下载文档原格式
第五章目的基因的获取第五章目的基因的获取1976年H.G. Khorana 提出了用化学方法合成基因的设想，并于1979年在science 上发表了率先成功地合成大肠杆菌酪氨酸tRNA 基因的论文。
第一节化学合成目的基因目前常用的方法一、目前常用的方法磷酸二酯法、磷酸三酯法、亚磷酸三酯法、固相合成法自动化合成法。
①保护dNTP 的5’端P 或3’端-OH （1）原理1. 磷酸二酯法保证合成反应的定向进行。
然后再用酸②带保护的单核苷酸连接或碱脱去保护基团带5’保护的单核苷酸与带3’保护的另一个单核苷酸以磷酸二酯键连接起来。
然后去掉一个保护，使其循环往复连接。
（2）合成过程5’端保护的单核苷酸可以同3’端保护的二核苷酸聚合。
保护连接去保护连接原理与磷酸二酯法一样。
只是参加反应的单核苷酸都是在3’端磷酸和5’-OH 上都先连接了一个保护基团。
2. 磷酸三酯法固相磷酸三酯合成法将第一个核苷酸的3’-OH 端固定在固相支持物上。
（第一个核苷酸不需要保护）固相磷酸酯合成法是目前通用的合成方法。
化学合成的DNA 片断一般在200bp 以内。
需要把几个正确片段连接起来二、化学合成DNA 片断的组装1. 互补连接法（1）互补配对用T4多核苷酸激酶使各个片段的5’端带上磷酸。
预先设计合成的片断之间都有互补区域，不同片断之间的互补区域形成有断点的完整双链。
（2）5’端磷酸化T4多核苷酸激酶使5’-OH磷酸化（3）连接酶连成完整双链T4 DNA连接酶完整的DNA双链2. 互补延伸连接法预先设计的片断之间有局部互补区，可以相互作为另一个片断延长的引物，用DNA聚合酶延伸成完整的双链。
3’5’5’3’5’3’T4DNA连接酶Klenow片段引物1. 直接合成基因三、寡聚核苷酸化学合成的优点（1）有些组织特异性mRNA的含量很低，很难用cDNA方法克隆）有些基因比较短化学合成费用较低2. 合成测序或PCR用的引物（20bp左右）（2）有些基因比较短，化学合成费用较低3. 合成探针序列以筛选特定的基因4. 定点突变合成合成带有定点突变的基因片段。
第一章基因工程概述一、名词解释基因：编码产生蛋白质或RNA等具有特定功能产物的一段具有遗传效应的DNA片段，是控制生物性状的基本遗传单位。
基因操作：基因操作是指对基因进行分离、分析、改造、重组、转移、检测和表达等操作的总称。
基因工程：专指为实践应用而进行的基因重组事件，具体指通过基因操作来定向改变或修饰生物体，并具有明确目的的活动。
重组DNA技术：基因重组是指将一种生物（供体）的基因（DNA片段）与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之稳定遗传并表达出新产物或新性状的DNA体外操作程序。
二、思考题1、简述基因工程操作的基本步骤。
2、简述基因工程操作的理论依据。
（1）基因具有相同的物质基础（2）基因是可切割和粘合的（3）基因是可转移的（4）多肽与基因之间有对应关系（5）遗传密码通用（6）基因可以复制遗传3、简述基因工程诞生理论上的三大发现和技术上的三大发明。
理论上的三大发现: 遗传物质是DNA（基因） DNA的双螺旋结构和半保留复制中心法则和氨基酸密码子技术上的三大发明：限制性核酸内切酶 DNA连接酶质粒和病毒第二章基因工程的工具酶一、名词解释限制性内切酶：是一类能识别双链DNA分子内部某种特殊的核苷酸序列，并使每个核酸链上特定部位相邻的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开的一类核酸内切酶。
同裂酶：指来源不同，但识别相同靶序列，切割产生不同或相同末端的限制性内切酶。
即不同来源的限制性内切酶可切割相同的序列。
同尾酶：指来源各异，识别靶序列各不相同，但切割产生相同末端的限制性内切酶。
同尾酶切割DNA得到的产物可进行互补连接。
DNA连接酶：催化DNA片段两侧（相邻）核苷酸的3'羟基（-OH）和5'磷酸基（-P）之间形成磷酸二酯键，使断开的DNA连接起来的酶。
DNA聚合酶：催化DNA合成的酶逆转录酶：依赖RNA的DNA聚合酶二、思考题1、简述限制性内切酶命名的基本原则。
属名+种名+株号+序号第一个字母：取宿主属名首字母，大写斜体。
第五章目的基因与载体的连接内容提要•基因重组克隆与亚克隆•基因重组对载体的要求与载体类型•连接前的处理•黏性末端连接•平端连接•人工接头连接•同聚寡核苷酸末端连接第一节基因重组克隆与亚克隆外源基因的获取载体的选择与构建外源基因与载体的切割与修饰外源基因与载体的连接（DNA体外重组）目的基因的表达重组DNA导入受体细胞重组体的筛选体外重组就是指目的基因与载体DNA的连接。
基因重组是靠DNA连接酶将适当切割的DNA即目的基因与载体共价连接。
DNA连接酶能催化相邻或两侧的DNA上裂口核苷酸裸露的3’-羟基和5’-磷酸之间形成共价结合的磷酸二酯键，使断开的DNA裂口连接起来。
在分子克隆中中，最有用的连接酶是来自于T4噬菌体的DNA连接酶——T4连接酶，该酶需要ATP作为辅助因子。
注意：在连接之前，应结合研究目的基因的特性，来设计最终构建的重组体分子。
一、体外连接重组DNA的特点1、DNA体外连接减少了DNA分子进入宿主细胞后遭受降解的危险，增加了转化效率；2、由于限制性内切酶产生的黏端在体外连接，使原来酶的识别序列在整个DNA维持完整性，有利于在重组子转化扩增以后再对外源基因的分离；3、连接时可以控制连接反应条件，有利于形成环状分子或者几个DNA片段头尾相连接的直线多联体。
基因重组克隆实质上就是DNA体外重组以及后续的转化过程。
亚克隆是指把DNA片段从某一类型载体无性繁殖到另一类型载体的过程。
例如：重组λ-噬菌体质粒亚克隆通常是将较大的克隆片段经酶切后，再将所有的小DNA片段与另一个载体连接转化的程序。
注意：进行连接反应时，要考虑载体DNA与DNA片段的比率。
例如：以自质粒载体形成环状分子，1：1。
以λ噬菌体或cos质粒为载体，形成多联体分子，二者的比例相应的就高些。
第二节基因重组对载体的要求与载体类型根据重组连接的目的，可将载体分为克隆载体和表达载体。
一、克隆载体如果所进行的重组连接暂时不考虑表达量的问题，只是为目的基因的获得或使该基因克隆、亚克隆或扩增、构建DNA文库，可以选择一般的克隆型载体。
