccgccg cccgcccctc agtttggtag tgccccacct2461 cccgccctca cctgcagaga aacgcgctcc ttggcggaca ctgagggagg agaggaagaa2521 gcgcggctaa cttattccga gaatgccgag gagttgtcgt ttttagcttt gtgtttactt2581 tttggctgga gcggagatga ggggccaccc cgtgcccctg tgctgcgggg ccttttgccc2641 ggaggccggg ccctaaggtt ttgttgtgtt ctgttgaagg tgccgtttta aattttattt2701 ttattacttt ttttgtagat gaacttgagc tctgtaactt acacctggaa tgttaggatc2761 gtgcggccgc ggccggccga gctgcctggc ggggttggcc cttgtctttt caagtaattt2821 tcatattaaa caaaaacaaa gaaaaaaatc ttataaaaag gaaaaaaacc aa//三、表达载体的选择我所选用的原核表达载体为质粒pBR322；pBR322 是一种常用的E. coli 克隆载体（1），为4,361 bp 的环状双链DNA（2）。
基因工程复习题题型：名词解释（10个）30分；填空（每空1分） 20分；选择题（每题1分）10分；简答题（4个）20分；论述题（2个）20分。
第一章绪论1.名词解释：基因工程：按照预先设计好的蓝图，利用现代分子生物学技术，特别是酶学技术，对遗传物质DNA直接进行体外重组操作与改造，将一种生物（供体）的基因转移到另外一种生物（受体）中去，从而实现受体生物的定向改造与改良。
遗传工程广义：指以改变生物有机体性状为目标，采用类似工程技术手段而进行的对遗传物质的操作，以改良品质或创造新品种。
包括细胞工程、染色体工程、细胞器工程和基因工程等不同的技术层次。
狭义：基因工程。
克隆：无性(繁殖)系或纯系。
指由同个祖先经过无性繁殖方式得到的一群由遗传上同一的DNA分子、细胞或个体组成的特殊生命群体。
2．什么是基因克隆及基本要点?3.举例说明基因工程发展过程中的三个重大事件。
A) 限制性内切酶和DNA连接酶的发现（标志着DNA重组时代的开始）；B) 载体的使用；C) 1970年，逆转录酶及抗性标记的发现。
4.基因工程研究的主要内容是什么？基础研究：基因工程克隆载体的研究基因工程受体系统的研究目的基因的研究基因工程工具酶的研究基因工程新技术的研究应用研究：基因工程药物研究转基因动植物的研究在食品、化学、能源和环境保护等方面的应用研究第二章基因克隆的工具酶1.名词解释：限制性核酸内切酶：一类能识别双链DNA中特殊核苷酸序列，并使每条链的一个磷酸二酯键断开的内脱氧核糖核酸酶。
回文结构：双链DNA中的一段倒置重复序列，当该序列的双链被打开后，可形成发夹结构。
同尾酶：来源不同、识别序列不同，但产生相同粘性末端的酶。
同裂酶：不同来源的限制酶可切割同一靶序列和具有相同的识别序列黏性末端：DNA末端一条链突出的几个核苷酸能与另一个具有突出单链的DNA末端通过互补配对粘合，这样的DNA末端，称为粘性末端。
平末端：DNA片段的末端是平齐的。
