第5章 目的基因克隆

第五章分子生物学的研究方法（上）西南大学生命科学学院09级XX(仅代表个人观点)1，哪些重要的科学发现和实验推动了DNA重组技术的产生和发展？答：1，确定遗传信息的携带者是DNA而不是蛋白质；2，DNA的双螺旋结构模型和半保留复制机制的提出；3，中心法则，操纵子学说的提出和密码子的破译；4，重组工具酶的发现；5，运载体重组质粒的发现。

2，如何理解PCR扩增的原理和过程。

答：原理：DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。

因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，并设计引物做启动子，加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。

过程：1，变性，将DNA在临近沸点的温度下加热使变性，双链打开；2，退火，引物与模版的相结合；3，链的延伸，DNA合成。

3，简述定量PCR的原理和过程。

答：实时定量PCR反应在带透明盖的塑料小管中进行，激发光可以直接头孤傲管盖，使其中的荧光探针被激发。

一逛探针事先混合在PCR反应液中，只有与DNA 结合之后，才能被激发发出荧光。

随着新和成DNA片段的增加，结合到DNA上的荧光探针，即被激发产生的荧光增加。

4，基因组DNA文库和cDNA文库在构建原理和用途上的主要区别是什么？答：基因组DNA是把某种生物的基因组DNA切成适当大小，分别与载体结合，导入微生物细胞形成克隆。

应用：主要用于基因组作图、测序和克隆序列的对比。

cDNA文库是以mRNA为模版反转录而成的序列，与适当的载体（常用噬菌体或质粒载体）连接后转化受体菌，则每个细菌含有一段cDNA，并能繁殖扩增。

应用：筛选目的基因、大规模测序、金银芯片杂交等功能基因组学的研究。

5，基因克隆的方法主要有哪几种？简述各种方法的作用和用途。

答：1，RACE技术，用于在已知cDNA序列的基础上克隆5’端和3’端缺失的序列；2，应用cDNA差示分析法克隆基因，在没有任何探针的情况下，通过降低cDNA群体复杂性和更换cDAN两端接头的方法特异性的扩增目的基因片段。

《基因工程》思考题第一章绪论1. 简述基因操作、基因重组和基因工程的关系。

2. 为什么说基因工程是生物学和遗传学发展的必然产物？3. 简述基因的结构组成对基因操作的影响。

4. 谈谈你对gene的认识，并简要说说gene概念的演变过程.5. 如何理解gene及其产物的共线性和非共线性？6. 试从理论和技术两个方面谈Gene Engineering诞生的基础.第二章基因工程的基本原理与支撑技术1. 试比较原核基因组与真核基因组的结构和功能特点2. 试比较原核基因和真核基因表达调控的主要方式和特点3. 分析比较琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳的异同点？4. 琼脂糖凝胶电泳中，简述影响DNA在凝胶中迁移速率的因素.5. 小量制备质粒DNA，用质粒中特定的酶切发现切割不动，试分析可能原因及克服方法？6. 在基因操作实践中有哪些检测核酸和蛋白质分子量的常规方法？7. 印迹分子杂交有哪些种类，并说明在什么情况下需要使用这些方法。

8. 核酸分子的标记有哪些方法，各有何特点？9. 由mRNA反转录成cDNA和DNA的PCR扩增是两个完全不同的酶催化反应过程，如何将两个过程联系在一起，实现由mRNA起始扩增出DNA？10. Primer是PCR反应体系的四大要素之一，PCR的许多应用都是通过primer设计来实现的，请问primer设计的一般原则是什么？11. 在PCR反应的后期，或者循环次数过多时，反应体系中就会出现一种所谓的平台效应（Plateau effect），请问什么叫Plateau effect？产生Plateau effect的原因有哪些？12. 在对PCR产物进行电泳检测时，有时会出现拖带或非特异性扩增条带，请分析其原因？如果检测结果是看不到DNA带或DNA带很弱，那又是为什么？13. 通过双向蛋白质电泳发现某蛋白质与某植物的一种表型密切相关，若要利用编码该蛋白质的基因来转基因植物，试问如何分离得到该基因？14. 现有一序列已知的DNA片段和一序列未知的DNA片段，你分别如何设计测序策略？15. 设想一下在什么情况下你希望知道一个基因或一段DNA的序列？16. 什么叫有性PCR？有性PCR导致DNA重组的分子机制跟体内重组有何异同？17. Explain the PCR. List the steps in carrying it out; include all the components and special conditions, explaining why each one is used. Illustrate the process with appropriate labels. Use the correct scientific terminology in your explanation.第三章基因工程操作的基本条件1. 试指出影响限制性内切核酸酶（Restriction endonuclease）切割效率的因素.2. 在酶切缓冲液中，一般需加入BSA，请问加入BSA的作用是什么？并简述其原理？3. 何谓Star activity？简述Star activity的影响因素及克服方法.4. 某DNA序列中存在DpnI酶切位点，以此DNA为模板，在体外合成DNA序列，当用该酶进行酶切时，发现切割不动，试分析可能原因？5. 天然的质粒载体（plasmid vectors）通常需经改造后才能应用，包括去除不必要的片段，引入多克隆位点等。

分子生物学第五章分子生物学研究法（上）——DNA、RNA及蛋白质操作技术第三节RNA操作技术第四节SNP的理论与应用第五节基因克隆技术第六节蛋白质组与蛋白质组学技术夏玉琼2013-10-10目录RNA操作技术cDNA文库的构建基因文库的筛选SNP的理论与应用基因克隆技术蛋白质与蛋白质组学技术分子生物学 夏玉琼 西安电子科技大学cDNA文库的构建切割位点用四碱基特异性的限制性内切酶部分消化DNA 片段，有的仍有切割位点质粒DNA将DNA 克隆进质粒DNA细菌克隆每个细菌都带有不同片段的DNA细菌转化分子生物学 夏玉琼 西安电子科技大学cDNA文库的构建cDNA的长度0.5-8 kb载体：质粒载体和噬菌体类载体完整的cDNA文库包含大于5*105的独立克隆分子生物学 夏玉琼 西安电子科技大学目录RNA操作技术cDNA文库的构建基因文库的筛选SNP的理论与应用基因克隆技术蛋白质与蛋白质组学技术分子生物学 夏玉琼 西安电子科技大学基因文库的筛选含义通过某种特殊方法从基因文库中鉴定出含有所需重组DNA分子的特定克隆的过程筛选方法核酸杂交法PCR筛选法免疫筛选法分子生物学 夏玉琼 西安电子科技大学核酸杂交法培养基上的菌落盖上硝酸纤维素膜移去硝酸纤维素膜裂解、中和去除细菌蛋白DNA 印迹32P 标记探针杂交放射自显影图像挑出阳性克隆保存母板分子生物学 夏玉琼 西安电子科技大学PCR筛选法需获得基因特异性引物将整个基因文库保存在多孔培养板上用设计好的基因探针对每个孔PCR筛选，挑出阳性的孔对阳性的孔再稀释到次级多孔板中PCR筛选重复稀释重复筛选直到与目的基因对应的单个克隆分子生物学 夏玉琼 西安电子科技大学免疫筛选法文库铺于E.coli 形成噬菌斑转移到硝酸纤维素膜吸收λ噬菌体中表达的外源蛋白保存原板，加入一抗筛选膜上的噬菌斑印迹洗去未结合的抗体加入酶偶联的二抗加底物显色从保存板上挑出阳性噬菌斑一抗：第一抗体，识别目标蛋白二抗：抗体的抗体，能增强信号，增加该方法的灵活性分子生物学 夏玉琼 西安电子科技大学目录RNA操作技术SNP的理论与应用SNP概述SNP的检测技术SNP的应用基因克隆技术蛋白质与蛋白质组学技术分子生物学 夏玉琼 西安电子科技大学SNP概述single nucleotide polymorphism,pronounced “snips”单核苷酸多态性基因组DNA序列中由于单个核苷酸的突变而引起的多态性，发生频率1%或更高例如：某些人的染色体上的某个位置为A，而另外一些人的同样位置是T，染色体DNA同一位置上的每个碱基类型叫做一个等位位点继RFLP和SSR之后的第三代遗传标记遗传标记：在遗传分析上用作标记的基因分子生物学 夏玉琼 西安电子科技大学第一代遗传标记：RFLPRFLP标记是发展最早的DNA标记技术。

同源序列法克隆目的基因-回复同源序列法克隆目的基因，是一种通过引入同源序列来克隆特定目的基因的方法。

在这篇文章中，我们将逐步回答什么是同源序列法克隆目的基因，为什么使用同源序列法克隆目的基因，以及如何利用这种方法来克隆目的基因。

一、什么是同源序列法克隆目的基因同源序列法克隆目的基因是一种利用已知的同源序列来寻找和克隆特定目的基因的方法。

同源序列指的是在不同物种或同一物种中不同基因间具有部分相似性的DNA序列。

这些同源序列在进化过程中保留下来，其存在可以起到指导相同或类似基因的功能和表达的作用。

因此，通过利用已知的同源序列，研究人员可以迅速准确地寻找并克隆目的基因。

二、为什么使用同源序列法克隆目的基因1. 提高克隆效率：同源序列法可以利用已知的同源序列来辅助基因寻找和克隆，大大提高了克隆的效率。

相比于传统的克隆方法，同源序列法可以节省大量的时间和实验成本。

2. 降低错误率：由于同源序列在不同物种或同一物种中不同基因间具有部分相似性，利用同源序列进行克隆可以降低基因寻找的错误率。

同源序列可以帮助确定目的基因的大致位置，并提供设计引物和克隆步骤的依据，从而减少寻找目的基因过程中可能出现的错误。

3. 拓宽研究领域：同源序列法可以跨物种进行基因克隆，使得研究人员可以从其他物种中寻找和克隆目的基因。

这种方法可以为研究人员提供更多资源，丰富研究内容，拓宽研究领域。

三、如何利用同源序列法克隆目的基因1. 寻找同源序列：首先，研究人员需要确定目的基因所在的物种，然后在已知的同源序列数据库中寻找与目的基因相似或相关的同源序列。

常用的数据库包括GenBank、EMBL和DDBJ等。

2. 序列比对和分析：将寻找到的同源序列与目的基因的参考序列进行序列比对和分析，确定相似性和相关性的程度。

根据比对结果，可以选择最相似或相关的同源序列作为目的基因的起始点。

3. 引物设计：根据已选择的同源序列，在目的基因的起始点和末端设计引物，以便进行PCR扩增。

第一章基因工程概述一、名词解释基因：编码产生蛋白质或RNA等具有特定功能产物的一段具有遗传效应的DNA片段，是控制生物性状的基本遗传单位。

基因操作：基因操作是指对基因进行分离、分析、改造、重组、转移、检测和表达等操作的总称。

基因工程：专指为实践应用而进行的基因重组事件，具体指通过基因操作来定向改变或修饰生物体，并具有明确目的的活动。

重组DNA技术：基因重组是指将一种生物（供体）的基因（DNA片段）与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之稳定遗传并表达出新产物或新性状的DNA体外操作程序。

二、思考题1、简述基因工程操作的基本步骤。

2、简述基因工程操作的理论依据。

（1）基因具有相同的物质基础（2）基因是可切割和粘合的（3）基因是可转移的（4）多肽与基因之间有对应关系（5）遗传密码通用（6）基因可以复制遗传3、简述基因工程诞生理论上的三大发现和技术上的三大发明。

理论上的三大发现: 遗传物质是DNA（基因） DNA的双螺旋结构和半保留复制中心法则和氨基酸密码子技术上的三大发明：限制性核酸内切酶 DNA连接酶质粒和病毒第二章基因工程的工具酶一、名词解释限制性内切酶：是一类能识别双链DNA分子内部某种特殊的核苷酸序列，并使每个核酸链上特定部位相邻的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开的一类核酸内切酶。

同裂酶：指来源不同，但识别相同靶序列，切割产生不同或相同末端的限制性内切酶。

即不同来源的限制性内切酶可切割相同的序列。

同尾酶：指来源各异，识别靶序列各不相同，但切割产生相同末端的限制性内切酶。

同尾酶切割DNA得到的产物可进行互补连接。

DNA连接酶：催化DNA片段两侧（相邻）核苷酸的3'羟基（-OH）和5'磷酸基（-P）之间形成磷酸二酯键，使断开的DNA连接起来的酶。

DNA聚合酶：催化DNA合成的酶逆转录酶：依赖RNA的DNA聚合酶二、思考题1、简述限制性内切酶命名的基本原则。

属名+种名+株号+序号第一个字母：取宿主属名首字母，大写斜体。

分子生物学第五章作业1、哪些重要的科学发现和实验推动了DNA重组技术的产生及发展？答：近半个世纪来，分子生物学主要取得了三大成就：第一，20世纪40年代确定了遗传信息的携带者，即基因的分子载体是DNA而不是蛋白质，解决了遗传的物质基础问题；第二，50年代提示了DNA分子的双螺旋结构模型和半保留复制机制,解决了基因的自我复制和世代交替问题；第三，50年代末至60年代，相继提出了“中心法则”和操纵子学说,成功地破译了遗传密码，充分认识了遗传信息的流动和表达。

但事实上，DNA分子体外切割与连接技术及核苷酸序列分析技术的进步直接推动了重组DNA技术的产生和发展。

其中，限制性内切核酸酶和DNA连接酶等工具酶的发现和应用是现代生物工程技术史上最重要的事件。

DNA重组技术的产生及发展过程中比较重要的科学发现和实验如下：1957年A.Kornberg从大肠杆菌中发现了DNA聚合酶I。

1965年S. W. Holley完成了酵母丙氨酸tRNA的全序列测定；科学家证明细菌的抗药性通常由"质粒"DNA所决定。

1967年年世界上有五个实验室几乎同时宣布发现了DNA连接酶。

1970 年H.O.Smith，K.W.Wilcox和T.J.Kelley分离了第一种限制性核酸内切酶。

H.M.Temin和D.Baltimore从RNA肿瘤病毒中发现反转录酶。

1972-1973 年H.Boyer，P.Berg等人发展了DNA重组技术，于72年获得第一个重组DNA分子，73年完成第一例细菌基因克隆。

1978 年首次在大肠杆菌中生产由人工合成基因表达的人脑激素和人胰岛素。

1981 年R. D. Palmiter和R. L. Brinster获得转基因小鼠；A. C. Spradling和G. M. Rubin得到转基因果蝇。

1982 年美、英批准使用第一例基因工程药物--胰岛素；Sanger等人完成了入噬菌体48,502bp全序列测定。