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第五章目的基因的获取

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第五章 目的基因的获取

第五章 目的基因的获取

04
目的基因的分离与纯化
基因克隆载体构建
目的基因的分离：通过PCR技术从基因组中分离出目的基因
目的基因的纯化：通过凝胶电泳、DN纯化试剂盒等方法纯化目的基因
载体的选择：选择合适的载体如质粒、噬菌体等
载体的构建：将目的基因插入到载体中形成重组DN分子
重组DN分子的转化：将重组DN分子转化到宿主细胞中如大肠杆菌、酵母菌等
生物安全：通过基因工程提高生物的安全性降低生物危害的风险
基因工程：通过基因编辑技术对生物进行改造提高其抗病、抗虫、抗逆等能力
环境保护：通过基因工程减少农药、化肥的使用降低对环境的污染
生物多样性保护：通过基因工程保护濒危物种维护生物多样性
06
目的基因获取的技术挑战与展望
技术瓶颈与创Байду номын сангаас发展
技术瓶颈：目的基因获取的难度大需要克服基因编辑、基因表达调控等技术难题
生物育种与农业科技
提高作物产量：通过基因编辑技术提高作物的抗病性、抗虫性等从而提高产量。
改善作物品质：通过基因编辑技术改善作物的营养成分、口感等提高作物品质。
开发新型作物：通过基因编辑技术开发具有特殊功能的作物如抗旱、抗盐碱等。
保护生态环境：通过基因编辑技术减少农药、化肥的使用保护生态环境。
生物安全与环境保护
社会责任：基因编辑技术的应用需要承担社会责任如保护隐私、防止滥用等
展望：随着技术的发展伦理、法律和社会责任问题将越来越受到重视需要制定相应的政策和法规来规范基因编辑技术的应用。
未来趋势与展望
添加标题
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合成生物学：合成生物学的发展将使目的基因获取更加可控和可预测。
基因编辑技术：CRISPR/Cs9等基因编辑技术的发展将使目的基因获取更加精确和高效。

第五章目的基因的获取

第五章目的基因的获取

洗脱
与探针碱基互补的mRNA结合 到柱上，其它mRNA流走。
RT-PCR
原理： 羟基磷灰石柱 （Hydroxylapatite column） 结合单链DNA-RNA或DNA-DNA双 链，不结合单链DNA。
从表达A蛋白和不表达A蛋白的组织细胞中 分别提取和分离总mRNA。
将表达A蛋白的mRNA合成cDNA第一链。 再同不表达A蛋白的总mRNA杂交成cDNAmRNA双链。
反转录成目的基因cDNA第一链 目的 基因cDNA第二链 目的基因 的引物2
PCR
（2）mRNA的分离纯化 ① 原理 利用mRNA都含有一段polyA尾巴， 将mRNA从总RNA（rRNA、tRNA 等）中分离纯化。 mRNA只占总RNA的1%-2%。 ② mR柱。
① cDNA第一链合成 逆转录酶能以RNA为模板合成DNA。
利用某种生物的总mRNA合成cDNA，再将 这些cDNA与载体连接，转）不含内含子序列。 （2）可以在细菌中直接表达。 （3）包含库的一般步骤 （1）总RNA（total RNA）提取 提取总RNA有商业化的试剂盒（kit）。
不能杂交的cDNA就包括特异表达的A基因 的cDNA单链。
用羟磷灰石柱收集单链cDNA，合成为双链 DNA进行扩增、克隆、测序。
A组织 总mRNA（A）
含蛋白A的mRNA
B组织 总mRNA（B）
不含蛋白A的mRNA
总cDNA第一链
内含蛋白A 的cDNA
杂交
B A
过柱
单链滤过
A A A
羟磷灰石柱
吸收 RNA- 羟磷灰石柱 DNA
原核细胞
提取基因组DNA 原核基因组部分
PCR扩增
2. 从mRNA中扩增: RT-PCR （1）提取基因组 total RNA

第五章 目的基因的获取 ppt课件

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30
（2）载体与基因组DNA大片段的连接 直接连接、人工接头或同聚物加尾。
① 粘性末端直接连接 载体与外源DNA大片段的两个末端 都有相同的粘性末端。 如：Sau3A与BamHI的酶切末端。
②人工接头法（adapter） 人工合成的限制性内切酶粘性末端片段。
31
各种酶的接头可以向公司定做或购买。
5’
5’ 引物
cDNA第一链
3’
碱 或RNaseH
5’ 引物
cDNA第一链
3’
41
③ cDNA第二链合成
剩下的cDNA单链的3’末端一般形成一个弯 回来的双链发卡结构（机理不明），可成 为合成第二条cDNA链的引物。用DNA聚 合酶合成第二链DNA.。
5’
cDNA第一链
cDNA第二链合成
DNA聚合酶
(2)活化新的碱基 核苷酸单体2 的3’端的二异丙基亚磷酸酰 上的磷酸的OH用β-氰乙基或甲基保护，准备和前一个碱基 进行反应。
19
(3)缩合反应 在弱强——四唑的存在下，新加入带保护基的 核苷酸单体2与单体1发生缩合反应，形成3’，5’—磷酸二酯 键，其中，磷为3影
测序分析
51
第四节 目的基因的分离和扩增
一、从mRNA分离目的基因 富集特定基因的mRNA或cDNA模板。
1. 探针柱分离特异mRNA
根据已知的基因序列合成探针，结合 到纤维素柱上，用来分离纯化该基因 的mRNA。
52
Total mRNA 过柱
探针DNA
26
5. 合成人工接头或衔接物
含有各种酶切位点人工接头（Adaptor）或衔 接物（Linker）序列。
衔接物用化学合成法合成的一段10-12bp的特定 限制性内切酶识别位点序列的平端双链。

第五章目的基因的获取

第五章目的基因的获取

第五章目的基因的获取第五章目的基因的获取1976年H.G. Khorana 提出了用化学方法合成基因的设想，并于1979年在science 上发表了率先成功地合成大肠杆菌酪氨酸tRNA 基因的论文。

第一节化学合成目的基因目前常用的方法一、目前常用的方法磷酸二酯法、磷酸三酯法、亚磷酸三酯法、固相合成法自动化合成法。

①保护dNTP 的5’端P 或3’端-OH （1）原理1. 磷酸二酯法保证合成反应的定向进行。

然后再用酸②带保护的单核苷酸连接或碱脱去保护基团带5’保护的单核苷酸与带3’保护的另一个单核苷酸以磷酸二酯键连接起来。

然后去掉一个保护，使其循环往复连接。

（2）合成过程5’端保护的单核苷酸可以同3’端保护的二核苷酸聚合。

保护连接去保护连接原理与磷酸二酯法一样。

只是参加反应的单核苷酸都是在3’端磷酸和5’-OH 上都先连接了一个保护基团。

2. 磷酸三酯法固相磷酸三酯合成法将第一个核苷酸的3’-OH 端固定在固相支持物上。

（第一个核苷酸不需要保护）固相磷酸酯合成法是目前通用的合成方法。

化学合成的DNA 片断一般在200bp 以内。

需要把几个正确片段连接起来二、化学合成DNA 片断的组装1. 互补连接法（1）互补配对用T4多核苷酸激酶使各个片段的5’端带上磷酸。

预先设计合成的片断之间都有互补区域，不同片断之间的互补区域形成有断点的完整双链。

（2）5’端磷酸化T4多核苷酸激酶使5’-OH磷酸化（3）连接酶连成完整双链T4 DNA连接酶完整的DNA双链2. 互补延伸连接法预先设计的片断之间有局部互补区，可以相互作为另一个片断延长的引物，用DNA聚合酶延伸成完整的双链。

3’5’5’3’5’3’T4DNA连接酶Klenow片段引物1. 直接合成基因三、寡聚核苷酸化学合成的优点（1）有些组织特异性mRNA的含量很低，很难用cDNA方法克隆）有些基因比较短化学合成费用较低2. 合成测序或PCR用的引物（20bp左右）（2）有些基因比较短，化学合成费用较低3. 合成探针序列以筛选特定的基因4. 定点突变合成合成带有定点突变的基因片段。

基因工程 第五章目的基因的获取

基因工程 第五章目的基因的获取
oligo(dT)引导的DNA合成法：
利用真核mRNA分子所具有的poly(A)尾巴的特性，加入1220个脱氧胸腺嘧啶核苷组成的oligo(dT)短片段，由反转录酶 合成cDNA的第一链。
3’AAAAAAA mRNA 5’ TTTTTTT cDNA 反转录酶 Oligo dT引物
5’
随机引物引导的cDNA合成法 (randomly primed cDNA synthesis) ：
1）4bp的内切酶 平均每44（256）bp一个切点。
随机程度高。如HaeⅢ、AluI、Sau3A。
2）6bp的内切酶 平均每46（4096）bp一个切点。 ② 内切酶粘性末端 能与常用克隆位点相连。
（Sau3A—BamH I）
2. 机械切割法 （1）超声波
超声波强烈作用于DNA，可使其断裂成约300bp 的随机片断。
同 一 限 制 酶 切 位 点 连 接
GGATCC CCTAGG G CCTAG 目的基因用 Bam HⅠ切割
G CCTAG G CCTAG
Bam HⅠ切割反应
GATCC G 载体DNA用Bam HⅠ切割
+
GATCC G GATCC G
GGATCC CCTAGG GGATCC CCTAGG
GGATCC CCTAGG GGATCC CCTAGG
1. 优点 由于带有粘性末端，产物可以直接与载 体连接。 2. 缺点 目的基因内部也可能有该内切酶的切点。 目的基因也被切成碎片！
BamH I
BamH I
BamH I
gene
二、随机片断化 1. 限制性内切酶局部消化法 控制内切酶的用量和消化时间，使基 因组中的酶切位点只有一部分被随机 切开。 （1）限制性内切酶的选用原则 ① 内切酶识别位点的碱基数 影响所切出的产物的长度和随机程度。

第五章 目的基因的获得

第五章 目的基因的获得
a.载体的或考斯质粒；对于大型基 因组（如动植物和人类）需使用YAC或BAC载体 上述几种载体的最大装载量如下： 质粒 15 kb λ-DNA 25 kb 考斯质粒 45 kb BAC 300 kb YAC 400 kb b.受体的选择： 根据载体的不同使用大肠杆菌或酵母菌
不同生物不同发育阶段，目的基因的转录水平 不同，因而在提取mRNA时，应选择特定发育阶段 的特定组织作为提取材料。 根据mRNA3‘端具有ploy(A)结构的特性，利用 结合了ploy(T)的纤维素柱层析法和磁珠分离法提取 mRNA，最后还可以利用琼脂糖凝胶电泳、密度梯 度离心等方法对进行富集。另外，有时还要大肠杆菌或其他受体混 合，使其转化进受体细胞内
cDNA 文 库 提取细胞总mRNA，合成总cDNA，将之全部 克隆，然后借助于合适的筛选手段找到目的重 组子 筛选时，若使用的是多拷贝载体，则采用菌落 原位杂交法筛选；若使用的是表达型载体，则 采用菌落免疫杂交法筛选 完备分离程序适用于mRNA丰度低（<0.5%） 的目的基因的克隆，如人胰岛素基因、干扰素 基因DNA，用物理方法或酶法，将DNA降解成预期大小的 片段，然后将这些片段与适当的载体连接，并转入受体 细菌或细胞，这样每一个细胞接受了含有一个基因组 DNA片段与载体连接的重组DNA分子，而且可以繁殖 扩增，许多细胞一起组成一个含有基因组各DNNA序列。从基因组含 有生物生存、活动olyA结构 细菌或原核生物的mRNA半衰期很短 mRNA在细胞中含量少，对酶和碱极为敏 感，分离纯化困难 仅限于克隆蛋白质编码基因

三、目的基因的获得
（一）对已知序列基因的分离
1.核酸杂交法－菌落 和空斑的原位杂交 （P108、150）
2）特异分离程序 提取细胞总mRNA，琼脂糖凝胶电泳分离，回收 目标mRNA，由此合成双链cDNA，然后进行克隆 特异分离程序较适用于mRNA丰度高(50～90%)的 目的基因克隆，如血红蛋白基因等

第五章目的基因的获取

第五章目的基因的获取
的基因流程
目的标签法、非目的标签法
五、图位克隆（mapbased cloning）获 得目的基因
图位克隆：又叫定位克隆，1986年首先由剑
桥大学的Alancoulson提出。
根据目的基因在染色体上的位置进行分离基因，
无需预先知道基因的DNA顺序，也无需预先
六、mRNA差别显示技术（mRNA differential display）获得差异表达的基因
mRNA差别显示技术：对组织特异性 或诱导专一性表达基因进行分离的有效方 法之一。将mRNA逆转录和PCR技术相 互结合发展起来的一种RNA指纹图谱技 术，也称为DDRT-PCR，
DDRT-PCR理论基础
3’ 5’
template templat因库（gene pool）：特定生物体全基因组的
集合（天然存在）e bank） 通过克隆的方法将某一基因组DNA或mRNA 保存于适当宿主菌中形成的转化子群。所有重 组DNA组合代表该基因组的全序列。
探针：目的基因局部片段、由氨基酸序列
获得的简并序列、近缘物种的同源序列
四、转座子标签法获得目的基因
（一）转座子的相关知识
转座子（transposon,Tn）:指位于染色体上
可以从基因组的一个位置转移到另一个位置的 DNA片段或基因。（jumping gene）
简单转座子：除转座所需基因外不携带任何
实验结果： 240组在能分出20000多条带！ 如果每条带相当于一种特定mRNA， 20000 mRNA基本上反映了一种特定细 胞中全部的mRNA。
DDRT-PCR操作步骤
*差异分离目的基因程序
利用两组细胞mRNA经过DDRT-PCR
后，分析比较cDNA种类的差异，分别回收 cDNA测序隆新基因。

演示文稿第五章目的基因的获取

演示文稿第五章目的基因的获取
%的mRNA时所 需要的克隆数目。
伸成完整的双链。
5’
3’
引物
Klenow片段
5’
3’
T4DNA连接酶
5’
3’
第二十四页，共103页。
三、 寡聚核苷酸化学合成的优点 1. 直接合成基因 （1）mRNA的含量很低，很难作cDNA （2）有些基因比较短，化学合成费用较低 2. 合成引物（20mer左右） 3. 合成探针序列 4. 定点突变合成 合成带有定点突变的基因片段。
率高和副反应极少等优点，已经在自动合成 仪被广泛采用。
第十七页，共103页。
3、亚磷酸三酯法
(1)脱二苯甲基保护基 加入ZnBr2或二氯乙酸，脱去4，4—二 对甲氧基三苯甲基，释放出与载体相连的寡聚核苷酸单体1上的 5’—OH。
(2)活化新的碱基 核苷酸单体2 的3’端的二异丙基亚磷酸酰上的磷酸 的OH用β-氰乙基或甲基保护，准备和前一个碱基进行反应。
G f
N=
4.61×
G f
G：Genome大小；f：fragment大小
例如：人的基因组是 3×109 bp，插入DNA片 段的平均长度如果是1.7×104 bp
N= 4.61×
G f
=
4.61×
3×109
1.7×104
= 8.1×105
第三十RNA为模板逆转录出的DNA称cDNA。
3’
mRNA
5’
5’ 引物 cDNA 反转录酶
3’
2. cDNA library
利用某种生物的总mRNA合成cDNA，再将这 些cDNA与载体连接，转入细菌细胞中进行保 存和扩增，称cDNA。第三十五页，共103页。
3. cDNA的特点 （1）不含内含子序列。 （2）可以在细菌中直接表达。 （3）包含性内切酶粘性末端片段。
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（2）5’端磷酸化 用T4多核苷酸激酶使各个片段的5’端带上磷酸。 （合成的DNA单链的5’端是-OH）
（3）连接酶连成完整双链
T4多核苷酸激酶
使5’-OH磷酸化
T4 DNA连接酶 完整的DNA双链
2. 互补延伸连接法
预先设计的片断之间有局部互补区，可以相互作为另一个片断延长的引物，用DNA聚合酶 延伸成完整的双链。
5. 合成人工接头或衔接物 含有各种酶切位点人工接头（Adaptor）或衔接物（Linker）序列。
EcoRI
Adaptor
EcoRI
Linker
DNA合成仪
第三library）
将某种生物细胞的整个基因组DNA切割成大小合适的片断，并将所有这些片断都与适当 的载体连接，引入相应的宿主细胞中保存和扩增。
cosmid载体： 容量为 50 kb
YAC：
容量为 1 Mb
BAC:
容量为 300 kb3. 基因构建的一般步骤 （1）染色体DNA大片段的制备 断点完全随机，片断长度合适于载体连接。不能用一般的限制性内切酶消化法。
① 物理切割法： 超声波（300bp）或机械搅拌（8kb）。
② 酶切法： 内切酶Sau3A进行局部消化。可得到10-30kb的随机片断。
为模板逆转录出的DNA称cDNA。
3’
mRNA
5’
5’ 引物
cDNA
反转录酶 3’
2. cDNA library
利用某种生物的总mRNA合成cDNA，再将这些cDNA与载体连接，转载体能够容载体的要求 载体容量越大，所要求的DNA片断数目越少，所需的重组子越少。
（2）目前常用的载体
载体系列： 容量为 24 kp
1976年H.G. Khorana提出了用化学方法合成基因的设想，并于1979年在science上发表 了率先成功地合成大肠杆菌酪氨酸tRNA基因的论文。
一、目前常用的方法 磷酸二酯法、 亚磷酸三酯法、 自动化合成法。
磷酸三酯法、 固相合成法
1. 磷酸二酯法 （1）原理 ① 保护dNTP的5’端P 或3’端-OH 保证合成反应的定向进行。 ② 带保护的单核苷酸连接 带5’保护的单核苷酸与带3’保护的另一个单核苷酸以磷酸二酯键连接起来。
5’ 5’ 5’
Klenow片段 T4DNA连接酶
3’ 引物
3’
3’
三、 寡聚核苷酸化学合成的优点 1. 直接合成基因 （1）mRNA的含量很低，很难作cDNA （2）有些基因比较短，化学合成费用较低 2. 合成引物（20mer左右） 3. 合成探针序列 4. 定点突变合成 合成带有定点突变的基因片断。
2）6bp的内切酶 平均每46（4096）bp一个切点。
② 内切酶粘性末端 能与常用克隆位点相连。 （Sau3A—BamH I）
2. 机械切割法 （1）超声波 超声波强烈作用于DNA，可使其断裂成约300bp的随机片断。
（2）高速搅拌 1500转/分下搅拌30min，可产生约8kb的随机片断。
第二节 化学合成目的基因
是目前通用的合成方法。 15
固相磷酸三酯合成过程 C
固相支持物
固相 支持物
固相 支持物
结果是全保护的DNA：5’ DMT, 3’固相支持物, 核苷酸之间对氯苯。最后脱保护
二、 化学合成DNA片断的组装 化学合成的DNA片断一般在200bp以内。
1. 互补连接法 （1）互补配对 预先设计合成的片断之间都有互补区域，不同片断之间的互补区域能形成有 断点的完整双链。
BamH I
BamH I
BamH I
gene
二、随机片断化 1. 限制性内切酶局部消化法 控制内切酶的用量和消化时间，使基因组中的酶切位点只有一部分被随机切开。
（1）限制性内切酶的选用原则 ① 内切酶识别位点的碱基数 影响所切出256）bp一个切点。 随机程度高。如HaeⅢ、AluI、Sau3A。
末端转移酶
粘性末端
CCC 粘A时所需要的克隆数目。
ln (1-p) Nf: 插入载体的DNA片断的平均长度占整个基因
组DNA的百分数
N：所需的重组载体数（克隆数）
ln (1-p)
N= ln (1-f)
ln (1-99%)
= ln (1-f)
G
N=
4.61×
f
G = 4.61×
f
G：Genome大小；f：fragment大小
例如：人的基因组是 3×109 bp，插入DNA片断的平均长度如果是1.7×104 bp
N= 4.61×
G = 4.61× f
3×109 1.7×104
③ 用酸或碱的脱保护
（2）合成过程 下一个5’端保护的单核苷酸又可以同3’端保护的二核苷酸聚合。
2. 磷酸三酯法
原理与磷酸二酯法一样。只是参加反应的单核苷酸都是在3’端磷酸和5’-OH上都先连接了 一个保护基团。
合成的二核苷酸连接处有三个酯键！
固相磷酸三酯合成法 将第一个核苷酸的3’-OH端固定在固相支持物上。
（2）载体与基因组DNA大片段的连接 直接连接、人工接头或同聚物加尾。
① 粘性末端直接连接 载体与外源DNA大片段的两个末端都有相同的粘性末端。
如：Sau3A与BamHI的酶切末端。
②人工接头法（adapter） 人工合成的限制性内切酶粘性末端片断。
各种酶的接头可以向公司定做或购买。
接上人工接头 ③ 同聚物加尾
第五章目的基因的获取
第四章 目的基因的获取
目的基因： 准备要分离、改造、扩增或表达的基因。
第一节 基因组DNA片断化 一、限制性内切酶法
用限制性内切酶把基因组DNA切成不同大小的片断。
酶切
1. 优点 由于带有粘性末端，产物可以直接与载体连接。
2. 缺点 目的基因内部也可能有该内切酶的切点。目的基因也被切成碎片！